In the so-called induced systemic resistance phenomenon (ISR), some non pathogenic rhizobacteria are able to stimulate defence mechanisms in the host plant thereby rendering it less susceptible to subsequent phytopathogen attack. This immunization process is initiated into the plant following the perception of elicitors (or determinants) produced by the beneficial microorganism. Previous studies performed in our laboratory have demonstrated the ability of Pseudomonas putida strain BTP1 and Bacillus subtilis strain S499 (or M4) at triggering ISR. By using these two rhizobacteria, the global objective of this thesis is to contribute to a better understanding of this molecular dialogue between ISR-inducing bacteria and plant cells. Our first researches with BTP1 led to the isolation, as an elicitor, of a new compound produced by Pseudomonas. It was purified from bacterial culture supernatant and identified as a benzylamine core alkylated with two methyl and one tetradecyl groups, conferring its hydrophobic properties. On the basis of this structure, the BTP1 determinant was called NABD, for N-Alkylated Benzylamine Derivative. By testing the pure molecule or mutant strains altered in its production, we have shown that NABD was mainly responsible for ISR-activity of the BTP1 strain on bean and cucumber while in tomato, another unidentified compound could also be involved. In the case of Bacillus subtilis S499, we used similar approaches to demonstrate for the first time that the lipopeptides surfactin and fengycin may act as elicitors to stimulate systemic resistance, thereby attributing them a new role in the biocontrol of plant diseases. Structure/activity studies have revealed the implication of the benzylamine aromatic core in the biological activity of NABD. In the case of surfactin, reduced activity of some homologues indicates that its perception is dictated by structural clues such as the length of the acyl moiety and the presence of charges in the cyclic peptide part. Also in support to their involvement in ISR triggering, significant quantities of NABD and lipopeptides were recovered from the rhizosphere of bacterized plants. The influence of some physiological and physico-chemical factors on NABD production by BTP1 was further investigated in in vitro experiments. Our results show that the molecule is more efficiently produced at low cell growth rate and in the presence of amino acids in the medium but is negatively iron-regulated. Other abiotic factors, such as low oxygen concentration or low pH do not have drastic effects on NABD biosynthesis by the strain. Globally, with regard to specific conditions that the strain undergoes in the rhizosphere environment, it supposes that the nutritional/physiological state of BTP1 cells growing on plant roots is compatible with an effective production of the elicitor. Plant responses induced following root treatment with Bacillus subtilis S499 have also been investigated. Working on whole plants, it first revealed an increase in enzyme activities of the oxylipin pathway (lipoxygenase (LOX) and lipid-hydroperoxydase) after infection. Further investigations were conducted on cultured tobacco cells and we have shown the induction of some early events, such as extracellular pH alkalinization, reactive oxygen species production, defence enzyme stimulation (LOX and phenylalanine ammonia lyase (PAL), and accumulation of some phenolics from the phenylpropanoid pathway. These experimentations performed with Bacillus lipopeptides are the first conducted with ISR-specific elicitors and led to the characterization of early events that can also be triggered by pathogen associated molecules. It is still not clear whether bacterial LPs are recognized by plant cells via specific receptors but the amphiphilic and detergent properties of surfactin strongly suggest that these LPs can interact via a less specific mechanism based on some limited destabilization of the membrane structure. In conclusion, NABD and lipopeptides studied in this thesis enlarge the range of elicitors from non pathogenic bacteria isolated to date, and may be considered as members of a new class of ISR-inducing compounds of amphiphilic nature./ Lors du phénomène appelé « résistance systémique induite » (ISR), des rhizobactéries non pathogènes peuvent conférer à la plante un certain degré de protection à des attaques ultérieures par un phytopathogène via la stimulation de mécanismes de défense systémiques. Cette « immunité » sinitie suite à la perception par la plante de molécules dites élicitrices produites par le microorganisme bénéfique. Lobjectif de cette thèse est de contribuer à la caractérisation de ce dialogue moléculaire en se basant sur des études antérieures poursuivies au laboratoire qui ont mis en évidence la capacité des souches Pseudomonas putida BTP1 et Bacillus subtilis S499 (aussi dénommée M4) à induire lISR chez leur hôte végétal. La première partie des recherches sur BTP1 a permis disoler en tant quéliciteur un nouveau type de composé produit par les Pseudomonas. Cet éliciteur a été isolé à partir de surnageant de culture de la bactérie et est constitué dun noyau benzylamine dont lazote est alkylé par deux groupements méthyle et un groupement tétradécyle, responsables de lhydrophobicité relative de la molécule. Sur cette base, ce métabolite a été dénommé NABD (N-alkylated benzylamine derivative). Grâce au traitement des plantes avec le composé purifié ou via lutilisation de mutants altérés dans sa production, nous avons démontré que le NABD était responsable de lessentiel de lactivité ISR de BTP1 sur le haricot et le concombre. Dans le cas de la tomate par contre, il semble quil ne soit pas le seul éliciteur impliqué. En ce qui concerne Bacillus subtilis S499, en utilisant des approches similaires, nous avons pour la première fois montré limplication de deux lipopeptides, la surfactine et la fengycine, comme agents stimulateurs de lISR, permettant ainsi de leur attribuer un nouveau rôle dans le contrôle biologique des maladies des plantes par Bacillus. Une étude de la relation structure/activité a été entamée et a révélé un rôle du noyau aromatique dans létablissement de la résistance systémique par le NABD. Pour la surfactine, limportance de la longueur de la chaîne alkylée ainsi que la présence des charges sur les acides aminés suggèrent que son activité élicitrice soit liée à ses propriétés amphiphiles. La détection en quantités significatives des deux types déliciteurs dans la rhizosphère des plants traités par les bactéries est également en faveur de leur rôle biologique. Dans le cas de BTP1, nous avons étudié linfluence de certains paramètres physiologiques, nutritionnels et physico-chimiques sur la production du NABD. Les résultats montrent que la production du NABD est dépendante de la présence dacides aminés dans le milieu, quelle est effective à un taux de croissance faible du microorganisme, quelle est négativement influencée par le fer mais quelle nest pas inhibée par une restriction en oxygène dissous disponible ou par une acidification du milieu. Globalement, ces données suggèrent que les conditions physico-chimiques dictant létat physiologique des cellules bactériennes in situ peuvent être propices à une synthèse effective de léliciteur au niveau des racines. Des recherches sur les réponses induites chez lhôte lors de son interaction avec S499 ont été initiées et montrent une nette augmentation dactivités enzymatiques de la voie des oxylipines (activités lipoxygénase (LOX) et lipide hydroperoxydase) dans les feuilles après infection. Une exploration plus approfondie sur suspensions de cellules de tabac en culture avec la surfactine a montré linduction de plusieurs autres mécanismes précoces de défenses, comme une alcalinisation du milieu extracellulaire, la production despèces oxydantes, lactivation denzymes de défense telles que LOX et phenylalanine ammonia lyase (PAL), et une possible réorientation de la voie des phénylpropanoïdes. Ces expérimentations menées avec les lipopeptides de Bacillus sont parmi les premières à être réalisées avec des éliciteurs spécifiques de lISR. Elles ont abouti à la caractérisation de plusieurs réponses précoces dont certaines sont aussi induites par des molécules isolées dagents pathogènes. Les lipopeptides pourraient ainsi agir en stressant les cellules de lhôte via une perturbation temporaire de la membrane externe facilitée par leur propriété amphiphile. Limplication de récepteurs dans la reconnaissance des éliciteurs de BTP1 et S499 ne peut cependant pas être exclue. En conclusion, les lipopeptides et le NABD élargissent la gamme des éliciteurs bactériens de lISR isolés jusquà présent et peuvent être considérés comme appartenant à une nouvelle classe dimmuno-stimulateurs des plantes comprenant des molécules amphiphiles.

La protection des vignes contre les maladies cryptogamiques telles que le mildiou est assurée majoritairement par des fongicides de synthèse dont certains posent des problèmes environnementaux et sanitaires. L’induction de résistance de la vigne par des éliciteurs des réactions de défenses pourrait permettre de réduire leur utilisation. Toutefois, l’efficacité de cette stratégie est avérée en conditions de serres, mais reste plus variable au vignoble. L’efficacité des éliciteurs est conditionnée par le niveau de réponse défensif de la plante, et plus globalement, par son état physiologique. Dans ce contexte et dans le cadre de ce travail intégré au projet FUI IRIS+, l’objectif était de vérifier si des biostimulants, via leurs effets sur la physiologie de la plante, étaient susceptibles d’augmenter son niveau de réponse aux éliciteurs. Ce projet impliquait en amont le criblage d’éliciteurs et de biostimulants efficaces sur vigne. L’activation des défenses par des éliciteurs a un coût métabolique et énergétique que la plante doit assumer. Dans un premier temps, nous avons utilisé le modèle « suspensions cellulaires » afin de comparer l’impact de deux éliciteurs oligosaccharidiques sur le métabolisme primaire de la vigne. Des analyses enzymatiques et métaboliques ont permis de montrer que l’oligogalacturonide, qui a eu la plus forte capacité à activer le métabolisme secondaire associé à la défense, comparé à la laminarine, est également celui qui a eu l’impact le plus marqué sur le métabolisme primaire ; notamment sur certains glucides et acides aminés. Ainsi, l’élicitation mobilise des ressources, impacte le métabolisme primaire de la vigne et son efficacité pourrait être conditionnée par l’état physiologique global de la plante. Dans un second temps, un criblage a été réalisé afin d’identifier de nouveaux éliciteurs potentiels parmi sept fournis par le partenaire industriel. Des tests de protection contre Plasmopara viticola (agent du mildiou) réalisés sur boutures herbacées en conditions de serres, ont permis de retenir un extrait de plante codé SDN3. Les autres ont été écartés car déjà utilisés en laboratoire (l’un d’entre eux), insuffisants en terme d’efficacité, instables ou phytotoxiques. Des études in vitro et in planta ont révélé que l’activité biologique de SDN3 est liée à deux modes d’action : par activation des défenses et par effet direct contre l’agent pathogène. Dans un troisième temps, un criblage de cinq biostimulants potentiellement efficaces sur vigne était à réaliser mais aucune méthodologie de test n’était disponible au laboratoire. Ainsi, quatre dispositifs de complexités différentes ont dû être mis au point, permettant le suivi phénotypique des parties aériennes et/ou racinaires (et dans certains cas physiologique) : systèmes « godets », « rhizotron plan », « tubes » et un autre système appelé « X » (non décrit car lié à une protection industrielle). Seuls deux modèles ont montré un intérêt. En effet, le modèle « tube » a permis de montrer une augmentation du poids frais moyen par racine primaire en réponse à un apport par la voie racinaire de l’un des produits testés, codé BS3. Le modèle « X » a également mis en évidence une accélération de l’ouverture du bourgeon, et une augmentation du nombre de racines primaires en réponse à BS3 appliqué par voie racinaire. La mise au point d’applications d’éliciteurs et d’infection par P. viticola est en cours de finalisation afin de vérifier l’hypothèse de départ à l’aide de la combinaison de BS3 avec SDN3. / The protection of vineyards against cryptogamic diseases such as downy mildew is mainly ensured by synthetic fungicides, which cause serious environmental and health problems. The induction of resistance by elicitors could allow to reduce their use. However, even if their efficacy is demonstrated in greenhouse conditions, it remains quite variable in field conditions. Indeed, the efficacy of an elicitor depends on the plant’s ability to respond, or more generally, on the latter’s physiological status. In this context, part of the FUI project IRIS+, the aim of this present work is to evaluate whether biostimulants, through their effect on the plant’s physiology, would be able to increase their responsiveness to elicitors. The activation of defenses implies a metabolic and energetic cost that the plant must get in charge. First of all, we used a cell suspension model in order to compare two oligosaccharidic elicitors on the primary metabolism of grapevine. Enzymatic and metabolic analyses showed that the oligogalacturonide, which had a stronger impact on secondary metabolism related to defense, compared to laminarin, also showed a more notable impact on primary metabolism, particularly on some sugars and amino acids. The elicitation of grapevine defenses effectively turned out to require resources. Secondly, a screening was carried out to select the most effective elicitor among seven products that were provided by the company. Protection assays against Plasmopara viticola on herbaceous cuttings allowed us to identity SDN3 as the most interesting candidate. In vitro and in planta studies revealed that the mode of action of SDN3 relied on both the activation of defenses and a direct effect against the pathogen. Lastly, as no protocol, nor methodology were available in our laboratory to screen biostimulants, four systems were developed, in order to monitor phenotypic traits of aerial and/or root system: the “pot” model, the “rhizotron” model, the “tubes”, and another termed “X” (no description allowed because of an industrial protection). Only the “X” model showed potential interests, since it allowed to display biostimulating effects such as the acceleration of the bud opening, and the increase of the mean number of primary roots, in response to BS3, applied to the roots. The development of the protocol to apply the elicitor and to infect with P. viticola spores are currently in progress, in order to assess the initial hypothesis by using the combination of BS3 and SDN3.

Saccharothrix algeriensis est une Actinobactérie rare capable de synthétiser divers dérivés de dithiolopyrrolones (DTPs) aux propriétés phytosanitaires intéressantes. L'objectif de la thèse vise à développer différentes méthodes, alternatives à la synthèse organique, pour optimiser la production de DTPs par la régulation du métabolisme de la bactérie. Deux approches ont été envisagées : * la première fait appel à des éliciteurs chimiques tels que l'éthanol, le butan-1-ol, le diméthylsulfoxyde et des homosérines lactones (C4-HSL, 3-oxo-C12-HSL et 3-OH-C12-HSL). Les effets de la concentration de ces composés et du temps d'addition dans le milieu de culture ont été étudiés et une investigation sur le mécanisme d'action de l'éthanol a été initiée * la deuxième utilise une approche physico-chimique innovante modifiant le métabolisme microbien à l'aide d'une électrode polarisée. Des électrodes en carbone, en acier et en platine de topographies variées ont servi pour l'étude de l'effet du potentiel, par rapport à une électrode au calomel saturée (ECS), sur la croissance de S. algeriensis et la production de dithiolopyrrolones. Les résultats obtenus montrent que l'ajout de l'éthanol à une concentration de 1,74 % v/v ou du diméthysulfoxyde à 3 % v/v au début de la culture, induit une augmentation significative de la production spécifique des DTPs. Celle-ci est multipliée par un facteur 19 avec l'éthanol et par 6 avec le diméthylsulfoxyde. Dans le cas de l'éthanol, cette induction serait médiée par des espèces réactives de l'oxygène. Par ailleurs, l'ajout simultané de la C4-HSL et de la 3-oxo-C12-HSL à des doses successives de 500 µM permet de multiplier la production spécifique des DTPs par un facteur 2,5. L'utilisation d'une électrode polarisée, en platine ou en carbone, permet un bon développement mycélien de S. algeriensis contrairement à une électrode en acier. Sous le potentiel -0.3 V/ECS, des concentrations élevées en dithiolopyrrolones ont été quantifiées. / Saccharothrix algeriensis is a rare Actinobacterium that produces a variety of dithiolopyrrolone derivatives (DTPs). These biocidal compounds are used as plant and crop- protection products. The aim of this thesis is to develop new strategies for DTPs production by regulating bacterial metabolism as an alternative to the chemical synthesis of these compounds. Two strategies were used : * the first strategy consist of using chemical elicitors such as ethanol, butan-1-ol, dimethylsulfoxide and homoserine lactones (C4-HSL, 3-oxo-C12-HSL and 3-OH-C12-HSL). The effects of concentration and time addition of these compounds were studied and ethanol mode of action was investigated. * the second strategy is a physico-chemical innovative approach that modifies bacterial metabolism using a polarized electrod. Platinum, carbon and stainless steel electrodes with varied topographies were used to study the effect of the potential, versus a saturated calomel electrode (SCE), on the growth of S. algeriensis and DTPs production. Our results show that the addition of pure ethanol and dimethylsulfoxide, at the beginning of the culture (t0), in respective concentrations of 1,74 % v/v and 3 % v/v increases DTPs specific production. This one was multiplied by nineteen-fold in presence of ethanol and by six-fold in presence of dimethylsulfoxide. In the case of ethanol, the induction of DTPs biosynthesis is mediated by reactive oxygen species (ROS). Furthermore, simultaneous addition of C4-HSL and 3-oxo-C12-HSL in multiple doses of 500 µM increases DTPs specific production by 2,5 fold. In presence of polarized platinum and carbon electrodes mycelium development of S. algeriensis is thicker than that grown on stainless steel electrode. Although, under - 0,3 V/SCE, high DTPs concentrations were quantified in comparison to other conditions tested.