Chez les patients atteints de sclérose en plaques (SEP), l'inflammation induit une demyélinisation et une mort neuronale. La capacité de remyélinisation, hétérogène chez les patients, est intimement corrélée à la sévérité des symptômes. Les raisons de cette hétérogénéité ne sont pas connues, principalement car ce mécanisme n'a jamais été étudié dans un contexte expérimental approprié. Afin d'y remédier, nous avons développé un nouveau modèle en combinant une démyélinisation focale chez des souris nude à une greffe de lymphocytes (LT) provenant de donneurs sains ou de patients SEP. Cette modèle nous a permis de reproduire l'hétérogénéité de remyélinisation. En comparant le profil de sécrétion des patients selon leur capacité de réparation, nous avons mis en évidence des différences dans celui-ci, qui induisait selon le cas une activation bénéfique ou délétère des microglies ayant pour conséquence une différentiation efficace ou entravée des cellules précurseur d'oligodendrocytes. Cette capacité hétérogène des LT à répondre à une stimulation est partiellement expliqué par le background génétique du patients : les patients porteurs de variants associés à des gènes impliqués dans la fonction des LT folliculaires et des LT CD4+ naïfs induisaient un défaut de remyélinisation lorsque greffés dans une lésion démyélinisée, et ce en dirigeant l'activation microgliale vers un phénotype délétère. En résumé, les LT dirigent l'activation microgliale lors de la remyélinisation et sont donc au moins partiellement responsables de l'échec ou de la réussite de ce mécanisme. La façon dont ils réagissent à la démyélinisation est au moins en partie due au patrimoine génétique du patient. / Inflammation in the central nervous system leads to demyelination and neurodegeneration in patients with multiple sclerosis (MS). MS severity is closely correlated with the efficacy of myelin repair, a process whose effectiveness is very heterogeneous among patients. The reasons of this heterogeneity are largely unknown, mainly because it has never been addressed in a humanized pathological context. To tackle this question, we developed a new model combining focal demyelination in nude mice and graft of MS or healthy donor (HD) lymphocytes (LT). We were able to reproduce partially remyelination heterogeneity. Comparing the secretory profile of patients LT according to their repair capacities, we highlighted an heterogeneous cytokine response leading to a differential microglial (MIG) activation and ultimately an efficient or inefficient maturation of precursor cells during remyelination. To decipher why LT from patients display an heterogeneous response, we hypothesized that the genetic variants known for MS susceptibility could also drive disease severity by influencing LT functions. We found that the interaction of variants associated with genes responsible for T Folicular Helper and naïve Th0 cells functions induce the secretion by patient LT induce a pro-inflammatory activation in MIG, leading to remyelination failure.LT orchestrate MIG activation and are therefore responsible for the success or failure of remyelination. Capitalizing on patients with high repair capacities to understand the cellular and molecular actors leading to successful remyelination in pathological conditions seem to be a key approach to develop therapeutical targets.

Les macrophages primitifs envahissent la moelle épinière dès E11.5-12.5 chez l'embryon de souris. Ces cellules interagissent avec les neurites spinaux en croissance des neurones sensoriels des ganglions de la racine dorsale dès E12.5. La microglie est connue pour réguler plusieurs processus développementaux dans le système nerveux central, mais leur rôle dans le développement du système nerveux périphérique reste inconnu. Nous montrons que les macrophages primitifs régulent le développement des neurones sensoriels dans l'embryon de souris. Nous avons d'abord découvert que les macrophages primitifs interagissent avec les neurites périphériques des neurones sensoriels dès E11.5. Nous avons ensuite démontré que l'absence de macrophage chez les souris PU.1KO ou leur ablation immunopharmacologique, entraînait une réduction initiale des neuronaux TrkB+ et TrkC+ à E11.5, suivie d'une augmentation transitoire de leur nombre à E12.5. Cette augmentation est associée à une augmentation transitoire de leur mort développementale ce qui expliquerait pourquoi leur nombre redevient normal à partir de E13.5. Chez les embryons dépourvus de macrophage la mort augmente à nouveau à E15.5 pour les neurones TrkC+ et dès E14.5 pour les neurones TrkB+. Concernant les neurones TrkA+, leur nombre reste déficitaire entre E12.5 et E15.5, bien que leur mort développementale ne soit pas affectée. Nous avons enfin montré que la prolifération cellulaire était diminuée à E12.5 dans les ganglions des souris PU.1KO. Ces résultats sont la première démonstration que les macrophages primitifs et/ou les microglies immatures peuvent aussi réguler le développement embryonnaire du système nerveux périphérique. / The primitive macrophages invade the spinal cord as early as E11.5-12.5 in the mouse embryo. These cells interact with growing spinal neurites of the dorsal root ganglia sensory neurons as early as E12.5. Microglia is known to regulate several developmental processes in the central nervous system, but their role in the development of the peripheral nervous system remains unknown. We show that primitive macrophages regulate the development of sensory neurons in the mouse embryo. We first discovered that primitive macrophages interact with peripheral neurites of sensory neurons as early as E11.5. We then demonstrated that the absence of macrophage in PU.1KO mice or their immunopharmacological ablation resulted in an initial reduction of TrkB+ and TrkC+ neurons at E11.5, followed by a transient increase in their number at E12.5. This increase is associated with a transient increase in their developmental death which would explain why their numbers become normal again from E13.5. In macrophage-free embryos, death increases again to E15.5 for TrkC+ neurons and as early as E14.5 for TrkB+ neurons. Concerning TrkA+ neurons, their number remains deficient between E12.5 and E15.5, although their developmental death is not affected. We have finally shown that cell proliferation was decreased at E12.5 in ganglions of PU.1KO mice. These results are the first demonstration that primitive macrophages and / or immature microglia can also regulate the embryonic development of the peripheral nervous system.

Au cours de ma thèse, j'ai observé que la microglie est nécessaire à la maturation des circuits hippocampaux par la formation de boutons multi-synaptiques. J'ai également étudié la mécanique d'élimination des synapses, et observé que la microglie n'élimine pas directement les compartiments post-synaptiques. En revanche, elle contacte spécifiquement et rapidement certaines épines, en induisant un étirement de la tête de l'épine. Les petites épines sont préférentiellement contactées, et leur proximité avec les compartiments phagocytiques de la microglie suggère qu'elles pourraient être digérées sans être détachées du dendrite auquel elles appartiennent. Enfin, le système du complément n'est pas requis pour la reconnaissance ni les interactions entre microglie et épines, mais semble nécessaire à leur maturation. / During my thesis, I found that microglia is necessary for the maturation of hippocampalcircuits through the formation of multiple synapse boutons. I investigated how microgliacould mechanistically eliminate synapses, and found that microglia do not eliminate entirepost-synaptic spines but instead make fast and specific contacts that often result in spinehead stretching. Small, immature spines are preferentially targeted by microglia, and theirproximity to phagocytic compartment suggests that microglia could subtly erode themwithout to challenge their attachment to the dendritic shaft. Last, the complement system isnot necessary for recognition and interaction of microglia with spines, however seemsnecessary for proper maturation of post-synaptic spines.

Le cerveau est très riche en acide docosahexaénoique (DHA, acide gras polyinsaturé (AGPI) n-3) et en acide arachidonique (AGPI n-6) qui sont de puissants immunomodulateurs. Ils pourraient être impliqués dans le contrôle de la neuroinflammation via leur conversion en dérivés lipidiques bioactifs. Dans ce contexte, notre objectif était de définir le rôle des médiateurs lipidiques dérivés des AGPI n-3 possédant des propriétés anti-inflammatoires et pro-résolutives dans la régulation de l’inflammation au niveau du cerveau. Nous avons d’abord caractérisé l’impact d’une modulation nutritionnelle en AGPI n-3 sur la composition lipidique cérébrale. Dans un modèle d’inflammation cérébrale, la consommation d’AGPI n-3 induit 1) une augmentation des métabolites lipidiques dérivés des AGPI n-3, 2) une diminution des métabolites lipidiques dérivés des AGPI n-6, et 3) une diminution de l’inflammation dans l’hippocampe. De plus, un apport en AGPI n-3 au cours de la période périnatale n’affecte pas la composition lipidique des cellules immunitaires du cerveau, les cellules microgliales. Ensuite, nous avons choisi une approche thérapeutique afin de démontrer in vitro dans un modèle de cellules microgliales que la RvD1, dérivée du DHA, en se fixant à son récepteur ALX/Fpr2, atténue l’inflammation via la régulation de la voie NFκB et de microARN. In vivo, l’injection i.c.v. de la RvD1 et du DHA atténue l’inflammation dans l’hippocampe par des processus différents. Les dérivés lipidiques bioactifs issus des AGPI n-3 pourraient être les médiateurs par lesquels les AGPI n-3 exercent leur effet bénéfique sur la régulation de l’inflammation au niveau du cerveau, la RvD1 étant fortement impliquée. / The brain is highly enriched in docosahexaenoic acid (DHA, n-3 polyunsaturated fatty acid, PUFA) and in arachidonic acid (n-6 PUFA) that are strong immunomodulators. They could be involved in the regulation of neuroinflammation through their conversion into bioactive lipid derivatives. Then, our objective was to define the role of n-3 PUFA derived lipid mediators that have anti-inflammatory and pro-resolutive properties in the regulation of brain inflammation. First, we characterized the impact of dietary n-3 PUFA modulation on brain lipid composition. In a central inflammatory model, n-3 PUFA intake induced 1) an increase in n-3 PUFA-derived lipid mediators, 2) a decrease in n-6 PUFA-derived lipid mediators, and 3) a decrease in inflammation in the hippocampus. Moreover, n-3 PUFA intake during the perinatal period did not affect lipid composition of brain immune microglial cells. Then, we chose a therapeutic approach to demonstrate in vitro in microglial cells that RvD1 derived from DHA, through the binding on its receptor ALX-Fpr2, attenuated inflammation via the regulation of NFκB pathway and microRNA expressions. In vivo, intracerebral injection of RvD1 and DHA reduced inflammation in the hippocampus by different pathways. Thus, the bioactive lipid derivatives from n-3 PUFA could be the mediators by which n-3 PUFA exert their beneficial effects on neuroinflammation, RvD1 playing a crucial role in this regulation.

Les cellules microgliales constituent la population de macrophages résidents du système nerveux central. De par leur appartenance au système immunitaire, elles furent longtemps considérées actives uniquement en conditions pathologiques. Au contraire, ces dernières décennies, elles sont apparues comme physiologiquement actives, notamment au cours de la période critique de formation du système nerveux central. Au cours du développement embryonnaire et postnatal, les neurones nouvellement générés migrent vers leur position définitive avant de développer leur arbre dendritique et axonal afin de former les connexions synaptiques à la base des réseaux nécessaires aux fonctions cérébrales. L'étude des microglies au cours de la période postnatale, a montré l'implication d'un mode de communication spécifique entre les neurones et la microglie, la voie Fractalkine/CX3CR1, dans la mise en place des cellules microgliales d'une part et dans le développement synaptique glutamatergique d'autre part. Cependant, l'importance de cette communication neurone-microglie pour le développement du système inhibiteur GABAergique est peu connue. Au cours de mon travail de thèse, je me suis intéressée au rôle de la voie de communication FractalKine/CX3CR1 dans la distribution des cellules microgliales et le développement postnatal du réseau GABAergique de l'Hippocampe. Nous avons ainsi montré que la suppression du récepteur microglial CX3CR1 induit une diminution du nombre de microglies dans la région CA3 de l'Hippocampe, dans une fenêtre temporelle précise entre 7 et 2 jours après la naissance. Cette diminution du nombre de microglies est corrélée avec une altération de l'activité de réseau au niveau de cette région. En effet, la fréquence des GDPs (Giant Depolarizing Potentials), une activité de réseau impliquée dans la formation et la maturation des synapses et spécifiquement générée en CA3, est diminuée à la fin de la première semaine postnatale. De plus, malgré l'absence de modification majeure de l'activité synaptique glutamatergique et GABAergique, les évènements postsynaptiques GABAergiques présentent une sous population d'évènements plus amples et des cinétiques légèrement plus rapides, pouvant suggérer une modification de la population d'interneurones mis en jeu. L'ensemble de mon travail de thèse met en évidence l'impact de la communication neurone-microglie par la voie Fractalkine/CX3CR1 sur le développement postnatal de l'Hippocampe Son absence affecte d'une part, la colonisation microgliale, et d'autre part, une activité de réseau caractéristique de l'Hippocampe, dans une fenêtre temporelle critique pour la mise en place des connexions synaptiques et la formation des réseaux neuronaux . / Microglial cells, the resident macrophages of the central nervous system, were mainly studied for their role in pathological conditions, but they recently appeared to be involved in synaptic development and circuits formation during postnatal period. During this critical period, microglial cells colonize the central nervous system and interact with other cell types, including neurons. A specific way of communication between neurons and microglia involves neuronal released fractalkine (CX3CL1) and its specific microglial receptor CX3CR1. CX3CR1 KO mice contributed to unclose microglial role during development. Indeed, CX3CR1 ablation alters microglia distribution in the brain, and it affects glutamatergic transmission and synapse maturation. However, these effects seem to be transient and brain region specific and their mechanisms are poorly understood. Furthermore, some effects observed in juvenile or adult mice may have origin during development, when neuronal connections are established. GABA plays a fundamental role in this process since it is excitatory The influence of neuron.microglia interaction on neuronal activity in the hippocampus during this period is poorly understood. In particular, nothing is known on GABAergic activity, known to be synaptogenic during this period My PhD project aimed at investigating how the signaling fractalkine pathway impacts microglial coloniation of the hippocampus and neuronal activity during the first two postnatal weeks. Our results indicate that in CX3XR1KO mice there is a reduction in the density of microglial cells at P7-P9 in the CA3 hippocampal area, accompanied at P7 by a significant reduction of frequency of Giant Depolarizing Potentials (GDPs), a network activity involved in hippocampal synapse formation and maturation Furthermore, despite no overall difference in glutamatergic or GABAergic synaptic activity, GABAergic events display a subpopulation of larger events, and the kinetics was slightly faster. Thus, the disruption of the specific neuronal.microglia signaling pathway on one hand impacts the microglia coloniation of the hippocampus and on the other hands affects specifically neuronal network activity during a time window critical for the establishment of neuronal connections.

La formation des circuits cérébraux, dont l’altération est associée à divers troubles neurologiques et psychiatriques, commence pendant l’embryogenèse. Les microglies sont les macrophages du cerveau et répondent à une inflammation ou une infection par une production de facteurs et une phagocytose active. En plus de leurs fonctions immunitaires, ces cellules ont été récemment impliquées dans l’émergence de troubles associés à des maladies neurodéveloppementales. Elles agissent également sur le remodelage post-natal des circuits neuronaux en phagocytant des synapses et des neurones immatures. Étant donné que les microglies colonisent précocement le cerveau embryonnaire, elles pourraient également participer au développement cérébral précoce. Mes travaux de thèse ont montré que les microglies embryonnaires, par le biais d’une localisation hétérogène, modulent la formation du cerveau antérieur. En effet, l’étude phénotypique comparative in vivo de modèles murins dans lesquels les microglies sont absentes ou leurs fonctions perturbées montrent des défauts de positionnement d’interneurones corticaux et de progression des axones dopaminergiques. De plus, les microglies sont impliquées dans la progression d’un autre faisceau axonal, la capsule externe. Après avoir observé une association très forte entre les microglies et des axones spécifiques, j’ai utilisé deux approches ex vivo et in vivo afin de déterminer si les microglies pourraient agir par phagocytose. Mes résultats montrent que malgré la présence de caractéristiques morphologiques phagocytaires, les microglies ne phagocytent pas les axones de manière intense. Ces travaux suggèrent ainsi que la phagocytose des axones à elle seule ne peut pas expliquer les rôles des microglies sur la croissance axonale. Ce travail, qui montre un rôle anténatal des microglies, révèle une interaction nouvelle entre le développement des systèmes nerveux et immunitaires, et ouvre des perspectives nouvelles pour l’étude sur les mécanismes contrôlant la formation du cerveau en condition physiologique et pathologique. / Brain functioning relies on complex neural circuits that are built during embryogenesis and defects in this process can lead to neurologic or psychiatric disorders. Microglia are the brain resident macrophages, which respond to inflammation and infection by active phagocytosis and secretion of various molecules. In addition to these immune-related functions, microglia were recently involved in the onset of several neuropsychiatric disorders, as well as in postnatal neuronal plasticity, notably through the phagocytosis of developing neurons and synapses. Since microglia colonize the brain during early embryogenesis, they might also participate to the elaboration of neural networks. Here, we reveal that embryonic microglia, via a heterogeneous localization, are modulators of forebrain wiring. Using a cross-comparative analysis of phenotypes induced by either an absence or a perturbation of microglia activity, we showed that microglia directly regulate interneuron positioning as well as dopaminergic axons outgrowth. Moreover, microglia are involved in the formation of another tract, the external capsule. Having observed a strong association between microglia and axons, we combined ex vivo and in vivo approaches in order to decipher whether microglia could act by means of phagocytosis. Despite showing some clear morphological features of intense phagocytosis, our results suggest that microglia do not perform active phagocytosis of axons in vivo. Thus, the phagocytic activity of embryonic microglia by itself is unlikely to explain their role on axonal progression. This study shows for the first time an early prenatal role for microglia and reveal a novel interplay between the central and nervous systems during embryonic development.

Alors que les synapses sont des structures relativement stables, les éléments qui la composent sont, eux, en permanent échange dans le temps et dans l'espace. Les composants des densités postsynaptiques sont renouvelés avec des cinétiques caractéristiques de chaque molécule et de chaque sous compartiment synaptique. La compatibilité entre le comportement dynamique des composants de la synapse et son maintien structural et fonctionnel à long terme implique une conception de ces assemblages multimoléculaires en équilibre dynamique. De nombreux paramètres peuvent influencer la dynamique des récepteurs aux neurotransmetteurs (RNT) dans les synapses, y compris l'activité synaptique et les protéines de la matrice extracellulaire. Cependant, le rôle des cellules gliales dans ce mécanisme est inconnu. Mon travail de thèse a porté sur l'exploration d'une possible contribution de la microglie, les cellules immunitaires du système nerveux central, à la stabilité des RNT et à l'efficacité des synapses inhibitrices de la moelle épinière. Mon travail de thèse démontre pour la première fois comment et en quoi la microglie est un partenaire clé de l'équilibre dynamique qui régit la structure et la fonction de la synapse inhibitrice dans la moelle. Par conséquent, il donne un éclairage nouveau sur la façon de concevoir l'efficacité synaptique et sa régulation de façon non neurone autonome. / Whereas synapses are relatively stable structures, their molecular constituents are continuously recycled and exchanged in time and space. Each of the molecules that contribute to build synaptic structures is renewed with specific kinetics, depending on their organisation in the postsynaptic densities. The compatibility between a dynamic behaviour and a long-term maintenance of synapses implies to think synapses as multi-molecular assemblies in a dynamic equilibrium. Several parameters can influence the dynamics of receptors to neurotransmitters(RNT) at synaptic sites, including neuronal activity and extracellular matrix proteins. However,the role of glial cells in this mechanism is unknown. During my thesis work, I explored the roleof microglia, the resident immune cells of the central nervous system, on the lateral diffusion ofRNT and synaptic efficacy at spinal cord inhibitory postsynaptic densities. My work demonstrates for the first time a partnership between microglia and synapses. It shows that immune cells can take part to the regulation of synaptic strength very rapidly but also at basal state, by regulating RNT dynamics. Furthermore it identifies microglia as a key partner for a heterocellular stabilization of synaptic receptors. This work raises the intriguing possibility that the general regulation of network activity may also be explained by a fine modulation of receptors stability at the synapse controlled by microglia.

La douleur chronique est une pathologie invalidante de longue durée notamment caractériséepar trois symptômes : l’allodynie (un stimulus non douloureux est perçu comme douloureux),l’hyperalgésie (un stimulus douloureux est perçu comme encore plus douloureux) et desdouleurs ambulatoires. Quand cette douleur est due à une lésion ou une dysfonction du systèmenerveux on parle de douleur neuropathique. Chez les patients et les modèles animaux dedouleurs neuropathiques, les études ont montré que les neurones thalamiques étaienthyperexcitables. Les cellules gliales, astrocytes et microglies, sont des partenaires synaptiquesimpliqués dans la transmission et la plasticité synaptique et pourraient être impliqués dans cephénomène. En effet, ces cellules peuvent modifier leur phénotype lorsque le système nerveuxest affecté, elles sont réactives : leur morphologie est hypertrophiée, l’expression d’ARNm et deprotéines comme iba-1 (ionized binding-adaptor molecule 1) et CD11b/c (cluster ofdifferentiation 11b/c) pour les cellules microgliales et GFAP (glial fibrillary acidic protein) etS100β (S100 calcium binding protein β) pour les cellules astrocytaires est augmentée. Ellespeuvent également libérer des molécules pro-inflammatoires. Tout ceci pourrait générer ouamplifier l’hyperexcitabilité des neurones présents dans le thalamus.Mon travail de thèse a consisté en l’étude des astrocytes et de la microglie thalamique dans lemodèle de douleurs neuropathiques de ligature des nerfs spinaux L5-L6 du nerf sciatique (spinalnerve ligation, SNL). Les symptômes d’allodynie et d’hyperalgésie mécaniques ont étécaractérisés par le test des filaments de von Frey et les douleurs ambulatoires par le test dedistribution pondéral dynamique. L’expression des ARNm de marqueurs gliaux a été étudiée parune approche de qRT-PCR sur des prélèvements thalamiques et sur des noyaux thalamiquesobtenus par microdissection au laser. L’expression neurochimique des marqueurs iba-1,CD11b/c, Cathepsine S, GFAP et S100β a été étudié par immunohistofluorescence en quantifiantle nombre de cellules immunopositives et la surface occupée par les marqueurs. Toutes cesexpériences ont été réalisées à J14 et J28 après la chirurgie.A J14, les animaux SNL développent des symptômes d’allodynie et d’hyperalgésie mécaniqueainsi que des douleurs ambulatoires. Chez ces animaux, les cellules microgliales thalamiquesprésentent des signes de réactivité avec l’augmentation de l’expression des ARNm desmarqueurs CTSS et CX3CR1, le récepteur de la fractalkine, marqueurs connus pour leursimplications dans l’hyperexcitabilité neuronale spinale en conditions de douleursneuropathiques. De plus, l’expression neurochimique des marqueurs gliaux étudiés est diminuéece qui se traduit notamment par une diminution du nombre de cellules immunopositives pources marqueurs chez les animaux SNL. A J28, les symptômes douloureux sont maintenus. De plus,la réactivité microgliale décelée à J14 par qRT-PCR est toujours présente avec l’augmentation del’expression de l’ARNm codant pour la fractalkine (CX3CL1), partenaire de la voieCTSS/CX3CR1/CX3CL1. La diminution de l’expression neurochimique thalamique desmarqueurs gliaux chez les animaux SNL était transitoire et n’est plus présente à J28. Enrevanche, des signes de réactivité astrocytaire thalamique ont été mis en évidence chez lesanimaux SNL.Ainsi, ce travail dévoile une ambivalence au niveau des altérations de la glie thalamique dans cemodèle SNL: une diminution précoce de l’expression des marqueurs gliaux thalamiques suivied’une réactivité astrocytaire plus tardive concomitante à des signes de réactivité microgliale. Denombreuses expériences sont encore nécessaires pour appréhender l’impact de cetteambivalence gliale thalamique inédite dans un contexte de douleur neuropathique. / Chronic pain is an incapacitating and long lasting pathology mainly characterized by threesymptoms: allodynia (a non painful stimulus is perceived as painful), hyperalgesia (a painfulstimulus is perceived as more painful) and ambulatory pains. When chronic pain is due to alesion or dysfunction of nervous system it is called neuropathic pain. In both patients and animalmodels of neuropathic pain, researchers found that thalamic neurons are hyperexcitable. Glialcells, astrocytes and microglia, are strong synaptic partners involved in synaptic transmissionand plasticity and therefore could be involved in this phenomenon. Indeed, these cells canmodify their phenotype when nervous system is damaged. They become reactive: theirmorphology is hypertrophied, mRNA and protein expression of iba-1 (ionized binding-adaptormolecule 1) and CD11b/c (cluster of differentiation 11b/c) for microglia and GFAP (glialfibrillary acidic protein) and S100β (S100 calcium binding protein β) for astrocytes is increased.They could also release pro-inflammatory molecules. All of these could contribute to generate oramplify the thalamic neuronal hyperexcitability.In my PhD work I studied thalamic astrocytes and microglia in a rat neuropathic pain model ofL5-L6 spinal nerves ligation (SNL). Mechanical allodynia and hyperalgesia were characterizedwith von Frey filament test and ambulatory pain with dynamic weight bearing apparatus. mRNAexpression of glial markers were studied with qRT-PCR technique on thalamic punches andlaser-microdissected nuclei. Neurochemical expressions of iba-1, CD11b/c, cathepsin S, GFAPand S100β markers were quantified using an immunohistofluorescence approach to count thenumber of immunopositive cells and surface stained by these markers. All these experimentswere done at D14 and D28 after surgery.At D14, SNL animals develop mechanical allodynia and hyperalgesia as well as ambulatory pain..For these animals, thalamic microglial cells showed signs of reactivity with the increase mRNAexpression of CTSS and CX3CR1, fractalkine receptor, well known markers involved in spinalneuronal hyperexcitability under neuropathic pain conditions. In addition, the number ofimmunopositive cells for the glial markers is decreased in SNL animals. At D28, the neuropathicpain symptoms are still present. Furthermore, thalamic microglial reactivity found at D14 withqRT-PCRm method is still present with the increased mRNA expression of fractalkine (CX3CL1),partner of CTSS/CX3CR1/CX3CL1 pathway. The decreased neurochemical expression of glialmarkers found at D14 was transient as I didn’t find this result at D28. However, thalamicastrocytic reactivity was found at D28 in SNL animals.So, this work reveal a new glial process at thalamic level in this SNL model of neuropathic pain :an early decreased expression of glial markers and then a later thalamic astrocytic reactivityconcomitant with signs of thalamic microglial reactivity. Numerous studies are required toexplore the role of such novel ambivalent glial alterations in the context of neuropathic pain.

Le virus herpès simplex de type 1 (VHS-1) est la principale cause d'encéphalite virale sporadique dans les pays développés. L'incidence annuelle de l'encéphalite herpétique est de 2 à 4 cas par million d'individus. Cette infection dévastatrice peut atteindre des taux de mortalité de 30% malgré l'administration d'un traitement antiviral à base d'acyclovir. De plus, chez certains patients qui survivent à l'infection, cette maladie peut laisser des séquelles neurologiques graves et permanentes. Le VHS-1 induit une forte réponse inflammatoire cérébrale par l'activation des composantes de la réponse immunitaire innée qui, par la suite, met en place la voie de déclenchement de la réponse adaptative. Bien que cette réponse inflammatoire soit importante pour contrôler la replication du virus, elle peut, si elle est exacerbée, causer des dommages au niveau du système nerveux central (SNC). La compréhension du rôle joué par les microglies (macrophages résidents dans le SNC) et par les monocytes périphériques (dans le sang) recrutés au niveau du cerveau pour élaborer cette réponse immunitaire innée pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Celles-ci pourraient ouvrir la porte au développement de nouvelles stratégies combinant un antiviral à un agent immunomodulateur pour contrôler à la fois la propagation du virus et l'état inflammatoire du SNC au cours de l'encéphalite herpétique. Les travaux présentés dans le cadre de ce mémoire portent sur l'étude de l'implication des microglies et des monocytes périphériques recrutés au niveau du cerveau dans la réponse immunitaire innée développée dans un modèle murin d'encéphalite herpétique. Pour atteindre nos objectifs, nous avons d'abord utilisé des souris chimériques dont les précurseurs myéloïdes périphériques dérivés de la moelle osseuse expriment la protéine fluorescente verte (GFP). Nous avons ensuite évalué l'impact de la déficience de deux récepteurs de chimiokines exprimés à la surface des monocytes/macrophages, CCR2 et CX3CR1, sur la survie des souris ainsi que sur le recrutement des deux sous-types de monocytes sanguins, les monocytes "inflammatoires" et "circulants", au cours de l'encéphalite herpétique.

Les infections au virus herpès simplex I (VHS-1) sont souvent bénignes mais peuvent être responsables de pathologies sévères, telle que l'infection du système nerveux central, telle que l'encéphalite herpétique (EH). Cette dernière représente l'encéphalite virale sporadique la plus répandue dans les pays développés. Malgré la disponibilité des antiviraux, le taux de mortalité est de plus que 30%. De plus, la majorité des survivants souffrent des séquelles neurologiques. Le mécanisme par lequel l'encéphalite herpétique est létale n'est pas encore clairement établi. Bien que la réplication virale cause des dommages importants, de plus en plus d'évidences suggèrent que l'inflammation induite en réponse à l'infection joue également un rôle dans la pathogénèse de cette maladie. L'hypothèse principale de notre équipe est que la réponse immunitaire cérébrale innée induite au cours de cette infection est une arme à double tranchant car elle est critique pour contenir la réplication virale dans le cerveau durant la phase précoce de la maladie, mais si elle est incontrôlée, elle peut résulter en une réponse inflammatoire exacerbée qui peut être néfaste. Les microglies sont les seules cellules immunitaires résidentes du cerveau. Plusieurs études ont rapporté que ces cellules qui forment la première ligne de défense, jouaient un rôle clé dans le contrôle des infections du SNC. En revanche, la microglie réactive semblerait contribuer à la neuroinflammation. De plus, il est proposé que ces microglies réactives participent à la perturbation de la barrière hématoencéphalique au cours de l'EH, que nous avons également pu constater chez la souris BALB/c infectée par la voie intranasale, décrite dans la première partie de nos travaux. Cependant, le rôle exact des microglies dans l'EH n'a pas encore été élucidé. Alors, nous avons décidé de mener des travaux dans le but de comprendre l'implication des microglies dans le contrôle de l'EH et de caractériser les mécanismes exploités par ces cellules. Pour atteindre nos objectifs, nous avons d'abord évalué l'effet de l'activation des microglies par le « macrophage colony-stimulating factor » (M-CSF) administré avant l'infection. Ce traitement a significativement augmenté la survie des souris et diminué les titres viraux cérébraux au J6 p.i. En parallèle, l'augmentation du nombre de microglies CD68⁺ observée dans les cerveaux des souris traitées avec du M-CSF a mené à l'hypothèse que la microglie CSF1R⁺ était responsable de cette amélioration du pronostic de l'EH. Pour répondre à cette question, nous avons déplété la microglie chez des souris CSF1R-loxP-CX3CR1-cre/ERT2. Le taux de survie réduit et des titres viraux cérébraux plus élevés pour ces souris déplétées des microglies ont souligné l'importance de la réponse microgliale dans la phase précoce de l'infection. Suivant ces observations, les mécanismes impliqués dans la réponse immunitaire microgliale au cours de l'EH ont été étudiés à l'aide de la microscopie électronique et du séquençage d'ARNm sur une cellule unique. Dans cette partie, nous avons étudié uniquement les microglies situées dans le noyau postéro-ventral (VPL, pour « Ventral posterolateral nucleus »), qui a été identifié, à l'aide du VHS-1 recombinant neurovirulent que nous avons décrit dans la première partie des travaux, comme la région la plus infectée du cerveau chez des souris C57BL/6 au J6 p.i. Nos analyses ont confirmé que ces cellules limitaient l'infection à l'aide de la phagocytose et de la présentation d'antigènes. En outre, nous avons pu décrire une nouvelle réponse transcriptionnelle, associée à une population cellulaire rare, que nous avons appelées des microglies « en transition ». L'expression élevée des transcrits viraux par ces cellules pourrait correspondre à la réponse immunitaire antivirale intrinsèque des microglies infectées par le VHS-1 dans le VPL. Enfin, l'analyse de ce transcriptome révélant l'augmentation d'expression des gènes impliqués dans la production d'interleukine IL-1β médiée par l'inflammasome NLRP (pour « Nucleotide-binding oligomerization domain, Leucine rich Repeat and Pyrin domain containing ») 3, a suggéré que ces microglies « en transition » infectées favoriseraient l'exacerbation de l'inflammation au cours de l'EH L'ensemble de nos données montrent que les microglies sont nécessaires en phase précoce pour un meilleure contrôle de l'EH. Ceci peut évoluer vers un phénotype pro-inflammatoire et contribuer ensuite à l'exacerbation de l'inflammation. De plus, nos résultats suggèrent que l'infection de ces microglies du VPL par le VHS-1 pourrait ainsi induire l'acquisition de cette réponse transcriptionelle pro-inflammatoire. / Herpes simplex virus I (HSV-1) infections are often mild, but can be responsible for severe pathologies, such as the infection of the central nervous system, also called herpes simplex encephalitis (HSE). The latter is the most common sporadic viral encephalitis in developed countries. Despite available antivirals, the mortality rate is higher than 30%. In addition, most survivors suffer from neurological sequelae. The mechanism by which herpes encephalitis is lethal is not yet clearly established. Although viral replication causes significant neural damage, growing evidence suggests that the inflammatory response also plays a major role in the pathogenesis of HSE. The main hypothesis of our team is that the innate immune response induced by HSV-1 infection is a double-edged sword. We believe that this immune response, critical to limit viral replication in the brain during the early phase of the disease, become later uncontrolled, and result in an exacerbated inflammatory response which is deleterious. Microglia are the only resident immune cells in the brain. Several studies reported that these cells, which form the first line of defense, play a key role in controlling CNS infections. In contrast, reactive microglia appear to contribute to neuroinflammation. In addition, it is proposed that these reactive microglia participate in the disruption of the blood-brain barrier during HSE, which we have also been able to observe in intranasally-infected BALB/c mice, as described in the first part of our work. However, the exact role of microglia in HE has not yet been elucidated. So, we decided to conduct this research to understand the involvement of microglia in the control of HE and to characterize the mechanisms exploited by these cells. We first evaluated the effect of microglial activation by macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) administered prior to the infection. This treatment significantly increased survival rate and decreased brain viral titers at day 6 pi. In parallel, the increased number of CD68⁺ microglia found in the brains of M-CSF treated mice led the question whether CSF1R⁺ microglia were responsible for this improvement of HSE prognosis. To answer that question, we depleted microglia using CSF1R-loxP-CX3CR1-cre/ERT2 mice. The reduced survival rate and higher brain viral titers for these microglia-depleted mice highlighted the importance of the microglial response during the early phase of infection. Following these observations, the mechanisms involved in the microglial immune response during HSE have been investigated using electron microscopy and single cell mRNA sequencing. In this part, we studied only the microglia located at VPL, which was identified as the most infected region of the infected C57BL/6 brain on day 6 p.i. using a new neurovirulent recombinant HSV-1 that we described in the first part of our work. Our results confirmed that microglia limit the infection by phagocytosis and antigen presentation. Furthermore, we described a new transcriptional response, associated with a rare cell population in VPL (Ventral posterolateral nucleus), which we called "in transition" microglia. The high expression of viral transcripts by these cells suggested that this distinct transcriptome might correspond to the intrinsic antiviral immune response of HSV-1-infected microglia in the VPL. Finally, the analysis of this transcriptome revealing the increased expression of genes involved in the production of interleukin IL-1β mediated by the NLRP3 inflammasome, suggested that these infected "in transition" microglia would promote the exacerbation of the inflammation in HE. Altogether, our work shows that the microglia, necessary in the early phase for a better control of HSE, can evolve towards a pro-inflammatory phenotype and contribute to the exacerbation of inflammation. Moreover, our results suggest that the infection of microglia by HSV-1 in VPL could thus induce the acquisition of this pro-inflammatory transcriptional response.