Tesis de doctorado--Sagrada teología, especialización mariología--Roma--Pontificia facultas theologica Marianum, 1993. / Présentation en italien. Bibliogr. p. 36-43. Index.

La transmission des messages douloureux depuis les nocicepteurs périphériques jusqu’aux structures supraspinales est sous le contrôle de systèmes modulateurs, parmi lesquels figurent les voies bulbo-spinales sérotoninergiques. Cependant leur rôle n’est pas complètement élucidé puisque selon le type de récepteur sérotoninergique mis en jeu, elles pourraient soit réduire la sensation douloureuse soit au contraire l’exacerber. De plus, le contrôle exercé par la sérotonine (5 HT) pourrait dépendre du type de douleur, aiguë, inflammatoire ou neuropathique chronique. En réalité, ces ambiguïtés tiennent au fait que les études réalisées jusqu’à présent ont surtout impliqué des approches pharmacologiques souvent peu fiables. Ce constat m’a conduit à mettre en œuvre une nouvelle approche expérimentale pour tenter de cerner le véritable rôle modulateur des voies sérotoninergiques bulbo-spinales sur différents types de douleur dans des conditions physiologiques normales ou physiopathologiques chez le rat. A cette fin, j’ai réalisé ce travail de thèse en trois étapes. La première étape a consisté à préciser les caractéristiques anatomiques des voies sérotoninergiques bulbo-spinales visualisées par un marquage antérograde (PHA-L) couplé à l’immunomarquage du transporteur de la sérotonine (SERT). L’étude différentielle des deux sous-structures de la région bulbaire B3 : le noyau raphé magnus (RMg) et le noyau paragigantocellulaire latéral (LPGi) m’a permis de montrer que les neurones sérotoninergiques qu’elles contiennent se projettent respectivement dans les couches profondes (VI-VI) et superficielles (I-II) de la corne dorsale, à tous les étages de la moelle épinière. Afin de dépléter sélectivement la 5-HT dans la corne dorsale, j’ai, dans une deuxième étape, injecté bilatéralement dans la région B3 un lentivirus recombinant LV-shTPH2 pour y éteindre l’expression de la TPH2, l’enzyme limitante de la synthèse de 5-HT. Les contrôles immunohistochimiques ont montré l’inhibition bilatérale de l’expression de la TPH2 dans le RMg et le LPGi, et la diminution de l’immunomarquage de la 5-HT sélectivement dans la corne dorsale, l’expression inchangée du transporteur SERT confirmant le maintien de l’intégrité des fibres sérotoninergiques chez les rats LV-shTPH2. L’évaluation de la sensibilité des animaux ainsi déplétés en 5-HT à différents tests validés de nociception aiguë n’a pas révélé de modifications significatives par rapport aux témoins. Mais dans des conditions de forte stimulation nociceptive thermique (50°C) ou chimique (carragénine), l’augmentation de l’immunomarquage de c-Fos dans la corne dorsale chez les rats LV-shTPH2 montre que la déplétion de 5-HT facilite la sensibilisation synaptique. Des différences encore plus nettes entre les rats LV-shTPH2 et les témoins sont surtout apparues en cas de douleur inflammatoire (formaline) ou neuropathique (ligature du nerf sciatique). Les modifications induites par la déplétion de 5-HT n’étaient cependant pas univoques puisqu’une hypoalgésie a été observée dans le cas d’une douleur inflammatoire et, qu’au contraire, l’hyperalgésie associée à la douleur neuropathique était exacerbée chez les rats LV-shTPH2. Ces modulations opposées laissant à penser l’implication de projections et/ou de récepteurs sérotoninergiques distincts, nous avons réalisé, dans une troisième étape, une étude pharmacologique qui a permis de montrer que l’effet pro-hyperalgésique observé chez les rats neuropathiques déplétés en 5-HT était probablement lié à un déficit d’activation de récepteurs 5 HT7. Notre étude démontre la réalité du contrôle physiologique du relai spinal des voies nociceptives par la 5-HT, via l’implication de projections bulbo-spinales et de récepteurs sérotoninergiques dont l’identification pourrait déboucher sur de nouvelles perspectives thérapeutiques. / The transmission of pain signals from peripheral nociceptors to supraspinal structures is under the control of modulatory systems, which include bulbo-spinal serotoninergic pathways. However, their role is not yet fully understood, as they may as well reduce or exacerbate pain as a function of 5-HT receptor types involved. Furthermore, their modulatory role might also differ depending on whether pain is acute, or chronic, with inflammatory or neuropathic origin. In fact, this ambiguous knowledge results from data essentially obtained with rather unreliable pharmacological approaches. This led me to set up an innovative experimental approach for a better assessment of the real implication of bulbo-spinal serotoninergic projections in pain control mechanisms under validated physiological and pathophysiological conditions in the rat. To this goal, I performed my PhD thesis work in three steps. The first step consisted of a precise anatomical description of bulbo-spinal serotoninergic projections identified by anterograde labeling (with PHA-L) and immunolabeling of the 5-HT transporter (SERT). The differential labeling of the two sub-areas within the B3 bulbar region : the nucleus raphé magnus (RMg) and the nucleus paragigantocellularis lateralis (LPGi) allowed the demonstration that their respective 5-HT neuron groups project separately into the deep (V-VI) and superficial (I-II) laminae of the dorsal horn, at all levels of the spinal cord. For the second step, aimed at depleting 5-HT selectively within the dorsal horn, I injected bilaterally into the B3 area a recombinant lentivirus, LV-shTPH2, designed to suppress the expression of TPH2, the rate limiting enzyme for 5-HT synthesis. Immunohistochemical controls showed that the resulting bilateral inhibition of TPH2 expression in both the RMg and the LPGi was associated with 5-HT depletion but no change in SERT (as expected of unaltered 5-HT fibers) in the dorsal horn. Using various behavioral tests, I could not detect any change in acute pain sensitivity in 5-HT-depleted rats. In contrast, the increased c-Fos immunohistochemical labeling within the dorsal horn after strong thermal (50°C) or chemical (carrageenan) noxious stimulation showed that 5-HT depletion promotes synaptic sensitization. Even more striking differences between LV-shTPH2 injected rats and paired controls were observed in case of inflammatory (formalin) or neuropathic (sciatic nerve ligation) pain. However, 5-HT depletion-induced changes differed under both conditions since hypoalgesia was noted in case of inflammatory pain, whereas neuropathic pain-evoked hyperalgesia was enhanced in 5-HT depleted, LV-shTPH2-injected rats. Because such opposite modulations might have been underlain by distinct serotoninergic pathways (i.e. from the RMg versus the LPGi for instance) and/or distinct 5-HT receptors, we decided, within the time remaining for achieving my PhD work, to perform a third step, focused on the 5-HT7 receptor type. Using pharmacological approaches, we could obtain data showing that exacerbated hyperalgesia in 5-HT-depleted neuropathic rats resulted from loss of tonic 5-HT7 receptor activation by endogenous 5-HT. Altogether, our data clearly demonstrate that bulbospinal serotoninergic projections are involved in the physiological control of pain signaling at spinal cord level. Further identification of underlying neuronal pathways and receptors might open novel therapeutic perspectives.

La question du bien-être des animaux d’élevage et plus particulièrement celle de la douleur fait l’objet d’une attente sociétale grandissante. Cependant, l’évaluation de la douleur chez l’animal, et par voie de conséquence de l’efficacité des traitements antalgiques, reste très complexe en médecine vétérinaire, en expérimentation ou en élevage. Elle s’appuie principalement sur les modifications de comportement ou de paramètres physiologiques du système nerveux autonome, de l’axe hypothalamo-hypophysaire ou encore des processus inflammatoires. Néanmoins, les indicateurs généralement utilisés ne sont pas tous spécifiques de la douleur "ressentie" par l'animal mais peuvent également indiquer un niveau de stress ou de perturbations physiologiques et métaboliques liés au traumatisme. Chez les carnivores domestiques ou les chevaux, une approche combinant des indicateurs spécifiques de chacune des voies sollicitées dans les processus douloureux a été développée. Aucune démarche équivalente n'a été validée chez les animaux de rente. Cette thèse conduite sur ovin et bovin avait pour objectifs : 1) de développer une approche multiparamétrique d'évaluation de la douleur, ou de situations potentiellement douloureuses, 2) de tester ses performances dans différentes situations considérées douloureuses (douleurs somatiques et/ou viscérale : mammites, castration et pose de canules digestives), et 3) sur la base de cette approche d’évaluer l'efficacité de protocoles antalgiques utilisés en élevage ou en expérimentation animale. Nous montrons que (i) l’approche multiparamétrique est plus performante qu’une approche voie par voie, (ii) les modifications du comportement, de l’axe hypothalamo-hypophysaire et de l’inflammation discriminent des situations potentiellement douloureuses quel que soit le type de douleur alors que les modifications liées au stress oxydant sont davantage liées aux situations présentant des douleurs d'origine viscérale et somatique, (iii) l’approche multiparamétrique différencie les périodes les plus critiques à prendre en charge en fonction de la douleur ressentie et (iv) il est possible de proposer des ajustements des traitements antalgiques en utilisant les renseignements fournis par chacune des voies évaluées. En prenant en compte l'ensemble des principales voies impliquées dans les processus douloureux, l’évaluation de la douleur ressentie, peut donc être plus sensible et spécifique. Néanmoins, l’approche multiparamétrique gagnera à être simplifiée et devra être validée dans d'autres situations douloureuses, notamment dans le cas de douleurs neuropathique, avant d'être proposée sur le terrain aux vétérinaires, éleveurs ou expérimentateurs. / There is a growing societal concern regarding farm animal welfare and especially pain assessment. However, pain assessment in animals and the efficiency of analgesic treatments remains very complex in veterinary medicine, animal experimentation or farming. Pain assessment is mainly based on behavioural changes or physiological responses related to the autonomic nervous system, hypothalamic-pituitary axis or inflammatory processes. Nevertheless, the indicators usually used do not always reflect pain experienced by animals but can also reflect the level of stress or physiological and metabolic disturbances related to trauma. Combinations of pathway-specific indicators involved in pain have been developed in various animal species (carnivore pets and horses), but no equivalent approach has been validated for farm ruminants yet. The main objectives of this thesis were 1) to develop a multiparametric approach to assess pain in sheep and cattle, 2) to test its performances in different painful situations (somatic and/or visceral pain: mastitis, castration and digestive cannulas), and 3) to assess the efficiency of analgesic treatments currently used in farming or research. We showed that (i) the multiparametric approach is more efficient than a single pathway approach (ii) changes in behaviour, hypothalamic-pituitary axis, and inflammation discriminate potentially painful situations regardless of the type of pain, whereas changes related to oxidative stress are related to visceral and somatic painful situations, (iii) the multiparametric approach differentiates the most critical periods requiring specific pain management (to be managed according to the pain), and (iv) it is possible to adjust the analgesic treatments according to the information provided by the assessment of each pathway. In conclusion, taking into account the main pathways involved in painful processes, allows a more sensitive and specific pain evaluation. Further research should aim at simplifying the multiparametric approach and validating it against other painful situation (especially neurological pain) before proposing it for practical-use on field by veterinarians, farmers and researchers.

Les douleurs abdominales, principale cause de consultation en gastroentérologie, sont souvent le reflet d’un dysfonctionnement du tractus gastro‐intestinal, parfois responsable d’un Syndrome de l’Intestin Irritable (SII) ou d’une Maladie Inflammatoire Chronique de l’Intestin (MICI). Ces deux types de pathologies ont des caractéristiques bien distinctes (inflammation sévère avec des phases de poussée et de rémission dans le cas des MICI, absentes dans le SII). Cependant elles ont aussi des caractéristiques communes comme le développement d’une hypersensibilité colique (HSC), visible pendant les phases de rémission des MICI. Cette hypersensibilité, dont la physiopathologie est encore mal connue, entraîne une altération de la qualité de vie des patients. Il paraît donc nécessaire de comprendre les mécanismes qui sous‐tendent son apparition, son développement et son maintien, afin de développer des stratégies thérapeutiques adaptées. Les canaux ioniques sont des cibles intéressantes pour cela. Deux ont particulièrement retenu notre attention : le canal ASIC3 (Acid Sensing Ion Channels), sensible à l’acidose tissulaire et impliqué dans de nombreux processus physiopathologiques douloureux et le canal calcique Cav3.2 (voltage‐gated calcium channel) impliqué dans la mécanoperception physiologique et physiopathologique. Dans une première partie, nous avons évalué le rôle des sous‐unités ASIC3 dans l’hypersensibilité colique. Pour cela, nous avons utilisé plusieurs modèles animaux mimant une hypersensibilité colique de diverses origines chez des animaux déficients pour le canal ASIC3 et leurs littermates. Le premier modèle utilisait du DSS à deux concentrations : 0.5% et 1% induisant une hypersensibilité colique respectivement sans et avec inflammation. Le deuxième modèle mimait une hypersensibilité colique induite par une infection gastro‐intestinale. Pour cela, nous avons utilisé une bactérie AIEC (Adherent Invasive Escerichia Coli) de souche LF82 anormalement présente chez les patients atteints de la maladie de Crohn. Nous avons mis en évidence que le canal ASIC3 est impliqué dans la mise en place de l’Hypersensibilité Viscérale d’origine Colique (HSVC) dans ces deux modèles, et que la délétion de cette sous‐unité entraîne une moindre inflammation colique. Dans un dernier modèle, pour déterminer si ces résultats au niveau colique étaient transposables au cas d’une hypersensibilté viscérale d’origine différente, nous avons choisi un modèle de cystite pour lequel nous n’avons pas pu mettre en évidence une implication de la sous‐unité ASIC3. Dans une deuxième partie, nous avons travaillé sur le canal calcique Cav3.2, déjà étudié au laboratoire, et qui n’avait pas montré d’implication dans les douleurs viscérales inflammatoires. Son implication dans l’HSC non inflammatoire a été étudiée à travers deux modèles : le modèle de DSS 0.5% et le modèle de séparation maternelle. Une absence d’hypersensibilité chez les animaux déficients pour ce canal a été mise en évidence, et nous avons trouvé une implication de ce canal calcique chez des patients atteints du SII. La dernière partie de ce travail s’est intéressée à une nouvelle cible pouvant être impliquée dans la perception des stimuli mécaniques au niveau colique, le facteur de transcription EGR‐4. Ce facteur de transcription appartient à la famille des protéines en doigts de zinc et est extrêmement conservé entre les êtres vivants ; il est impliqué dans de nombreuses cascades de signalisations cellulaires. Une équipe clermontoise a montré son implication dans la mécanoperception chez la plante. Nous avons donc voulu savoir si cette implication était transposable à la souris et nos travaux se sont alors concentrés sur le côlon et sur l’implication de ce facteur lors d’une stimulation mécanique. Il est principalement exprimé au niveau des cellules musculaires lisses et est surexprimé au niveau du côlon dans le cas d’une stimulation mécanique. / Abdominal pain is one of the most common gastrointestinal disorder which accounts for the majority ofconsultations in general practice and half of those in gastroenterology. They often reflect a dysfunction ofthe gastrointestinal tract may be responsible for irritable bowel syndrome (IBS) or chronic inflammatorybowel disease (IBD). Despite significant differences particularly illustrated by a severe inflammatoryphenomenon associated with IBD which is not observed in IBS, these pathologies share colonichypersensitivity (CHS) as a common feature. This hypersensitivity whose pathophysiology is still poorlyunderstood, results in impaired quality of life of patients. It therefore seems necessary to be able tounderstand the mechanisms that underlie the emergence, development and maintenance of the HSC todevelop appropriate therapeutic strategies. Ion channels are attractive targets because of their critical role insynaptic transmission of sensory information. Two of them in particular caught our attention: ASIC3 channel(Acid Sensing Ion Channels), sensitive to tissue acidosis and involved in many pathophysiological processesand painful calcium channel Cav3.2 (voltage‐gated calcium channel) involved in the physiologic andpathophysiologic mechanoperception.In the first part, we evaluated the role of ASIC3 subnits in colonic hypersensitivity. For this, we used severalanimal models mimicking colonic hypersensitivity of different origins in deficient animals for ASIC3 and theirlittermates. The first model using the DSS at two concentrations: 0.5% and 1% respectively inducing colonichypersensitivity with and without inflammation. The second model mimicking colonic hypersensitivityinduced gastrointestinal infection. For this, we used a AIEC bacteria (Adherent‐Invasive Escerichia Coli) ofLF82 strain abnormally present in patients with Crohn's disease. We were able to show that the ASIC3channel is involved in the establishment of the original Visceral Hypersensitivity Colic (HSVC) found in thesetwo models. We were also able to show that the deletion of this channel leads to lower colonic inflammationin our animals. Then, we evaluated its involvement in a cystitis model and found that this channel was notinvolved in this type of pain or in the resulting inflammation.In the second part, we worked on the calcium channel Cav3.2. This channel already studied in the laboratoryhad shown no involvement in visceral inflammatory pain, we observed his involvement in thenoninflammatory colonic hypersensitivity through two models: the DSS model 0.5% and the maternalseparation model. We were able to demonstrate a lack of hypersensitivity in animals deficient for thischannel. In addition, we found an involvement of this calcium channel in patients IBS, resulting in increasedexpression in these patients compared to control patients.The aim of this third part is to determine the EGR‐4 localization and its involvement in the mouse colonsensitivity to a mechanical stimulus. For that purpose, wild‐type and healthy mice were subjected or not to acolorectal distension (mechanical stimulus) for 10 seconds via inflation of a balloon inserted at 1cm from theanal margin. Then, we analyzed the expression of EGR‐4 at different time points after the distension at themRNA level in the colon, dorsal root ganglia (DRG) and spinal cord by quantitative RT‐PCR and its cellularlocalization in DRG, and in colon after whole‐mount dissection, by immunohistochemistry. We also identified targeted genes of this transcription factor in mouse colonic epithelial cells transfected by an EGR‐4expressing vector after microarray analysis. EGR‐4 transcription factor is localized in the colon, DRG andspinal cord cells. In addition, its expression is modified after colorectal distension in a time dependentmanner.

Les douleurs neuropathiques, caractérisées par une prévalence élevée, résultent de la compression ou lésion de nerfs. Les antidépresseurs figurent parmi les traitements de première intention de cette pathologie, toutefois des besoins médicaux restent insatisfaits par ces molécules. Mon travail de thèse s'est intéressé à la connexine 43 (Cx43) astrocytaire impliquée dans le mécanisme d'action des antidépresseurs ainsi que dans les douleurs neuropathiques. La première partie des travaux, réalisée avec des cultures d'astrocytes corticaux de souris, a permis de préciser le lien entre les antidépresseurs et la Cx43 astrocytaire. Alors que son expression s'est avérée inchangée dans notre modèle, un effet hétérogène des antidépresseurs a été observé sur le couplage intercellulaire des astrocytes. L'ensemble des molécules testées a conduit à l'inhibition de l'ouverture des hémicanaux de Cx43 étudiée dans un contexte inflammatoire, notre étude est la première à rapporter cet effet. De plus, les antidépresseurs prescrits dans les douleurs neuropathiques ont induit l'inhibition du couplage et/ou des hémicanaux. La seconde partie de mes travaux a porté sur la combinaison entre l'amitriptyline et la méfloquine. Ceci repose sur les approches combinatoires proposées par Theranexus, start-up avec qui la thèse a été réalisée. Les deux molécules ont présenté une synergie d'effet sur la réduction du couplage astrocytaire in vitro corrélée a une potentialisation de l'action anti-hyperalgésique de l'amitriptyline in vivo, chez le rat lésé au niveau du nerf sciatique. Ces résultats valident l'implication de la Cx43 astrocytaire dans la réponse antinociceptive des antidépresseurs. / Neuropathic pain, characterised by a marked prevalence, is the consequence of nerve compression or lesion. Antidepressants represent the main treatments of this disease, however, medical needs remain mostly unsatisfied by these molecules. In order to improve this therapeutical approach, my thesis work has focussed on astroglial connexin 43 (Cx43) that has recently been involved in the mechanism of action of antidepressant as well as in neuropathic pain. The first part of my work, performed in primary cultures of mouse cortical astrocytes, has allowed to reinforce the link between antidepressants and Cx43 in astrocytes. Whereas its expression was unchanged in our model, an heterogeneous effect of antidepressants was observed on the intercellular communication of astrocytes. Furthermore, all tested molecules led to the inhibition of Cx43 hemichannel activity in an inflammatory context, our study is the first to report such effect. Interestingly, antidepressants prescribed in neuropathic pain induced inhibition of coupling and/or hemichannels. The second part of my work concerned the combination between amitriptyline and mefloquine. This is based on combinatorial approaches proposed by Theranexus, a start-up partner in this project. The association of the two molecules presented a synergy on astroglial coupling reduction in vitro correlated to a potentiation of the anti-hyperalgesic effect of amitriptyline in vivo, in rats with injured sciatic nerve. These results confirm the implication of the astroglial Cx43 in the antinociceptive response to antidepressants.

De nombreuses données cliniques et expérimentales suggèrent l'existence de liens importants entre thermoception et nociception. Il a par exemple été montré que la qualité de la sensation douloureuse chez des patients souffrant de douleurs centrales dépend de l’intégrité des voies de la thermoception. Sur la base de ces données, il a été suggéré que ces douleurs pourraient être liées à une réduction de l'inhibition normalement exercée par les systèmes thermoceptifs sur les systèmes nociceptifs et, de façon plus générale, que la douleur pourrait être un constituant du système homéostasique. Pour valider ces hypothèses, nous avons conduit 2 études chez des volontaires sains durant lesquelles nous avons utilisé une grille thermique comme test de douleur. Le contact cutané avec cette grille provoque 2 sensations à type de brûlures: la chaleur paradoxale (CP) et la douleur paradoxale (DP). Dans une 1ère étude, nous avons recherché si ces 2 sensations étaient distinctes ou s'il existait un continuum. En étudiant plusieurs dizaines de combinaisons thermiques chez des volontaires, nous avons retrouvé que l’apparition de la CP précédait systématiquement celle de la DP, et que l’intensité de la CP augmentait progressivement jusqu’à l’apparition de la DP. Nos résultats indiquent qu’il existe une continuité entre les 2 sensations paradoxales et, par voie de conséquence, confirment l'existence de liens forts entre nociception et thermoception. Dans une seconde étude, nous avons évalué l’impact d’un challenge thermique (chaud et froid) sur le seuil d’apparition de la DP chez 15 volontaires. La mise en jeu de la thermorégulation par un réchauffement actif a été associée à une élévation du seuil d’apparition de la DP. Une relation directe a été retrouvée entre la variation de la température corporelle et le seuil de DP. L’existence d’un impact des challenges thermiques sur le seuil d’apparition de la DP suggère un lien entre douleur et thermorégulation. Nos résultats tendent à confirmer que la douleur a une dimension homéostasique. / Numerous experimental and clinical data suggest the existence of a strong relationship between thermoception and nociception. For example, it has been shown that the pain quality in patients suffering from central pain depends on the integrity of the thermal sensation pathway. Based on these data, some authors have suggested that this kind of pain could be related to a reduction of the inhibition physiologically exerted by thermoception on nociception, and, by extension, that pain could be a part of homeostasis. To validate this hypothesis, we conducted 2 studies in healthy volunteers using a thermal grill as experimental pain test. A cutaneous contact with the grill induces two burning sensations: paradoxical heat (PH) and paradoxical pain (PP). In a first study, we studied if there is a continuum or not between these 2 sensations. By studying decades of thermal combinations in volunteers, we found that PH systematically occurred before PP and that PH intensity gradually increased until PP appearance. Our results indicate a continuum between these two paradoxical sensations and, therefore, confirm the existence of a strong link between nociception and thermoception. In a second study, we estimated the impact of a thermal challenge (warm and cold) on the PP appearance threshold in 15 volunteers. The thermoregulation involvement by active warming was associated to an increase of PP threshold. A correlation was found between body temperature variations and PP threshold. The existence of an impact of thermal challenges on the PP threshold suggests a link between pain and thermoregulation. Our results tend to confirm that pain possesses a homeostatic dimension.

La douleur chronique est une pathologie invalidante de longue durée notamment caractériséepar trois symptômes : l’allodynie (un stimulus non douloureux est perçu comme douloureux),l’hyperalgésie (un stimulus douloureux est perçu comme encore plus douloureux) et desdouleurs ambulatoires. Quand cette douleur est due à une lésion ou une dysfonction du systèmenerveux on parle de douleur neuropathique. Chez les patients et les modèles animaux dedouleurs neuropathiques, les études ont montré que les neurones thalamiques étaienthyperexcitables. Les cellules gliales, astrocytes et microglies, sont des partenaires synaptiquesimpliqués dans la transmission et la plasticité synaptique et pourraient être impliqués dans cephénomène. En effet, ces cellules peuvent modifier leur phénotype lorsque le système nerveuxest affecté, elles sont réactives : leur morphologie est hypertrophiée, l’expression d’ARNm et deprotéines comme iba-1 (ionized binding-adaptor molecule 1) et CD11b/c (cluster ofdifferentiation 11b/c) pour les cellules microgliales et GFAP (glial fibrillary acidic protein) etS100β (S100 calcium binding protein β) pour les cellules astrocytaires est augmentée. Ellespeuvent également libérer des molécules pro-inflammatoires. Tout ceci pourrait générer ouamplifier l’hyperexcitabilité des neurones présents dans le thalamus.Mon travail de thèse a consisté en l’étude des astrocytes et de la microglie thalamique dans lemodèle de douleurs neuropathiques de ligature des nerfs spinaux L5-L6 du nerf sciatique (spinalnerve ligation, SNL). Les symptômes d’allodynie et d’hyperalgésie mécaniques ont étécaractérisés par le test des filaments de von Frey et les douleurs ambulatoires par le test dedistribution pondéral dynamique. L’expression des ARNm de marqueurs gliaux a été étudiée parune approche de qRT-PCR sur des prélèvements thalamiques et sur des noyaux thalamiquesobtenus par microdissection au laser. L’expression neurochimique des marqueurs iba-1,CD11b/c, Cathepsine S, GFAP et S100β a été étudié par immunohistofluorescence en quantifiantle nombre de cellules immunopositives et la surface occupée par les marqueurs. Toutes cesexpériences ont été réalisées à J14 et J28 après la chirurgie.A J14, les animaux SNL développent des symptômes d’allodynie et d’hyperalgésie mécaniqueainsi que des douleurs ambulatoires. Chez ces animaux, les cellules microgliales thalamiquesprésentent des signes de réactivité avec l’augmentation de l’expression des ARNm desmarqueurs CTSS et CX3CR1, le récepteur de la fractalkine, marqueurs connus pour leursimplications dans l’hyperexcitabilité neuronale spinale en conditions de douleursneuropathiques. De plus, l’expression neurochimique des marqueurs gliaux étudiés est diminuéece qui se traduit notamment par une diminution du nombre de cellules immunopositives pources marqueurs chez les animaux SNL. A J28, les symptômes douloureux sont maintenus. De plus,la réactivité microgliale décelée à J14 par qRT-PCR est toujours présente avec l’augmentation del’expression de l’ARNm codant pour la fractalkine (CX3CL1), partenaire de la voieCTSS/CX3CR1/CX3CL1. La diminution de l’expression neurochimique thalamique desmarqueurs gliaux chez les animaux SNL était transitoire et n’est plus présente à J28. Enrevanche, des signes de réactivité astrocytaire thalamique ont été mis en évidence chez lesanimaux SNL.Ainsi, ce travail dévoile une ambivalence au niveau des altérations de la glie thalamique dans cemodèle SNL: une diminution précoce de l’expression des marqueurs gliaux thalamiques suivied’une réactivité astrocytaire plus tardive concomitante à des signes de réactivité microgliale. Denombreuses expériences sont encore nécessaires pour appréhender l’impact de cetteambivalence gliale thalamique inédite dans un contexte de douleur neuropathique. / Chronic pain is an incapacitating and long lasting pathology mainly characterized by threesymptoms: allodynia (a non painful stimulus is perceived as painful), hyperalgesia (a painfulstimulus is perceived as more painful) and ambulatory pains. When chronic pain is due to alesion or dysfunction of nervous system it is called neuropathic pain. In both patients and animalmodels of neuropathic pain, researchers found that thalamic neurons are hyperexcitable. Glialcells, astrocytes and microglia, are strong synaptic partners involved in synaptic transmissionand plasticity and therefore could be involved in this phenomenon. Indeed, these cells canmodify their phenotype when nervous system is damaged. They become reactive: theirmorphology is hypertrophied, mRNA and protein expression of iba-1 (ionized binding-adaptormolecule 1) and CD11b/c (cluster of differentiation 11b/c) for microglia and GFAP (glialfibrillary acidic protein) and S100β (S100 calcium binding protein β) for astrocytes is increased.They could also release pro-inflammatory molecules. All of these could contribute to generate oramplify the thalamic neuronal hyperexcitability.In my PhD work I studied thalamic astrocytes and microglia in a rat neuropathic pain model ofL5-L6 spinal nerves ligation (SNL). Mechanical allodynia and hyperalgesia were characterizedwith von Frey filament test and ambulatory pain with dynamic weight bearing apparatus. mRNAexpression of glial markers were studied with qRT-PCR technique on thalamic punches andlaser-microdissected nuclei. Neurochemical expressions of iba-1, CD11b/c, cathepsin S, GFAPand S100β markers were quantified using an immunohistofluorescence approach to count thenumber of immunopositive cells and surface stained by these markers. All these experimentswere done at D14 and D28 after surgery.At D14, SNL animals develop mechanical allodynia and hyperalgesia as well as ambulatory pain..For these animals, thalamic microglial cells showed signs of reactivity with the increase mRNAexpression of CTSS and CX3CR1, fractalkine receptor, well known markers involved in spinalneuronal hyperexcitability under neuropathic pain conditions. In addition, the number ofimmunopositive cells for the glial markers is decreased in SNL animals. At D28, the neuropathicpain symptoms are still present. Furthermore, thalamic microglial reactivity found at D14 withqRT-PCRm method is still present with the increased mRNA expression of fractalkine (CX3CL1),partner of CTSS/CX3CR1/CX3CL1 pathway. The decreased neurochemical expression of glialmarkers found at D14 was transient as I didn’t find this result at D28. However, thalamicastrocytic reactivity was found at D28 in SNL animals.So, this work reveal a new glial process at thalamic level in this SNL model of neuropathic pain :an early decreased expression of glial markers and then a later thalamic astrocytic reactivityconcomitant with signs of thalamic microglial reactivity. Numerous studies are required toexplore the role of such novel ambivalent glial alterations in the context of neuropathic pain.

Alors que la douleur physiologique est essentielle à la survie de l'individu, les douleurs chroniques sont purement délétères pour l'organisme et la qualité de la vie. Malheureusement, les traitements actuels se limitent à des médicaments peu efficaces ou présentant un mauvais rapport bénéfice / risque. Il est donc urgent de mieux comprendre les mécanismes d'établissement et de persistance des douleurs chroniques, comme les douleurs neuropathiques, afin de concevoir des stratégies thérapeutiques efficaces contre ces pathologies. De nombreuses études ont montré que les canaux calciques de type T sont impliqués dans les états douloureux chroniques. Par exemple, le sous-type Cav3.2, est exprimé tout au long du circuit neuronal nociceptif. Dans le système nerveux périphérique, les canaux Cav3.2 ont un rôle pronociceptif et sont désormais validées comme cibles pour la recherche de thérapies innovantes. En revanche, le rôle du canal Cav3.2 au niveau central, et en particulier dans la moelle épinière, un point névralgique de convergence, d'intégration et de transmission des informations nociceptives, reste à explorer.Grâce à un modèle murin Cav3.2GFP-Lox knock-in créé par l'équipe, nous avons pu identifier/localiser précisément les neurones Cav3.2 positifs dans tout le système nerveux et induire une délétion tissulaire spécifique de Cav3.2 par l’action de la Cre recombinase, pour ensuite en évaluer les effets sur la sensibilité à la douleur. Dans la moelle épinière, nous avons constaté que Cav3.2 est fortement exprimé dans les neurones des laminae superficielles, et sont principalement des neurones excitateurs. La suppression de Cav3.2 spinal par une approche virale a démontré comportementalement : i) l’abolition de l’allodynie au froid et mécanique, de l’hyperalgésie mécanique, ainsi que des douleurs spontanées, en condition neuropathiques chez les mâles et les femelles, ii) une altération de la perception au chaud en condition neuropathique avec un effet différentiel dépendant du sexe, et iii) une réduction de l’anxiété associée aux douleurs chroniques, iv) la suppression des effets analgésiques d’un traitement systémique d’un bloqueur pharmacologique de canaux calciques de type T. Mécanistiquement, les enregistrements extracellulaires in vivo des neurones de projection spinaux démontrent une diminution de l'intégration et de la transmission des messages nociceptifs pathologiques des fibres périphériques C et A-delta lorsque le canal Cav3.2 est délété dans les réseaux spinaux. Cette approche de délétion a été développée avant et après l'induction du modèle de douleur neuropathique pour en évaluer les effets préventifs et curatifs.Les résultats démontrent que la délétion du canal spinal Cav3.2 a des effets préventifs et curatifs sur les symptômes des douleurs neuropathiques. Dans une perspective clinique pour le développement d'analgésiques basés sur les inhibiteurs calciques de type T, nous suggérons de cibler Cav3.2 spinal en plus des canaux dans les neurones afférents primaires par des molécules pénétrant le système nerveux central. / Physiological pain is essential for individual survival, but chronic pains are purely deleterious for the organism and the life quality. Unfortunately, current therapies are limited to drugs with a low efficacy or with a bad benefit/risk ratio. It is thus urgently necessary to better understand the establishment and persistence mechanisms of those chronic pains, like neuropathic pain in order to design efficient therapeutic strategies against this pathology. Many studies have shown that T-type calcium channels are involved in chronic pain states, like Cav3.2 subtypes, all along the nociceptive circuit. In the peripheral nervous system, Cav3.2 channels have pronociceptive impact and are now approved as a target for innovative therapies development. In contrast, the role of Cav3.2 channel in the central nervous system, and especially in the spinal cord, a crucial hotspot of nociceptive information convergence, integration and transmission, remains to be explored.Thanks to a Cav3.2-GFP-Lox murine model created by the team, we were able to i/ identify and precisely localize Cav3.2 positive neurons in all the nervous system and ii/ induce tissue specific deletion of Cav3.2 by the Cre recombinase action, to evaluate effects on pain sensitivity. At the spinal level, we found that Cav3.2 is prominently expressed in lamina II neurons comprising mostly excitatory neurons. Knocking-out spinal Cav3.2 by a viral approach has demonstrated behaviorally i) an abolition of cold and mechanical allodynia, mechanical hyperalgesia and spontaneous pain like behaviors under neuropathic conditions in males and females, ii) an alteration of the hot perception, under pathological pain conditions, with a differential effect in a sex dependent manner, and iii) a modification of anxiety associated to chronic pain, iv) a suppression of the analgesia induced by a systemic treatment with a brain penetrant T-type channel blocker. Mechanistically, extracellular in vivo recordings of spinal projection neurons demonstrate a decrease in integration and transmission of pathologic nociceptive messages from peripheral C- and A-delta fibers by Cav3.2 ablation in spinal networks. This approach has been developed before and after induction of the pain model to evaluate the preventive and curative effect of the treatment.Altogether, the results demonstrate that spinal Cav3.2 channel deletion has preventive and curative effects regarding neuropathic pains symptoms. In a clinical perspective for the development of analgesics based on T-type calcium channel blockers, we suggest the utility of targeting spinal Cav3.2 additionally to channels in primary afferent neurons, a notion already well established.

Ces pages font un état des lieux des travaux réalisés au sein du département de médecine générale de 2004 à 2011 sur l'hypovitaminose D, sa fréquence, ses facteurs de risques, son lien avec les douleurs musculo-squelettiques diffuses et chroniques chez les adultes jeunes. De ces travaux et de la revue de la litéérature, il ressort quelques notions importantes et méconnues. Les personnes qui cnsultent un médecin généraliste ont des taux sérique de vitamine D beaucoup plus bas que les taux trouvés dans les groupes de volontaires sains recrutés pour les grandes études comme Suvimax ou l'enquête nationale nutrition santé (ENNS). Les taux retrouvés dans nos travaux sont identiques à ceux trouvés dans les populations émigrées des pays développés et dans les populations des pays où le soleil est évité, mais nos populations, elles, sont ordinaires hommes comme femmes.Les facteurs de risques de l'hypovitaminose sont retouvés dasn nos populations : les vêtements couvrants, le phototype, l'obésité, pas d'exposition solaire, pas de sport en extérieur, pas de vacances au soleil, la CMU marqueur de précarité. Une des conséquences sont des douleurs musculaires et osseuses, chronqiues, diffuse avec une moindre qualité de vie physique. Le traitement des déficits améliore les patients douloureux que nous avons trouvé très carencés. Ces patient consomment beaucoup de soisns et leur prise en charge pourrait réduire d'au moins 50 % leur consommation de soins. Il y a urgence à prendre en considération ce p^roblème de santé publique car 100% des consultants adultés âgés entre 18 et 50 ans, homme et femme, douloureux chroniques, ont un déficit (vitamine D <20 ng/ml ou 50 nmol/l), et plus de 25% ont un déficit sévère (vitamine D <10 ng/l ou 25 nmol/l). / Hypovitaminosis D is common in populations which consult GP's. Manu studies have been conducted which revealed high prevalence of severe hypovitaminosis in young people. risk factors were covered clothes, high BMI, dark phottype, precarity, no sunhbathing, no sun holidays, no sport outdoor. Quality of life was correlated with vitamin D levels. Patients with chronic musculo skeletal pains had very low level of vitamin D < 10 ng/ml for 25%. The supplementation cured the pains for more than 50 % of the patients and decreased the consumption of medicines and care. It will be be very important to consider this problem of public health for young people.

Les douleurs neuropathiques sont associées dans la moelle épinière à des altérations neuronales et gliales. Ces cellules libèrent des médiateurs inflammatoires comme l'interleukine-6, jouant un rôle pro-nociceptif et qui active principalement la voie JAK/STAT3. Dans ce contexte, nous avons étudié l'implication éventuelle de la voie dans ce type de douleurs. Dans différent modèles de lésions de nerf périphérique chez le rat, la voie JAK/STAT3 spinale est activée de façon précoce et prolongée, surtout dans la microglie. L'inhibition de cette voie par un agent pharmacologique a démontré son implication dans la genèse de l'hypersensibilité douloureuse. Pour inhiber plus spécifiquement la voie JAK/STAT3, nous avons injecté dans la corne dorsale de la moelle épinière un vecteur lentiviral à fort tropisme glial (LV-SOCS3). L'injection préventive de ce vecteur chez des rats neuropathiques diminue l'expression d'IL-6, ATF3 et MCP-1 et réduit fortement l'hypersensibilité mécanique.