Les microglies sont les cellules immunitaires du cerveau qui exercent des rôles physiologiques cruciaux tout au long de la vie. Pour évaluer si leurs fonctions sont altérées dans la physiopathologie de la maladie de Parkinson (PD), le trouble moteur neurodégénératif le plus commun, nous avons caractérisé leurs changements de densité, de morphologie, d’ultrastructure et d’activité de dégradation dans le putamen sensorimoteur de singes cynomolgus lésés au 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP). Un sous-groupe de singes MPTP a également été traité oralement à la lévodopa (L-DOPA). Ces singes ont développé des dyskinésies induites par la L-DOPA (LID) similaire à celles qu’éprouvent les patients atteints de la PD après seulement cinq à dix ans de traitement. En utilisant la microscopie optique, confocale et électronique, nos résultats ont montré des altérations de densité, de morphologie et de fonction des microglies chez les singes MPTP. Ceux-ci étaient partiellement normalisés avec le traitement à la L-DOPA. La densité microgliale, l’aire des corps cellulaires et des arborisations étaient augmentées chez les singes parkinsoniens, tandis que les animaux traités par la L-DOPA présentaient un phénotype similaire aux témoins. Au niveau de l’ultrastructure, les microglies semblaient saines, sans dilatation de l'appareil de Golgi et du réticulum endoplasmique, parmi d’autres marqueurs de stress cellulaire, chez les singes MPTP. Néanmoins, les microglies avaient moins d'inclusions phagocytaires chez le groupe MPTP, suggérant une activité de dégradation altérée. De plus, une réduction de l’expression de la glycoprotéine CD68 -associée aux lysosomes- a été mesurée dans les microglies d’animaux MPTP traités à la L-DOPA. La localisation subcellulaire du CD68 dans les lysosomes secondaires et les corps résiduels tertiaires des microglies a également été confirmée par microscopie électronique. Dans l’ensemble, ces résultats ont révélé des modifications microgliales phénotypiques au cours de la physiopathologie de la PD qui ont partiellement été renversées par la L-DOPA. / Microglia are the brain immune cells which exert crucial physiological roles across the lifespan. To assess whether their functions are impaired in the pathophysiology of Parkinson disease (PD), the most common neurodegenerative motor disorder, we characterized their changes in density, morphology, ultrastructure, and degradation activity among the sensorimotor functional territory of the putamen, in 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) cynomolgus monkeys. A subset of MPTP monkeys was also treated with oral levodopa (L-DOPA). These monkeys developed L-DOPA-induced dyskinesia (LID) similar to what PD patients experience after only five to ten years of treatment. Using light, confocal and electron microscopy, our results showed alterations of microglial density, morphology and function following MPTP intoxication that were partially normalized with L-DOPA treatment. Microglial density, cell body and arborization areas were increased in the PD monkeys, with these cells showing a more hyper-ramified morphology, whereas L-DOPA- treated animals presented a microglial phenotype similar to control animals. At the ultrastructural level, microglia appeared healthy, without dilation of the Golgi apparatus and endoplasmic reticulum, among other cellular stress markers,in MPTP monkeys. Nevertheless, microglia displayed a reduced number of phagocytic inclusions in the MPTP group, suggesting impaired degradation activity. Moreover, a decreased immunoreactivity for CD68 –a lysosome-associated glycoprotein– was measured in microglia from MPTP animals treated with L-DOPA. The subcellular localization of CD68 among secondary lysosomes and tertiary residual bodies was also confirmed in microglia by electron microscopy. Taken together, these findings revealed significant microglial phenotypic changes during PD pathophysiology that were partially rescued by L-DOPA treatment.

Les cellules microgliales, sont les macrophages résidents du système nerveux central (SNC), et sont issues principalement des macrophages du sac vitellin, générés dès les premiers stades du développement embryonnaire. À leur arrivée dans le SNC, ces cellules subissent une phase de prolifération massive, permettant l'établissement de la population microgliale et la colonisation du SNC. Cette phase de prolifération revêt une importance capitale pour le processus de développement normal du cerveau, car les cellules microgliales interviennent dans la régulation de divers processus neurodéveloppementaux. Après cette phase de prolifération, une densité stable de cellules microgliales est atteinte, et est maintenue tout au long de la vie adulte grâce à un faible taux de prolifération qui favorise le renouvellement de la population. De plus, la prolifération des cellules microgliales constitue également un élément central dans la réponse du SNC face aux infections, aux traumatismes, et à la neurodégénérescence. Dans ces contextes de neuroinflamamtion, l'activationmicrogliale est accompagnée par l'expansion de la population microgliale, principalement par la prolifération de ces cellules. Cette expansion microgliale a pour but d'assurer un nombre suffisant de cellules pour protéger et restaurer l'homéostasie du SNC. La prolifération microgliale est donc une composante importante du développement du SNC et de la réponse immunitaire, ce qui en fait un processus complexe finement orchestré par une cascade d'événements transcriptionnels régissant l'expression ou la suppression de gènes spécifiques. Effectivement, la régulation transcriptionnelle est influencée par une variété de facteurs, incluant des molécules régulatrices qui déclenchent l'activation de différentes voies de signalisation essentielles, qui coordonnent l'activité de plusieurs facteurs de transcription nécessaires à la prolifération. De plus, la régulation de la transcription est également conditionnée par des interactions complexes entre les facteurs de transcription et les éléments régulateurs de la transcription, les promoteurs et les éléments amplificateurs. Cependant, malgré les progrès réalisés, notre compréhension des mécanismes qui régulent la prolifération des cellules microgliales au niveau transcriptionnel reste largement incomplète. Ainsi, il est essentiel de définir une signature génique spécifique des cellules microgliales en phase de prolifération et de déterminer les programmes d'expression génique qui coordonnent cette prolifération dans divers contextes physiologiques et pathologiques. En outre, il est important d'identifier les facteurs de transcription responsables de la coordination de ces programmes transcriptionnels et de caractériser leurs interactions avec les éléments régulateurs de la transcription. Nous avons donc analysé la prolifération des cellules microgliales pendant le développement postnatal et dans un modèle de déplétion-repopulation microgliale. Cette analyse nous a permis de mettre en évidence l'existence d'un programme transcriptionnel essentiel pour une prolifération efficace des cellules microgliales. Ce programme s'intègre à divers autres programmes transcriptionnels actifs dans un contexte spécifique, et est influencé par le microenvironnement cérébral. Par ailleurs, nous avons identifié deux mécanismes distincts de la régulation transcriptionnelle de la prolifération : le premier induit une augmentation de l'expression des gènes déjà présents dans les cellules microgliales non prolifératives (gènes C1), tandis que le second favorise l'expression de nouveaux gènes associés aux différentes phases du cycle cellulaire (gènes C2). Ces mécanismes sont régulés par une combinaison de facteurs de transcription généraux et spécifiques. Enfin, il a été déterminé que la régulation de l'expression génique pendant la prolifération microgliale est principalement axée sur les promoteurs, avec une contribution moindre des éléments amplificateurs de la transcription. / Microglial cells are the resident macrophages of the central nervous system (CNS) and primarily originate from yolk sac macrophages, generated in theearly stages of embryonic development. Upon their arrival in the CNS, these cells undergo a phase of massive proliferation, allowing for the establishment of the microglial population and colonization of the CNS. This proliferation phase is of crucial importance for the normal brain development process, as microglial cells play a role in regulating various neurodevelopmental processes. Following this proliferation phase, a stable density of microglial cells is achieved and maintained throughout adulthood due to a low proliferation rate that promotes population renewal. Moreover, the proliferation of microglial cells also constitutes a central element in the CNS response to infections, injuries, and neurodegeneration. In these contexts of neuroinflammation, microglial activation is accompanied by the expansion of the microglial population, primarily through the proliferation of these cells. This microglial expansion aims to ensure enough cells to protect and restore CNS homeostasis. Therefore, microglial proliferation is an important component of CNS development and immune response, orchestrated by a cascade of transcriptional events governing the expression or suppression of specific genes. Transcriptional regulation is influenced by various factors, including regulatory molecules that trigger the activation of different essential signalling pathways, coordinating the activity of several transcription factors necessary for proliferation. Additionally, transcriptional regulation is conditioned by complex interactions between transcription factors and regulatory elements such as promoters and enhancers. However, despite progress, our understanding of the mechanisms regulating microglial cell proliferation at the transcriptional level remains incomplete. Thus, it is essential to define a specific gene signature of proliferating microglial cells and determine the gene expression programs coordinating this proliferation in various physiological and pathological contexts. Additionally, it is important to identify the transcription factors responsible for coordinating these transcriptional programs and characterize their interactions with transcriptional regulatory elements. Therefore, we analyzed the proliferation of microglial cells during postnatal development and in a microglial depletion-repopulation model. This analysis revealed the existence of an essential transcriptional program for efficient microglial cell proliferation. This program integrates with various other transcriptional programs active in specific contexts and is influenced by the cerebral microenvironment. Moreover, we identified two distinct mechanisms of transcriptional regulation of proliferation: the first induce an increase in the expression of genes already present in non-proliferative microglial cells (C1 genes), while the second promotes the expression of new genes associated with different phases of the cell cycle (C2 genes). These mechanisms are regulated by a combination of general and specific transcription factors. Finally, it was determined that the regulation of gene expression during microglial proliferation primarily focuses on promoters, with a lesser contribution from transcriptional enhancers.

Négligées pendant des siècles, les cellules gliales révolutionnent notre conception du système nerveux. En effet, ces cellules pourraient être des éléments clés dans le développement de plusieurs maladies et depuis quelques années elles apparaissent comme des modulateurs importants dans la transmission des signaux nociceptifs. Ces cellules une fois « activées » pourraient contribuer à l'initiation et au maintien de la douleur neuropathique. Dans la présente étude, nous avons caractérisé le patron temporel et spatial de la prolifération gliale, l'une des plus marquantes caractéristiques de l'activation gliale, dans le cadre d'un modèle neuropathique induit par la lésion d'un nerf périphérique. En se servant du bromodeoxyuridine (BrdU) comme marqueur mitotique, nous avons analysé la prolifération des cellules dans la moelle épinière, identifié le phénotype des cellules en division, et retracé leur destinée cellulaire, en faisant une corrélation avec les phénomènes comportementaux typiques chez les animaux présentant une douleur neuropathique. Nos résultats ont démontré qu'une lésion de nerf périphérique induit une prolifération cellulaire précoce et transitoire dans la moelle épinière du côté ipsilatéral à la lésion. La majorité des cellules en prolifération sont des microglies Iba-1+ , de concert avec quelques progéniteurs d'oligodendrocytes NG2+ , et quelques astrocytes GFAP+ . On a observé une étroite corrélation temporelle et spatiale entre cette prolifération microgliale dans la corne dorsale de la moelle épinière et les réponses de douleur anormalement exagérées, ce qui suggère une importante contribution de la nouvelle microglie à la genèse des symptômes présents dans les cas de douleur neuropathique. / Neglected for centuries, glial cells are revolutionizing our understanding of the nervous system. Indeed, these cells could be key players in the development of many diseases and in recent years they have appeared as important modulators in the transmission of nociceptive signals. These cells once "activated" could contribute to the initiation and maintenance of neuropathic pain. In this study, we characterized the temporal and spatial pattern of glial proliferation, one of the most striking features of glial activation, in the context of a neuropathic pain model induced by peripheral nerve injury. Using bromodeoxyuridine (BrdU) as a mitotic marker, we analyzed cell proliferation in the spinal cord, identified the phenotype of dividing cells, and traced their fate, and correlated these phenomena with behavioral assays of the neuropathic pain syndrome. Our results demonstrated that peripheral nerve injury induced an early and transient cell proliferation, on the spinal cord ipsilateral to the nerve lesion. The majority of proliferating cells are microglia Iba-1+ , together with a few progenitors of oligodendrocytes NG2+ , and a few GFAP+ astrocytes. There was a close temporal correlation between microglial proliferation in the spinal cord dorsal horn and the abnormal pain responses, suggesting a contribution of the new microglia to the genesis of neuropathic pain symptoms.

Lors d'études antérieures, l'analyse du transcriptome des cellules micro gliales à l'aide de micropuces à ADN nous a permis d'identifier le récepteur transmembranaire GPR84. Dans la présente étude, nous avons testé l 'hypothèse que la transcription du GPR84 est augmentée dans la microglie durant l'inflammation. Plus précisément, nous avons étudié la régulation du GPR84 dans le cerveau durant une endotoxinémie et une encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAB) . Nos résultats ont montré une augmentation de l'expression du GPR84 au cours de ces deux conditions inflammatoires, et ce uniquement dans la microglie. Nous avons ensuite tenté d'identifier le rôle du GPR84 en testant l 'hypothèse selon laquelle ce récepteur modulerait le développement des symptômes dûs à l'inflammation. À l'aide de souris déficientes en GPR84, nous avons évalué l'influence de ce récepteur durant une EAB, une endotoxinémie et une encéphalite induite par le virus de l 'herpès simplex de type 1. Nous n'avons observé aucune influence du GPR84 dans ces modèles. Nous concluons que le GPR84 est exprimé non spécifiquement dans plusieurs conditions neuroinflammatoires, mais qu'il n'y exerce pas toujours un effet significatif et que son rôle reste inconnu.

Les démences sont un problème grandissant dans le monde, principalement à cause du vieillissement de la population. En 2019, ces maladies représentaient la septième cause de décès dans le monde selon l'OMS. D'ici 2050, il est projeté que plus de 130 millions de personnes recevront un diagnostic de démence, dont 70% des cas seront de la maladie d'Alzheimer. Cette maladie, touchant particulièrement les femmes, est caractérisée par l'accumulation d'anormalités protéiques dans le cerveau, soit les plaques d'amyloïde bêta et les enchevêtrements neurofibrillaires de protéine Tau phosphorylée, ainsi que d'une perte synaptique menant à l'apparition de déficits cognitifs chez les patients. Bien que les mutations sur les gènes APP, PSEN1 et PSEN2 soient reconnus comme étant la cause de la forme familiale de la maladie, plus de 95% des cas sont sporadiques et les causes demeurent toujours inconnues à ce jour. Cependant, les études d'association pangénomiques commencent à identifier de nombreux facteurs de prédispositions, dont des mutations sur plusieurs gènes directement liés à la réponse immunitaire cérébrale. Parmi ces facteurs de risque, la mutation R47H sur le gène Trem2, un récepteur exclusivement exprimé par les microglies dans le SNC, a retenu l'attention. Les patients porteurs de cette mutation souffrent d'une forme particulièrement agressive de la pathologie. Également, les recherches récentes montrent que l'intensité des déficits cognitifs corrèle avec l'accumulation de formes pathologiques de Tau. Notre laboratoire s'est donc intéressé à cet aspect de la maladie. Sachant que les microglies, étant le macrophage résident du SNC, jouent un rôle central dans l'établissement de la réponse immunitaire et que Trem2 est un facteur central au niveau du changement phénotypique de la microglie vers un état d'activation, nous avons posé l'hypothèse que Trem2 est un facteur essentiel au niveau de la réponse microgliale efficace contre les formes pathologiques de la protéine Tau. Pour valider cette hypothèse, nous avons procédé à une série de tests comportementaux dans le modèle murin de démence hTau et avec des animaux hTau Trem2$^\textup{-/-}$. En effet, l'absence de Trem2 affecte les déficits cognitifs, principalement au niveau de l'anxiété. Cependant, l'âge avancé demeure le facteur de risque le plus important de la maladie. Sachant que l'accumulation de débris de myéline est un phénomène observé dans le cerveau vieillissant, nous nous sommes questionnés sur l'impact des défauts de myélinisation sur la pathologie de Tau. De plus, sachant que Tau est une protéine axonale assurant normalement la stabilité des microtubules et que l'intégrité des axones est essentielle afin d'assurer une myélinisation efficace, nous avons émis l'hypothèse que la protéine Tau est essentielle au maintien de l'homéostasie cérébrale via entre autres la myélinisation. En effet, nos résultats montrent que la déficience en Tau mène à une quantité de myéline moindre dans le cortex dans un contexte de vieillissement à l'état basal, mais également dans le cortex et le corps calleux après un épisode de démyélinisation. De plus, l'absence de Tau est liée à une exacerbation des dommages subis sur les neurones du corps calleux caudal et rostral par un épisode de démyélinisation de cinq semaines. Ce mémoire montre donc l'implication de Trem2 au niveau de l'exacerbation des déficits cognitifs et de l'anxiété chez le modèle murin hTau, ainsi que l'implication de la protéine Tau dans les processus de myélinisation ainsi que dans la limitation de dommages subis sur les axones à la suite d'un épisode de démyélinisation toxique. / Dementia is a growing problem worldwide, primarily due to the aging population. In 2019, dementia was the 7th leading cause of death globally, according to the World Heath Organisation. By 2050, it is projected that over 130 million people will suffer from dementia, with 70% of cases being Alzheimer's disease diagnoses. This progressive neurodegenerative disease, which disproportionately affects women, is characterized by the accumulation of abnormal proteins structures, such as beta-amyloid plaques and neurofibrillary tangles of phosphorylated Tau protein, accompanied by synaptic loss. These three hallmarks lead to cognitive deficits in patients, that eventually completely loss their autonomy. While mutations in the APP, PSEN1, and PSEN2 genes are known to cause the familial form of the disease, over 95% of cases are sporadic and their causes remain unknown. However, large-scale genomic studies are beginning to identify numerous predisposing factors, including mutations in several genes directly related to the brain immune response. Among these risk factors, the R47H mutation in the Trem2 gene, a receptor exclusively expressed by microglia in the central nervous system (CNS), has garnered attention because patients carrying this mutation suffer from a particularly aggressive form of the pathology. Given that microglia, as the resident macrophages of the CNS, play a central role in immune response and that Trem2 is crucial in phenotypic changes of microglia towards an "activated" state, our hypothesis was that Trem2 is essential in the effective microglial response against pathological forms of Tau protein. To validate this hypothesis, we conducted a series of behavioral tests in hTau and hTau Trem2$^\textup{-/-}$ animals. Indeed, the absence of Trem2 affects cognitive deficits, particularly anxiety-related behaviors. We also explored the involvement of Tau protein in brain myelination processes. Advanced age remains the most significant risk factor for the disease. Knowing that myelin debris accumulation is a phenomenon observed in the aging brain, we questioned the impact of myelination defects on Tau pathology. Furthermore, knowing that Tau is an axonal protein normally responsible for the stability of microtubules and that the integrity of axons is essential for effective myelination, we hypothesized that Tau protein is essential for maintaining cerebral homeostasis, among other things, through myelination. Indeed, our results show that Tau deficiency leads to a reduced amount of myelin in the cortex in the context of basal aging, but also in the cortex and corpus callosum after an episode of demyelination. Additionally, the absence of Tau is linked to an exacerbation of the damage sustained by the neurons of the caudal and rostral corpus callosum from a five-week demyelination episode. This thesis thus demonstrates the involvement of Trem2 in the exacerbation of both cognitive deficits and anxiety in hTau mouse model, as well as the involvement of the Tau protein in myelination processes and in limiting damage to axons following a toxic demyelination episode

Au vu de la relative inefficacité des traitements actuels de la douleur cancéreuse osseuse (DCO) il est devenu nécessaire aujourd'hui d'identifier de nouvelles cibles (cellulaires et/ou moléculaires) pour développer de nouveaux outils thérapeutiques. Dans ce contexte, ces dernières années, de nombreuses études ont suggéré que les cellules gliales, principalement les astrocytes et la microglie, pourraient contribuer au développement et au maintien de la douleur chronique. D'autre part, dans des modèles d'études précliniques de la DCO, plusieurs auteurs ont récemment constaté une réactivité astrocytaire importante dans les cornes dorsales de la moelle épinière et ont montré que, si on empêche cette réactivité, les symptômes douloureux sont diminués. Cependant, la relation exacte existant entre la réactivité des cellules gliales et les symptômes douloureux en condition de DCO est inconnue. Afin de décrypter cette relation, nous avons dans un premier temps étudié le décours temporel des comportements douloureux et caractérisé l’état de sensibilisation centrale dans un modèle de DCO chez le rat induit par l'injection de cellules de carcinome glandulaire mammaire (MRMT-1) dans le tibia. Nous montrons par des approches radiologiques, comportementales (tests de douleur évoquée et de distribution pondérale dynamique) et immunohistochimiques (immunodétection de la protéine Fos après palpation non douloureuse de la patte) que les animaux cancéreux MRMT développent graduellement une tumeur osseuse (premiers signes au 10ème jour post-inoculation), une allodynie et une hyperalgésie mécaniques (à partir du 10ème jour) et thermiques (à partir du 14ème jour), un inconfort de la patte injectée (à partir du 14ème jour ) et des phénomènes de sensibilisation centrale. Dans un deuxième temps, nous avons recherché des indices structuraux et fonctionnels de réactivité gliale spinale dans notre modèle de DCO. L'objectif était donc de dater l'apparition de la réactivité gliale, et de déterminer la nature des cellules gliales impliquées : microglie et/ou astrocytes. Nous montrons par des approches immunohistochimiques qu’aucun signe morphologique de réactivité astrocytaire ni microgliale n’est observable pendant l’établissement et le maintien de la DCO alors que ces signes existent dans un modèle de douleur neuropathique (ligature de nerfs spinaux). De plus, par des approches moléculaire (qRT-PCR) et biochimique (technique du Bio-Plex) nous montrons que, parmi les 20 marqueurs structuraux et fonctionnels de réactivité gliale testés, seule l’expression de l’aquaporine 4 (un canal à eau spécifique des astrocytes) est significativement augmentée en condition de DCO. Nos résultats suggèrent donc que les astrocytes et les cellules microgliales jouent des rôles différents dans la douleur cancéreuse et dans la douleur neuropathique. Enfin, dans un troisième temps, nous avons cherché à mettre en évidence une implication des astrocytes dans la pathologie DCO au travers d’une caractérisation des transmissions glutamatergique et glycinergique, qui sont toutes deux fortement modulées par l’environnement astrocytaire. Par la quantification de l’expression de l’ARNm (qRT-PCR) et par dosage des taux d’acides aminés (électrophorèse capillaire), nous montrons que les principaux acteurs (transporteurs, récepteurs, agonistes et co-agonistes) de la transmission glutamatergique et glycinergique spinale ne subissent pas d’altération significative en condition de DCO. En conclusion, nous montrons que des symptômes douloureux chroniques peuvent se développer et se maintenir (1) sans signe d’astrogliose et de réactivité microgliale spinale ; et (2) sans altération de l’expression des principaux acteurs de la transmission spinale glutamatergique et glycinergique. Nos résultats invitent donc à revoir le lien très fort qui est fait actuellement entre douleur chronique et astrogliose. / The relative lack of efficiency of current treatments used to relieve bone cancer pain prompts to the identification of new molecular and/or cellular targets for the development of new therapeutic strategies. In that context, a large number of recent studies have suggested the involvement of glial cells, among which astrocytes and microglial cells, in the onset and maintenance of chronic pain symptoms. In few animal models of bone cancer pain, several authors have recently evidenced an increased glial reactivity in spinal cord dorsal horn, and demonstrated that preventing astrocytic reactivity was sufficient to reduce pain symptoms in these models. However, the exact relationship of glial reactivity with bone cancer pain symptoms remains poorly understood. In order to decipher this link, we have first studied the temporal development of pain symptoms, and characterized the degree of central sensitization in a rat model of bone cancer pain induced by the injection of mammary gland carcinoma cells (MRMT-1) in the tibial bone. Using radiologic assessment of tumor development, behavioral measurements to quantify evoked (von Frey hairs) and spontaneous (dynamic weight bearing) pain and immunodetection of Fos after non nociceptive palpation of cancer bearing limb, we demonstrate that animals injected with MRMT-1 cells gradually develop a bone tumor (first detectable 10 days after inoculation), a mechanical allodynia and hyperalgesia (first noticeable at day 10), and later on a thermal allodynia and hyperalgesia (first detectable at day 14) as well as discomfort of the injected limb (day 14) and finally central sensitization phenomenons. Second, we have investigated the presence of structural and functional markers of spinal glial reactivity in our model of bone cancer pain. Our objectives were to date the onset of spinal glial reactivity, for microglial and astrocytic cells. Using immunohistochemical approaches, we show that none of the classical markers of astrocytic and microglial reactivity can be observed during the onset and the persistent phase of bone cancer pain whereas the markerswere easily identified in a neuropathic pain model (spinal nerve ligation). Furthermore, using molecular (qRT-PCR) as well as biochemical (Bio-Plex) approaches, we show that among the 20 structural and functional markers of glial reactivity tested, only aquaporin-4 displays increased mRNA levels in bone cancer pain model. Hence, our results suggest that astrocytes and microglial cells play different roles in bone cancer and neuropathic pain. Finally, we tried to evidence the involvement of astrocytes in bone cancer pain by characterizing glutamatergic and glycinergic synaptic transmission, both of which are heavily modulated by astrocytic environment. By quantifying mRNA levels (qRT-PCR) and measuring the level of inhibitory and excitatory amino acids (capillary electrophoresis), we show that the main actors (transporters, receptors, agonists and co-agonists) of glutamatergic and glycinergic transmissions in the spinal cord do not undergo any significant alteration in bone cancer pain conditions. We conclude that chronic painful symptoms may develop and persist (1) without any sign of astrogliosis or enhanced microglial reactivity in the spinal cord, and (2) without any alteration in the expression/levels of the main actors involved in glutamatergic and glycinergic transmission. These results therefore question the strong link that is frequently made between astrogliosis and chronic pain.

Le système de l’immunité innée cérébrale (SIIC) est principalement composé des cellules microgliales. En réponse à des stimuli immuns, inflammatoires ou un trauma neurologique, la microglie s’active et produit des facteurs pro et anti-inflammatoires qui d’une part coordonnent la réponse de l’immunité innée cérébrale et d’autre part modulent l’activité neuronale et, in fine, le comportement. Plus récemment, les cellules microgliales se sont révélées jouer un rôle clé dans le développement cérébral. Ainsi, par leurs activités de phagocytose, elles participent à la maturation des réseaux neuronaux. Si l’activation du SIIC permet de défendre le tissu cérébral des agressions, l’activation prolongée des cellules microgliales a aussi des effets délétères. Ainsi, dans le cerveau adulte, la production soutenue de cytokines inflammatoires contribue au développement de pathologies neurodégénératives. Au cours du développement les stimuli inflammatoires, en perturbant l’activité des cellules microgliales conduisent à une dysfonction de circuits neuronaux qui pourrait être impliquée dans des pathologies neuropsychiatriques à composante neurodéveloppementale. La compréhension de la régulation des cellules microgliales et de leur réponse est donc capitale. L’activité microgliale repose sur ses propriétés morphologique, dynamique et sa communication avec les neurones qui impliquent des profils de synthèse de facteurs (cytokines, chemokines, facteurs de croissance, etc..) et de récepteurs particuliers, la polarisation vers un phénotype pro ou anti-inflammatoire et la phagocytose. Peu d’études ont caractérisé l’ensemble des propriétés morphofonctionnelles des cellules microgliales in vivo. Par la combinaison d’approches de FACS, immunohistochimie, microscopie confocale et reconstruction en 3D, microscopie bi-photonique et dosage des facteurs de communication, il est aujourd’hui possible de mieux caractériser ces cellules afin de comprendre leur régulation par l’environnement et l’impact (bénéfique ou délétère) sur les fonctions neuronales. L’objectif général de cette thèse a été d’étudier les propriétés morphofonctionnelles des cellules microgliales in vivo dans deux situations physiopathologiques, une inflammation induite par l’administration périphérique de lipopolysaccharide (LPS) et une déficience alimentaire en acides gras polyinsaturés (AGPI) de type n-3, connus pour leurs propriétés immunomodulatrices. La première étude nous a permis de développer des outils nécessaires à l’étude de la plasticité morphofonctionnelle de la microglie et d’apporter de nouveaux éléments de compréhension de l’impact d’une inflammation périphérique sur l’activité de ces cellules in vivo. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons montré pour la première fois que le statut alimentaire maternel en AGPI n-3 influence les propriétés morphofonctionnelles des cellules microgliales au cours du développement post-natal ainsi que l’activité des réseaux neuronaux. De façon générale, nos résultats apportent des éléments de compréhension des relations entre plasticité morphologique et fonctionnelle des cellules microgliales in vivo. / The brain innate immune system is mainly composed of microglial cells. Microglia are activated in response to an immune or inflammatory stimuli or a trauma, and then produce pro- and anti-inflammatory factors. These factors drive the innate immune response and can modulate neuronal activity and in fine, learning and memory. Recently, microglia have been shown to play a key role during brain development. Via their phagocytic activity, microglial cells can participate to neuronal networks maturation. Although brain innate immune system defends brain tissue from aggression, chronic activation of microglia can also be deleterious. In the adult brain, chronic production of inflammatory cytokines can contribute to the pathogenesis of neurodegenerative diseases. During development, inflammatory stimuli modifying microglia activity and homeostasis could lead to neuropsychiatric diseases with a neurodevelopmental origin. Understanding how microglia are regulated and how they respond to various stimuli is therefore crucial.Microglia activity is characterized by morphological and dynamic properties of microglia,by its communication with neurons by its polarization into a specific phenotype, and by their phagocytic profile. Few studies have characterized all the morphofunctional properties of microglial cells in vivo. Using a combination of approaches including FACS, immunohistochemistry, confocal microscopy, 3D reconstruction, two-photon microscopy and communication factors assays, it is now possible to better characterize these cells in order to understand their regulation by the environment and the resulting impact (beneficial or deleterious) on neuronal functions. The main goal of this thesis was to study the morphofunctional properties of microglial cells in vivo in two pathophysiological states: a peripheral inflammation induced by a peripheral injection of lipopolysaccharide (LPS) and in an n-3 PUFAs nutritional state. In the first study, we developed tools to investigate microglial morphofunctional plasticity and gained a better understanding of the impact of peripheral inflammation on the activity of these cells in vivo. In the second part of this thesis, we showed for the first time that maternal nutritional status in n-3 PUFAs affect the morphofunctional properties of microglial cells and the establishment of neural circuits during the postnatal development of the pups. Overall, our results provide new insights in the relationship between morphological and functional plasticity of microglial cells in vivo.

Les microglies, les cellules de l’immunité innée, résidentes du cerveau, sont impliquées dans la réponse inflammatoire cérébrale et le modelage des réseaux neuronaux au cours du développement. La perturbation de leurs activités par des stimuli environnementaux pouvant conduire à des altérations psychopathologiques, dans cette thèse, nous avons étudié le rôle des microglies dans les effets neurobiologiques et comportementaux d’un stimulus inflammatoire. Les travaux précédents ont révélé que l’administration de lipopolysaccharide (LPS), une endotoxine bactérienne, provoque des comportements de type dépressifs. Le rôle des microglies dans ces altérations a fait l’objet de la première étude de cette thèse (Chapitre 2). Afin de dépléter les microglies du cerveau, des souris adultes ont reçu par voie d’administration intra-hippocampique des liposomes contenant du clodronate, provoquant ainsi l’apoptose des microglies phagocytaires. L’administration de LPS active dans l’hippocampe la synthèse de cytokines pro-inflammatoires [interleukine (IL)-1b et facteur de nécrose tumorale (TNF)-a] et anti-inflammatoires (IL-10), et de l'indoleamine 2,3-dioxygénase, une enzyme impliquée dans le métabolisme du tryptophane aux activités pro-dépressives. La déplétion des microglies phagocytaires atténue les effets du LPS, à l’exception de l’IL-1b, dont l’expression est exacerbée. De plus, l’administration de clodronate prévient les effets du LPS sur les comportements de type dépressif. Dans leur ensemble, ces résultats ont révélé que les microglies phagocytaires sont impliquées dans les effets inflammatoires et comportementaux de type dépressif induits par le LPS. Nous avons ensuite étudié le rôle des microglies dans les effets comportementaux d’une inflammation maternelle précoce provoquée lors de la colonisation du cerveau fœtal par les microglies (Chapitres 3 & 4). Ainsi, nous avons administré au jour gestationnel (JG)9.5 du LPS à des souris gestantes et évalué la trajectoire développementale pré- et post-natale des microglies et du comportement de la progéniture (Chapitre 3). L’administration de LPS à JG9.5 provoque une réduction du pourcentage représenté par les microglies matures aux JG14.5 et 18.5 et des déficits comportementaux persistants à l’âge adulte avec un dimorphisme sexuel prononcé. Nous avons alors recherché à identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans les effets du LPS administré à JG9.5, en étudiant la piste de l’action des cytokines inflammatoires (Chapitre 4). Pour cela, nous nous sommes focalisé sur l’IL-1b, la cytokine inflammatoire effectrice principale de l’activité microgliale. L’expression de l'IL-1b et des cytokines associées (IL-6, TNFa et IL-10) augmente dans le plasma maternel, le placenta et le cerveau fœtal, 2 et 4 heures après l’administration de LPS. Ces changements sont accompagnés d'un phénotype microglial immature à JG18.5 et d’une réduction de la population microgliale totale au jour postnatal (JPN)9. À l’âge adulte (JPN65), nous avons observé une modification morphologique de la microglie dans plusieurs structures cérébrales. Enfin, les souris adultes, prénatalement traitées au LPS, développent des altérations des comportements de type sociaux et des comportements répétitifs. Les altérations du nombre de microglies induites par le LPS sont corrélées aux troubles comportementaux, et ce, de façon spécifique en fonction du sexe des souris. Enfin, la co-administration de l'antagoniste du récepteur de l'IL-1 et de LPS chez les femelles gestantes au JG9.5 réduit, voire prévient les effets inflammatoires et comportementaux du LPS. [...] / Recent research on microglia has uncovered a multitude of activities that extends the role of these cells well beyond their traditional function as immune sentinels. The most prominent of these newly described activities is an intricate role in neuronal network remodeling notably upon environmental challenge or during brain development, the disruption of which can result in long lasting consequences relevant to several psychopathologies. We sought, in the current thesis, to identify some of the mechanisms involved. Our initial approach was to target the immune function of microglia, based on our previous findings linking systemic immunogenic challenge with lipopolysaccharide (LPS) in mice with the development of despair-like behavior/depression. Here, we sought to identify immune mediators activated in microglia following a single systemic challenge with LPS (Chapter 2). These studies were conducted in adult mice in which phagocytic microglia were depleted using a single injection of liposomal clodronate in the CA3 region of the hippocampus. LPS challenge significantly upregulated the expression of both pro-inflammatory [interleukin (IL)-1b and tumor necrosis factor (TNF)-a] and anti-inflammatory (IL-10) cytokines compared to saline treated animals. In addition, LPS highly increased the expression of indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), an important rate limiting enzyme for metabolizing tryptophan in the brain and an established indicator of the activation of this depression mediating pathway. Clodronate-mediated depletion attenuated all of these effects apart from IL-1b expression which was further exacerbated. Behavioral assessment of the mice demonstrated a significant LPS-induced increase of immobility in the forced swim test (FST), which was prevented by clodronate. This experimental approach provided a snapshot of the role of inflammation in the development of brain dysfunction mediated by microglia. In subsequent studies (chapter 3 & 4), and in order to perform a more comprehensive, longer-term investigation of microglia activity in neurodevelopment, we utilized a prenatal infection model using LPS to activate maternal immunity at a relatively early [Gestational Day (GD)9.5] time point when microglia colonize the fetal brain to assess the impact on microglial population during development and the subsequent behavior of the progeny (Chapter 3). The results demonstrated LPS reduced the percentage of mature microglial population at GD14.5 and GD18.5 representing mid to late gestation. In addition, prenatal LPS had a significant effect on the offspring’s neonatal as well as adult behavior, with a clear divergence along sex lines in adulthood. In the final study (Chapter 4), we sought to investigate the mechanisms underlying the changes we noted in microglial development and the sexually dimorphic behavioral deficits. For this, we focused on the role played by pro-inflammatory cytokines, particularly IL-1b which represents the main effector of microglial activation following infection or injury. Detailed analysis of the expression of IL-1b and other related cytokines (IL-6, TNF-a and IL-10) revealed an increased expression of these mediators in maternal plasma, placenta and fetal brain, 2 and 4 hours after the prenatal LPS treatment. These changes were accompanied with a decreased percentage of mature microglia in the brain of embryos at GD18.5 and of total microglia population at post-natal day (PND)9. In the adult offspring (PND65), we detected an increased density and altered microglial morphology in specific higher-order structures implicated in complex behaviors, as well as altered social preference and memory and increased repetitive actions. [...]

L'inflammation chronique relayée par la glie activée contribue à la dégénérescence des neurones dopaminergiques (ND) au cours de la maladie de Parkinson (MP). L'étendue des dégâts cellulaires provoqués par la réaction inflammatoire dépend de l'efficacité des mécanismes régulateurs de l'inflammation. Les glucocorticoïdes endogènes sont des régulateurs puissants de l'inflammation agissant via le récepteur des glucocorticoïdes (GR). Notre équipe a récemment montré le rôle central du GR microglial dans la régulation de la mort neuronale dont la sévérité est corrélée à l'intensité et la durée de l'inflammation. Mon projet de thèse a été d'étudier le rôle des GR microglial et astrocytaire dans la régulation des réponses inflammatoires au cours de la dégénerescence des ND. Dans la première partie de ma thèse, nous avons effectué une analyse transcriptomique comparative de microglie ex vivo isolée de souris traitées au MPTP (modèle de parkinsonisme) et avons identifié des gènes régulés par le GR microglial, potentiellement impliqués dans l'inflammation chronique. Dans la deuxième partie de ma thèse, nous avons mis en évidence la régulation par le GR microglial de la mort neuronale induite par l'activation de TLR9. L'ADN mitochondrial endogène peut engendrer la mort neuronale en activant le TLR9, en cas de dysfonction du GR microglial. Dans la troisième partie de mon travail, nous avons démontré que le GR astrocytaire régule la survie des ND en modulant l'expression de gènes pro-inflammatoires et l'activité excessive des hémicanaux à connexine 43. Globalement, les GR microglial et astroglial jouent des rôles essentiels dans la régulation de l'inflammation aigue et chronique. / Chronic inflammation, mounted by activated glia, contributes to dopamine neuron (DN) loss, a major hallmark of Parkinson’s disease. It can be postulated that the extent of DN injury inflicted by inflammation is affected by the efficacy of regulatory mechanisms. The activation of hypothalamic–pituitary–adrenal axis results in release of glucocorticoids, which activate glucocorticoid receptor (GR). GR exerts adaptive responses including resolution of inflammation to restore the homeostatic state. We previously demonstrated the role of microglial GR in regulating the intensity and duration of inflammation, which influences DN survival. My thesis was centered on dissecting the roles of microglial and astrocytic GR during DN degeneration in experimental Parkinsonism. In the first part of my thesis, we conducted comparative transcriptome experiments of ex vivo microglia acutely isolated from mice treated with MPTP (model of parkinsonism) and identified genes and pathways in microglia regulated by GR, potentially involved in chronic inflammation in PD. In the second part of my thesis, we found that microglial GR regulates Toll-Like Receptor 9-induced DN loss by regulating the lysosomal compartment and demonstrated that diminished sensitivity of GR in microglia creates a permissive environment for TLR9 activation by endogenous mitochondrial DNA to become lethal for DNs. In the third part of my work, we showed that during DN degeneration, astrocytic GR regulates inflammatory gene expression and prevents connexin-43 hemichannel activity that contributes to DN loss. Overall, both microglial and astrocytic GR play essential roles in regulating chronic and acute inflammation.

L’adrénoleucodystrophie liée à l’X (X-ALD) est une maladie neurodégénérative sévère caractérisée par une accumulation d’acides gras à très longue chaîne (AGTLC), conséquence d’un défaut de β-oxydation peroxysomale. La maladie est associée à l’absence de la protéine ABCD1, transporteur ABC du peroxysome qui, tout comme son homologue le plus proche, ABCD2, participe à l’import des AGTLC-CoA au sein du peroxysome, l’unique site de leur dégradation par β-oxydation. La compréhension des mécanismes physiopathologiques est aujourd’hui limitée par le manque de modèles expérimentaux pertinents, cellulaires ou animaux. Puisque le défaut peroxysomal dans la microglie apparait comme un événement pathogénique majeur, nous avons généré des lignées de cellules microgliales incapable de transporter et/ou β-oxyder les AGTLC au sein du peroxysome. Quatre lignées cellulaires microgliales BV-2 déficientes en ABCD1, ABCD2, ABCD1 et ABCD2 ou ACOX1 (l’enzyme limitante de la β-oxydation peroxysomale) ont ainsi été générées par édition génique par CRISPR-Cas9. Ces cellules déficientes présentent d’importants défauts biochimiques, une accumulation d’AGTLC mais aussi des changements des contenus en acides gras et cholestérol. Les analyses ultrastructurales effectuées démontrent l’existence d’importantes inclusions lipidiques et indiquent également une augmentation du nombre de peroxysomes et mitochondries dans ces cellules. Les profils transcriptomiques signalent des altérations de la plasticité de ces cellules microgliales et de leur capacité de reprogrammation métabolique en réponse à un stimulus inflammatoire. Les fonctions de phagocytose ou de présentation antigénique des cellules microgliales semblent être affectées par le défaut peroxysomal. Enfin, les résultats obtenus à l’aide de ces modèles suggèrent que l’altération du métabolisme lipidique peroxysomal modifie l’organisation des membranes cellulaires. Ces lignées cellulaires apparaissent donc comme des modèles prometteurs, d’un grand intérêt pour la compréhension de la physiopathologie et l’identification de cibles thérapeutiques de cette maladie neurodégénérative complexe. / X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD) is a severe neurodegenerative disorder characterized by very-long-chain fatty acid (VLCFA) accumulation resulting from a peroxisomal β-oxidation defect. The disease is caused by mutations in the ABCD1 gene, which encodes for a peroxisomal half ABC transporter predicted, like its closest homologue ABCD2, to participate in the entry of VLCFA-CoA into the peroxisome, the unique site of their β-oxidation. Progress in understanding the physiopathogenesis of X-ALD suffers from the lack of appropriate cell and animal models. Since peroxisomal defects in microglia seem to be a key element of the onset of the disease, we generated four microglial cell lines unable to transport and/or β-oxidize VLCFA into the peroxisome. BV-2 microglial cells were engineered with CRISPR-Cas9 to generate four microglial cell lines deficient in ABCD1, ABCD2, both ABCD1 and ABCD2 or ACOX-1 (the first rate-limiting enzyme of the peroxisomal β-oxidation system). Biochemical defects and lipid content changes associated with VLCFA accumulation but also fatty acids and cholesterol changes were identified in deficient microglia. Ultrastructural investigations confirmed cytosolic lipid inclusions and an increased number of peroxisome and mitochondria. Transcriptomic profiles of deficient microglia are indicative of an impaired plasticity and an impaired capacity to operate the metabolic shift required upon an inflammatory stimulation. Peroxisomal defect is likely to affect phagocytosis and antigen presentation capacity of microglia. Peroxisomal lipid metabolism defect is also suggested to modify cell membranes organization. Altogether, these novel mutant cell lines represent a promising model that should permit identification of new therapeutic targets for this complex neurodegenerative disease.