Les microglies sont petites cellules gliales du système nerveux centrale (SNC) considérées comment les cellules immunitaires pour la ressemblance avec les macrophages et la capacité de phagocyter. Bien quelles sont distribués partout le SNC, la densité, la morphologie et l’état d’activation de la microglie diffère selon la région du cerveau. Il a été signalé récemment que les microglies sont fortement activées dans le bulbe olfactif (OB) des souris saines. C’est cet état constant d’activation qui nous suggère que les microglies peuvent jouer un rôle crucial dans l'OB. Dans cette étude, nous avons cherché à expliquer le rôle de la microglie en l’OB. Nous avons évalué les changements survenus dans la densité et le niveau d’activation de la microglie avec: l’abolition de la neurogenèse, la deprivation sensorielle et la présentation des molécules d’odeur. Fait intéressant, en utilisant des souris transgéniques portant le gène de la luciférase sous le contrôle transcriptionnel du promoteur de TLR2, nous avons observé que la présentation d’odeur a induit une activation de la microglie. Nos résultats suggèrent que les microglies dans l'OB peuvent être impliqués dans le traitement sensoriel et jouer donc un rôle important dans le comportement animal. Mots clé: microglie, bulbe olfactif, neurogenèse adulte, olfaction. / Microglia are small glial cells present in the central nervous system (CNS) that are considered as resident immune cells because of their resemblance with macrophages and capacity to phagocyte. Although they are distributed throughout all the CNS, the density, morphology and state of activation of microglia vary according to brain region. It has been recently reported that microglia are highly activated in the olfactory bulb (OB) of healthy mice. It remains however unclear why these cells are present in the activated alert state in the OB and what is their role in the bulbar network stability and/or function. In this study we aimed to examine the role of microglia in the OB. We evaluated changes in the density and level of activation of microglia following: ablation of adult neurogenesis, sensory deprivation as well as presentation of odor molecules. Interestingly, using a transgenic mouse bearing the luciferase gene under the transcriptional control of a murine TLR2 promoter, we observed that odor presentation induces a dramatic increase in the microglia activation. Our findings suggest that microglia in the OB may be involved in the sensory processing and play thus an important role in animal behaviour. Keywords: Microglia, olfactory bulb, adult neurogenesis, olfaction.

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Suite à un traumatisme cérébral, les microglies sont impliquées dans la réponse cellulaire inflammatoire. Le passage de la forme quiescente à la forme activée des microglies est associé à l’augmentation marquée du récepteur membranaire TLR2 (Toll-like receptor). Le rôle de ce récepteur sur la récupération fonctionnelle à court et à longs termes demeure incertain. C’est pourquoi cette thèse a pour but de clarifier la dynamique et le rôle de l’activation des microglies en utilisant le récepteur TLR2 comme marqueur suite à une ischémie cérébrale transitoire. Pour ce faire, nous avons entre autre utilisé un modèle murin généré dans le laboratoire, la souris TLR2-luc-GFP, pour étudier de façon longitudinale la réponse inflammatoire in-vivo. En premier lieu, l’activation microgliale, suite à la lésion, a été analysée chez une souris n’exprimant pas le récepteur TLR2. Les résultats de cette étude démontrent que l’absence du récepteur TLR2 retarde la réponse immunitaire et cause à long terme une augmentation du volume ischémique. De plus, la perte des récepteurs TLR2 corrèle avec la baisse des niveaux de IGF-1, un facteur anti-apoptotique et neurotrophique exprimé par les microglies dans la région ischémique. En deuxième lieu, nous avons évalué l’effet de l’environnement sur la réponse microgliale suite à une ischémie cérébrale induite par photothrombose. Une baisse d’activation microgliale fut mesurée chez les souris en milieu enrichi et cette diminution est accompagnée d’une meilleure récupération fonctionnelle. En troisième lieu, l’activation microgliale, en absence d’estrogène a été analysée chez une souris ErαKO à la suite d’une ischémie cérébrale transitoire. Les résultats de cette étude démontrent que l’absence du récepteur Erα diminue l’activation microgliale. De plus, la voie signalétique JAK/STAT, via la cytokine IL-6, serait préférentiellement utilisée chez ces souris au cours de la réponse inflammatoire. Finalement, cette thèse démontre l’importance de la microglie dans l’établissement de la réponse immunitaire ainsi que dans la récupération fonctionnelle suite à une ischémie cérébrale dans différents modèles. Grâce à une compréhension plus approfondie des mécanismes inflammatoires, la mise en place de stratégies thérapeutiques ne sera que plus efficace. / Cerebral ischemia is associated with a strong inflammatory response. Glial activation that ensues contributes to neuronal damage and/or provides trophic support to injured neurons. Activated microglia is one of the key components of the cellular response to CNS injuries and the passage from the quiescent to reactive microglia is associated with an upregulation of a membrane receptor called the toll-like receptor 2 (TLR2). Although upregulation of TLR2 his known to play a major role in the innate immune response, the functional significance and the dynamics of this response in a model of focal cerebral ischemia is still unclear. Therefore, to further clarify the role of TLR2 after a cerebral ischemia, we developed a model system for in vivo, non-invasive analysis of the TLR2 activation in the brain. This thesis is divided in three distinct chapters. In the first chapter the role of the TLR2 signaling and microglial activation in a TLR2KO mouse was investigated beyond 72 hours. This work clearly demonstrates that the lack of TLR2 affects the neuroinflammatory response causing a delayed exacerbation of the ischemic lesion. Furthermore, TLR2 deficient mice reduced levels of IGF-1, a neurotrophic and antiapoptotic factor express by microglial cells. In the second chapter, we evaluated the effect of environmental enrichement on the inflammatory response after phototrombotic stroke in our TLR2-luc-gfp mice. Study of microglial activation showed that multisensory stimulation attenuated TLR2-induced microglial activation, thus leading to a greater neurological outcome. In the third chapter, we crossed TLR2-luc-gfp mice with ErαKO mice to study the effect of a major oestrogen signalling pathway on microglial activation after cerebral ischemia. The lack of Erα receptor reduced microglial activation in normal female mice as well as oestrogen-deprived mice. Likewise a shift toward the JAK/STAT pathway was observed suggesting its implication in the inflammatory process. Finally this thesis illustrates the significant impact of the microglia on the immune response and the recovery after a cerebral ischemia in different mouse models. With this newly acquired knowledge on inflammatory process the establishment of better therapeutic strategy could only benefit from it.

Thèse de doctorat : Médecine. Neurosciences : Université de Nantes : 2005. / Bibliogr.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. 71-79. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. [53]-63. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Les microglies sont les principales cellules neuro-immunitaires du cerveau, jouant un rôle important à la fois dans l'homéostasie cérébrale et les états pathologiques. Outre la sécrétion de molécules pro-inflammatoires et anti-inflammatoires, elles participent également au remodelage des circuits neuronaux par des mécanismes qui incluent l'élagage (« pruning ») synaptique, l'effeuillage (« stripping ») synaptique et la maturation synaptique. Ainsi, la microglie est connue pour ses divers rôles dans différentes conditions physiologiques et pathologiques, selon le microenvironnement dans lequel elle se trouve et du contexte qui module ses activités. La grande diversité des fonctions microgliales résulterait de la nature hétérogène de la population microgliale, ce qui signifie que toutes les cellules microgliales ne sont pas identiques et peuvent présenter des différences dans leurs modes d'action. Cette hétérogénéité microgliale a fait l'objet de quelques études dans différentes conditions physiologiques et pathologiques. En 2016, j'ai observé et publié des travaux décrivant la présence d'un nouveau phénotype microglial dans le cerveau, les microglies « sombres », lors de l'étude des interactions entre les microglies et les synapses en contextes de stress chronique, vieillissement et maladie. En microscopie électronique à transmission, nous avons décrit la présence de cellules semblables aux microglies, mais possédant un cytoplasme et un nucléoplasme denses, une perte du motif d'hétérochromatine nucléaire, ainsi que des marqueurs de stress oxydatif. Nous avons décrit la prévalence accrue de ce type de cellules dans des modèles murins de stress chronique, de la pathologie de la maladie d'Alzheimer, de vieillissement et d'altération de la communication neurone-microglie. En utilisant la microscopie électronique avec immunomarquage pour étudier la colocalisation de la microglie sombre avec différents marqueurs cellulaires, nous avons également démontré l'origine microgliale de la microglie sombre et identifié grâce aux données d'ultrastructure un rôle potentiel dans le remodelage synaptique. Nous avons également caractérisé la présence des microglies sombres pendant les stades postnatal du neurodéveloppement normal et proposé un rôle potentiel dans le remodelage synaptique au cours de mécanismes développementaux, en particulier l'affinement et la maturation des circuits neuronaux. Ma thèse décrit donc la microglie sombre comme un nouveau phénotype de la microglie présentement observé en utilisant des outils de microscopie électronique. Selon les évidences ultrastructurelles que nous avons obtenues, les microglies sombres pourraient être un sous type de microglies principalement impliqué dans le remodelage synaptique, en vue d'adapter le cerveau en condition pathologique ou en réponse à des changements de l'environnement externe. Elles pourraient également être un type cellulaire important, impliqué avec les microglies normales dans la sculpture et l'affinement des circuits neuronaux au cours du développement cérébral postnatal, par l'élimination des contacts synaptiques superflus. Nous soulignons donc l'importance d'étudier la microglie sombre la nécessité d'identifier des marqueurs spécifiques à la microglie sombre pour faciliter l'isolement et la caractérisation moléculaire de ces cellules afin de concevoir éventuellement des traitements utilisant l'activité de ces cellules pour traiter divers troubles neurologiques. / Microglia are the principle neuroimmune cells of the brain, having important roles both in brain homeostasis as well as pathological states. Apart from the secretion of pro-inflammatory or anti-inflammatory molecules, they also participate directly at the synaptic level in the remodeling of neuronal circuitries by remodeling mechanisms that include synaptic pruning, synaptic stripping, and synaptic maturation. Thus microglia are known to display diverse roles in different physiological and pathological conditions, largely depending upon the microenvironment they are present in and the context that triggers their activities. One reason for microglia displaying such diverse roles was hypothesized to be the heterogeneous nature of the microglial population, meaning that all microglial cells are not alike and may display differences in their modes of action. For a long time researchers have thus focused on studying this microglial heterogeneity in a number of physiological and pathological states. In 2016, I reported the presence of a novel microglial phenotype in the brain, named the "dark" microglia, while studying microglia-synapse interactions in the contexts of chronic stress, aging, and disease. Using transmission electron microscopy, we described the presence of a microglia-look alike cell, but with a dense cytoplasm and nucleoplasm, as well as loss of nuclear heterochromatin pattern and signs of oxidative stress. We described the increased prevalence of this cell type in mouse models of chronic stress, Alzheimer's disease pathology, aging, and neuron-microglia communication alteration. Using immunoelectron microscopy to study the colocalization of dark microglia with different cell type markers, we further demonstrated the microglial origin of the dark microglia, as well as proposed putative synaptic remodeling roles based on our observations of extensive dark microglia-synapse interactions captured at the ultrastructural level. We have also characterized the presence of dark microglia in postnatal stages of early brain development. Our findings suggested synaptic remodeling roles during normal development, especially in the refinement and maturation of the neuronal circuitry, as well as phagocytosis of apoptotic cells. My thesis thus describes dark microglia as a new microglial phenotype currently seen using electron microscopy (EM) tools. Based on the ultrastructural evidence we have, the dark microglia could represent an important microglial subtype that is primarily involved in synaptic remodeling in an attempt to bring about adaptation of the brain in response to disease or changes in external environment. They could also be an important cell type along with typical microglia that mediates the sculpting and refinement of the neuronal circuitry during early postnatal brain development, when there is an excess of synaptic contacts being formed that need to be pruned out. We therefore highlight the importance of studying the dark microglia, and the need of identifying dark microglia-specific markers to aid with the isolation and further molecular characterization of these cells, to eventually develop therapeutics that utilize the activity of these cells to treat various neurological disorders.

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La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative qui cause la mort des neurones moteurs, induisant une paralysie progressive et menant à la mort quelques années après l'apparition des premiers symptômes. Comme dans toutes les maladies neurodégénératives, l'inflammation est une composante principale de la pathogénèse de la SLA. Une des cellules effectrices de cette inflammation, la cellule microgliale est le sujet central de cette thèse. Avec l'apparition des symptômes, la microglie passe d'un phénotype anti-inflammatoire et neuroprotecteur à un phénotype aberrant et neurotoxique. Il est nécessaire d'élucider les mécanismes cellulaires responsable du changement de phénotype et l'identification des facteurs maintenant ces phénotypes pour permettre le développement de thérapies efficaces ciblant l'inflammation. Ainsi dans cette thèse, nous tâchons d'identifier, en utilisant divers outils moléculaires et modèles animaux, la signature microgliale à différents stades de la SLA. Durant le stade présymptomatique, nous identifions, par l'étude du sécrétome microglial, la cytokine immunosuppressive interleukine-10 comme responsable du maintien du phénotype anti-inflammatoire. Cette cytokine est à la fois produite par les cellules microgliales et reconnue par celles-ci, grâce au récepteur IL-10R. Le blocage d'IL-10R a pour conséquence d'accélérer la progression de la maladie et de diminuer la survie dans un modèle murin. Aussi, l'augmentation de l'expression de cette cytokine à l'aide d'un vecteur viral mène à une diminution de la vitesse de la progression de la maladie et allonge la durée de vie chez ce même modèle murin. Dans le but de comprendre les mécanismes cellulaires impliqués dans le changement phénotypique de la microglie avec l'apparition des symptômes de la SLA, nous utilisons un système-modèle pour le profilage moléculaire spécifique à la microglie. Cet outil, EDTA TRAP, consiste en l'immunopurification des ribosomes microgliaux et l'identification subséquente des ARNm et des protéines séquestrés sur ces ribosomes. Il a été possible d'identifier une forte disparité dans la nature des ARNm et des protéines les plus régulés. Le profil transcriptomique de la microglie symptomatique dénote une fonction phagocytaire et possiblement neuroprotectrice pour la microglie alors que son profil protéomique est proliférateur et potentiellement neurotoxique. La disparité de ces deux profils s'explique par la répression de la traduction d'ARNm issus de gènes immunitaires par un mécanisme impliquant l'interaction de leur 3'UTR et de la protéine liant l'ARN SRSF3. La forme phosphorylée de cette protéine s'accumule spécifiquement du cytoplasme des cellules microgliales proportionnellement avec la progression de la maladie. La diminution de l'expression de SRSF3 à l'aide d'un oligonucléotide interférent rétablit la traduction des ARNm immunitaires et la fonction phagocytaire de la microglie associée à ces ARNm. Cela mène à une progression plus lente de la maladie et une plus longue survie dans un modèle murin. Ainsi, l'utilisation d'un oligonucléotide interférant contre SRSF3 pourrait être une nouvelle avenue thérapeutique dans le traitement de la SLA. La compréhension des divers mécanismes cellulaires impliquant la protéine SRSF3 est importante pour comprendre son dynamisme dans la SLA. SRSF3 est la plus petite protéine de la famille SR. Cette famille se distingue par leur structure soit un ou deux motifs de reconnaissance de l'ARN en N-terminus et un domaine riche en arginine et en sérine hautement phosphorylable en C-terminus. SRSF3 peut être phosphorylé dans le noyau par la kinase CLK1 ou dans le noyau et dans le cytoplasme par les kinases SRPK. SRSF3 est impliqué dans l'épissage, le transport nucléo-cytoplasmique et la traduction, entre autres. La dérégulation du niveau d'expression ou de la phosphorylation de SRSF3 peut drastiquement changer son rôle dans la cellule. Ainsi, SRSF3 est impliqué dans diverses maladies comme le cancer, les infections virales ou la SLA. Les mécanismes cellulaires régissant le dynamisme de SRSF3 doivent ainsi être bien compris dans le but de faire de l'oligonucléotide interférent contre SRSF3 une thérapie efficace contre la SLA / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disorder that leads to motoneuron loss, progressive paralysis and death a few years after the first symptoms. As every other neurodegenerative disorder, inflammation is a main component of ALS pathogenesis. One of the cell type implicated in this inflammation, the microglia, is the central subject of this thesis. With the emergence of the symptoms, microglia transforms from an anti-inflammatory and neuroprotective phenotype to an aberrant and neurotoxic phenotype. It is necessary to elucidate the cellular mechanisms underlying this phenotypic change and the factors maintaining these phenotypes to allow the development of effective inflammation-targeting therapies. In this thesis we seek to identify, using multiple molecular tools and animal models, the microglial signature at the different stage of the disease. During the symptomatic stage, we identified the immunosuppressive cytokine IL-10 to be responsible for maintaining the anti-inflammatory phenotype. This cytokine is at the same time produced and recognized by microglial cells. Blocking IL-10 receptor accelerated disease progression and shortened survival in a mouse model. Moreover, the augmentation of the expression of IL-10, using a viral vector, slowed disease progression and lengthened lifespan in the same mouse model. In order to understand the cellular mechanisms implicated in the microglial phenotypic change in ALS, we used a system-model for the microglia-specific molecular profiling. This tool, EDTA-TRAP, consists in the microglial poly-ribosome immunopurification and the subsequent identification of in-translation mRNAs and proteins sequestered on these ribosomes. It was possible to identify a strong mismatch in the nature of the most regulated mRNAs and proteins. The transcriptomic profile of symptomatic microglia denotes a phagocytic and possible neuroprotective function for microglia while its proteomic profile is proliferative and potentially neurotoxic. The discrepancy between these two profiles is explained by the repression of immune gene mRNA translation by a mechanism implicating the interaction of their 3'UTR and the RNA-binding protein SRSF3. The phosphorylated form of SRSF3 specifically accumulates in microglia cytoplasm proportionally with disease progression. The decrease of SRSF3 expression by an interfering oligonucleotide restores immune mRNA translation and the microglial phagocytic function. This leads to and slower disease progression and a longer survival in a mouse model. Hence, the use of an interfering oligonucleotide against SRSF3 could be a new therapeutic avenue in ALS treatment. The understanding of the diverse cellular mechanisms implicating SRSF3 is important in elucidating its dynamic function in ALS. SRSF3 is the shortest protein from the SR family. This family can be distinguished by their structure : one or two N-terminal RNA recognition motif and a C-terminal highly phosphorylatable arginine and serine rich domain. SRSF3 can be phosphorylated in the nucleus by the CLK1 kinase or in the nucleus and the cytoplasm by the SRPK kinases. SRSF3 is implicated in splicing, nucleocytoplasmic transport and translation, among others. The deregulation of the expression level or the phosphorylation of SRSF3 can drastically change its role in the cell. Hence, SRSF3 is implicated in many diseases such as cancer, viral infection and ALS. The cellular mechanisms governing SRSF3 dynamism should then by well understood in order to make the interfering oligonucleotide against SRSF3 an efficient therapy to treat ALS.

Les pathologies du SNC associent neurodégénérescence, troubles de la transmission et des processus neuroinflammatoires : réaction gliale et recrutement de cellules immunes. Les cellules immunes peuvent participer aux processus de souffrance neuronale et inhiber les processus de réparation comme la neurogenèse, mais peuvent également exercer des rôles neuroprotecteurs. Notre équipe a décrit que la molécule RAE-1, connue pour son rôle de ligand du récepteur activateur NKG2D exprimé par les NK, est exprimée constitutivement dans la SVZ, la zone de neurogenèse adulte qui génère des neuroblastes qui migrent vers le bulbe olfactif. De plus, RAE-1 est exprimée par les neurosphères issues de la SVZ et exerce un rôle non immun sur la prolifération cellulaire.L'objectif était de comprendre le rôle de RAE-1 et des NK en situation pathologique. J'ai étudié, en particulier, le modèle de lésion chimique des neurones olfactifs après injection de dichlobenil qui induit une mort neuronale suivie d'une réparation des réseaux neuronaux dans le bulbe olfactif. Ce modèle, connu des neurobiologistes, n'avait jamais été étudié sur le plan neuroinflammatoire. Nous avons caractérisé dans le bulbe olfactif, en RT-qPCR et cytométrie en flux multicouleur : la cinétique des processus de dé-afférentation, de ré-afférentation, de réaction gliale et le recrutement de cellules immunes. Je décris également l'induction de RAE-1 dans le bulbe olfactif, qui n'est pas liée à la présence d'une neurogenèse locale mais qui corrèle avec la prolifération microgliale et l'expression du M-CSF. Ces processus sont modifiés après un traitement à la minocycline et la déplétion des NK. Avec des modèles de culture in vitro, j'ai identifié RAE-1 comme un marqueur et un acteur de la microglie proliférative qui exerce, contrairement à la microglie non proliférative, des effets neuroprotecteurs. / CNS pathologies are characterized by neurodegeneration, neurotransmission impairment and neuroinflammation including glial reactivity and immune cells recruitment. Neuroinflammation induces neuronal loss and impairs neurogenesis but can also exerts neuroprotective effects. Our team has recently demonstrated that RAE-1 is constitutively expressed in the adult subventricular zone (SVZ), the main neurogenic niche where resident neural stem cells generate neuroblasts which migrate in chains to the olfactory bulbs, where they differentiate into interneurons. We also have reported in vitro that RAE-1 is a marker of proliferating neural stem/progenitor cells and plays a non-immune role in cell proliferation. The main objective was to understand the role of RAE-1 and NK cells in pathological condition. We mainly studied a model of chemical ablation of olfactory neurons using dichlobenil which induced neuronal loss followed by an olfactory neuronal network recovery. Neuroinflammatory processes have never been studied in this model, used by neurobiologists. Using RT-qPCR and multicolor flow cytometry, I characterized the processes of deafferentation, reafferentation, astroglia and microglia activation and the recruitment of immune cells. Moreover, RAE-1 expression was induced in the olfactory bulbs. This expression correlated with the increase of microglial cell proliferation markers and M-CSF expression. These neuroinflammatory processes were altered after NK cells depletion and minocyline treatments. Using in vitro culture models, I showed that RAE-1 is a marker and an actor of microglia proliferation. Moreover, proliferative microglia but not non proliferative cells exerts a neuroprotective effect.