Saccharothrix algeriensis est une Actinobactérie rare capable de synthétiser divers dérivés de dithiolopyrrolones (DTPs) aux propriétés phytosanitaires intéressantes. L'objectif de la thèse vise à développer différentes méthodes, alternatives à la synthèse organique, pour optimiser la production de DTPs par la régulation du métabolisme de la bactérie. Deux approches ont été envisagées : * la première fait appel à des éliciteurs chimiques tels que l'éthanol, le butan-1-ol, le diméthylsulfoxyde et des homosérines lactones (C4-HSL, 3-oxo-C12-HSL et 3-OH-C12-HSL). Les effets de la concentration de ces composés et du temps d'addition dans le milieu de culture ont été étudiés et une investigation sur le mécanisme d'action de l'éthanol a été initiée * la deuxième utilise une approche physico-chimique innovante modifiant le métabolisme microbien à l'aide d'une électrode polarisée. Des électrodes en carbone, en acier et en platine de topographies variées ont servi pour l'étude de l'effet du potentiel, par rapport à une électrode au calomel saturée (ECS), sur la croissance de S. algeriensis et la production de dithiolopyrrolones. Les résultats obtenus montrent que l'ajout de l'éthanol à une concentration de 1,74 % v/v ou du diméthysulfoxyde à 3 % v/v au début de la culture, induit une augmentation significative de la production spécifique des DTPs. Celle-ci est multipliée par un facteur 19 avec l'éthanol et par 6 avec le diméthylsulfoxyde. Dans le cas de l'éthanol, cette induction serait médiée par des espèces réactives de l'oxygène. Par ailleurs, l'ajout simultané de la C4-HSL et de la 3-oxo-C12-HSL à des doses successives de 500 µM permet de multiplier la production spécifique des DTPs par un facteur 2,5. L'utilisation d'une électrode polarisée, en platine ou en carbone, permet un bon développement mycélien de S. algeriensis contrairement à une électrode en acier. Sous le potentiel -0.3 V/ECS, des concentrations élevées en dithiolopyrrolones ont été quantifiées. / Saccharothrix algeriensis is a rare Actinobacterium that produces a variety of dithiolopyrrolone derivatives (DTPs). These biocidal compounds are used as plant and crop- protection products. The aim of this thesis is to develop new strategies for DTPs production by regulating bacterial metabolism as an alternative to the chemical synthesis of these compounds. Two strategies were used : * the first strategy consist of using chemical elicitors such as ethanol, butan-1-ol, dimethylsulfoxide and homoserine lactones (C4-HSL, 3-oxo-C12-HSL and 3-OH-C12-HSL). The effects of concentration and time addition of these compounds were studied and ethanol mode of action was investigated. * the second strategy is a physico-chemical innovative approach that modifies bacterial metabolism using a polarized electrod. Platinum, carbon and stainless steel electrodes with varied topographies were used to study the effect of the potential, versus a saturated calomel electrode (SCE), on the growth of S. algeriensis and DTPs production. Our results show that the addition of pure ethanol and dimethylsulfoxide, at the beginning of the culture (t0), in respective concentrations of 1,74 % v/v and 3 % v/v increases DTPs specific production. This one was multiplied by nineteen-fold in presence of ethanol and by six-fold in presence of dimethylsulfoxide. In the case of ethanol, the induction of DTPs biosynthesis is mediated by reactive oxygen species (ROS). Furthermore, simultaneous addition of C4-HSL and 3-oxo-C12-HSL in multiple doses of 500 µM increases DTPs specific production by 2,5 fold. In presence of polarized platinum and carbon electrodes mycelium development of S. algeriensis is thicker than that grown on stainless steel electrode. Although, under - 0,3 V/SCE, high DTPs concentrations were quantified in comparison to other conditions tested.

Saccharothrix algeriensis est une bactérie filamenteuse productrice de plusieurs molécules de la famille des dithiolopyrrolones aux propriétés à la fois antibiotiques et anticancéreuses. Ces composés sont constitués d'un noyau bicyclique commun, la pyrrothine, lié par une liaison amide à différents radicaux acyls (R). Lors de ce projet de thèse, la réaction enzymatique d'acylation du noyau pyrrothine, dite pyrrothine N-acyltransférase, a été étudiée chez Sa. algeriensis pour mieux comprendre la régulation exercée par les acides organiques sur la biosynthèse des dithiolopyrrolones et synthétiser par voie enzymatique de nouveaux composés avec différents radicaux R. Deux activités enzymatiques pyrrothine Nacétyltransférase et N-benzoyltransférase catalysant la formation de deux dithiolopyrrolones, la thiolutine (R= CH3) et la benzoyl-pyrrothine (BEP, R= C6H5) ont d'abord été mise en évidence dans l'extrait cellulaire brut de Sa. algeriensis. Ensuite la régulation exercée par les acides organiques a été étudiée en mesurant ces activités enzymatiques dans des extraits cellulaires de Sa. algeriensis obtenus au cours de cultures sur différents milieux supplémentés en acides organiques. Les résultats obtenus montrent que l'augmentation de la production de BEP en présence d'acide benzoïque à 1,25 mM est en partie due à l'induction de l'activité benzoyltransférase. Par ailleurs, les activités acétyltransférase et benzoyltransférase ont montré des profils d'expression très différents qui laissent supposer que deux enzymes catalysent le transfert de l'acétyl- et du benzoyl-. Leur purification a aussi été entreprise et l'extrait cellulaire de Sa. algeriensis, sous une forme brute ou semi-purifiée, a été utilisé pour catalyser la synthèse enzymatique de 9 dérivés dithiolopyrrolones, susceptibles de posséder des activités biologiques innovantes et/ou accrues. / Saccharothrix algeriensis is a filamentous bacterium that produces many dithiolopyrrolone compounds with antibiotic and anti-tumour properties. These metabolites possess a common bicyclic nucleus, the pyrrothine, amide linked with variable acyl groups R. During this PhD project, the enzymatic reaction of pyrrothine acylation, identified as pyrrothine N-acyltransferase, was studied in Sa. algeriensis to further our understanding of the regulation exerted by organic acids on the dithiolopyrrolone biosynthesis and to produce new dithiolopyrrolone compounds by enzymatic catalysis. Evidence for the presence in the crude cell free extract of Sa. algeriensis of two enzymatic activities, pyrrothine Nacetyltransferase and N-benzoyltransferase is provided. They catalyze respectively the formation of the two dithiolopyrrolones, thiolutin (R= CH3) and benzoyl-pyrrothine (BEP, R = C6H5). To study the regulation exerted by organic acids, these enzymatic activities were then assayed in crude cell free extracts of Sa. algeriensis obtained during cultures on media supplemented with organic acids. The results show that BEP-production is enhanced in the presence of benzoic acid partly because of an induction of pyrrothine N-benzoyltransferase. Differences in the expression time courses of pyrrothine N-acetyltransferase and Nbenzoyltransferase activities were also observed. It supports the idea that the transfer reactions of acetyl-CoA and benzoyl-CoA on pyrrothine are catalyzed by two different enzymes. Their purification was undertaken and the cell free extract, crude or semi-purified was used as catalyst to synthetize nine dithiolopyrrolones with biological activities potentially new and better

Saccharothrix algeriensis est une bactérie filamenteuse capable de produire différentes molécules de la famille des dithiolopyrrolones présentant des activités antibiotiques et anticancéreuses. Ce travail porte sur l’analyse macroscopique et la modélisation du comportement dynamique de cette bactérie en vue de concevoir et d’optimiser un procédé de bioproduction de thiolutine. Les expériences menées en fermenteur de deux litres ont permis de décrire le comportement macroscopique de Sa. algeriensis. Sur substrat mixte (extrait de levure et glucose), la bactérie présente une croissance diauxique. La production de thiolutine, découplée de la croissance, est provoquée par l’épuisement du substrat préférentiel (extrait de levure). L’analyse des bilans carbone, azote et rédox nous a conduit à considérer deux phénomènes physico-chimiques qui n’étaient pas pris en compte dans le modèle proposé par Strub (2008) : l’entrainement de l’ammonium dans la phase gazeuse et l’adsorption des ions ammonium et des acides aminés sur la biomasse. Les données réconciliées sur la base des bilans élémentaires sont utilisées comme support pour la construction d’un modèle stœchio-cinétique. Différentes approches de modélisation des cinétiques et de représentation des bascules métaboliques ont été testées afin de retenir un schéma stœchio-cinétique apparent cohérent avec les données réconciliées. Cette étape de discrimination a été réalisée à l’aide de la toolbox ExOptim, développée en partenariat avec AgroParisTech. Cet outil, alliant une méthode d’optimisation robuste tout en limitant les temps de calcul, permet de prendre en compte les erreurs de mesure dès la mesure initiale et de reparamétrer indépendamment les paramètres du modèle et les données expérimentales. Les cinétiques réactionnelles sont représentées de manière satisfaisante par l’association du modèle de Monod et la loi logistique. Les seize paramètres du modèle sont identifiés sur sept expériences indépendantes. Le modèle finalement obtenu est ensuite testé sur cinq nouvelles expériences aux conditions initiales différentes. Ce modèle permet de prédire raisonnablement les cinétiques de croissance et de production de thiolutine. Toutefois, son utilisation reste limitée à des conditions initiales proches de celles de cette étude. / Saccharothrix algeriensis is a filamentous bacterium that produces several dithiolopyrrolone compounds with antibiotic and antitumor properties. This study focuses on the macroscopic analysis and modelling of the dynamic behaviour of this bacterium, in order to design and optimize the bioproduction process of thiolutin. Experiments were conducted in a two-litres bioreactor to characterise the macroscopic behaviour of Sa. algeriensis. On a medium containing several substrates (yeast extract and glucose), the bacterium shows a diauxic growth. Thiolutin production, which appears to be dissociated from growth, is triggered by the preferential substrate (yeast extract) depletion. The analysis of the carbon, nitrogen and redox balances led us to consider two physicochemical phenomena, which were not taken into consideration in the model proposed by Strub (2008): ammonium stripping in gaseous phase and adsorption of ammonium ions and amino acids on biomass. The data, reconciled on the basis of elementary balances, were used for the construction of a stoichio-kinetic model. Different modelling of kinetic and metabolic switches were tested in order to select a stoichio-kinetic model consistent with the reconciled data. This discrimination step was carried out using the ExOptim toolbox, developed in partnership with AgroParisTech. This toolbox combines a robust optimisation method and a reduced computation time. The experimental biases are taken into account from the first measurement and model parameters and experimental data reconditioned independently. The reaction kinetics are well represented by association of the Monod model and logistic laws. The sixteen model parameters were estimated from seven experiments. Finally, the model was validated by five additional experiments using different initial conditions. The kinetics of growth and thiolutin production are reasonably well predicted. However, the model is limited to initial conditions close to those of this study.

Du fait de l’apparition de microorganismes pathogènes ayant une résistance aux antibiotiques actuels, la recherche de nouvelles molécules bioactives possédant une application médicale est devenue une préoccupation mondiale. Saccharothrix algeriensis, une bactérie filamenteuse de l’ordre des actinomycètes a montré une étonnante capacité à produire des molécules bioactives qui appartiennent aux dithiolopyrrolones, ayant de remarquables propriétés à la fois antibiotiques et anticancéreuses. Lors de ce projet de thèse, l’identification du cluster de gènes de la voie de biosynthèse des dithiolopyrrolones chez Sa. algeriensis est envisagée. Suite au séquençage du génome de Sa. algeriensis, une approche génomique ou « genome mining » est suivie, cette approche a révélé un cluster thi potentiellement responsable de la voie de biosynthèse des dithiolopyrrolones chez Sa. algeriensis. Ce cluster contient 12 gènes, dont 8 gènes de biosynthèse, 3 gènes régulateurs et un gène transporteur. Les analyses in silico des gènes ont montré que la cystéine est le substrat d’une NRPS. Les analyses transcriptionelles ont montré que les trois gènes clés codent pour une NRPS, une thiorédoxine et une thioestérase qui pourraient être impliquées dans la biosynthèse des dithiolopyrrolones. Deux gènes actA et actB codant pour des acyltransférases putatives ont été identifiés. Les analyses transcriptionelles suggèrent qu’actA et actB pourraient être responsables de l’acylation de la pyrrothine. Finalement, la caractérisation de deux activités enzymatiques, acétyltransférase et benzoyltransférase, présentes dans l’extrait brut de Sa. algeriensis, ont permis de déterminer les paramètres optimaux (pH et T °C) de la réaction enzymatique. Enfin, les paramètres cinétiques de ces activités ont des valeurs complètements différentes, ce qui confirme la présence d’au moins deux activités différentes chez Sa. algeriensis. / Due to the emergence in the last decades of new and old infectious diseases to existing antibiotics, the research for new bioactive molecules which possess medical applications become a global occupation. Saccharothrix algeriensis, filamentous bacteria of actinomycetes order showed a surprising ability to produce bioactive molecules belongs to dithiolopyrrolones with remarkable properties of both antibiotics and anticancer. In this thesis, the identification of dithiolopyrrolones biosynthetic gene cluster in Sa. algeriensis was investigated. Through S. algeriensis genome sequencing, a genomics approach "genome mining" was followed, this approach has revealed a potentially thi cluster responsible for dithiolopyrrolones biosynthesis pathway in Sa algeriensis. This cluster contains 12 genes, including 8 biosynthesis genes, three regulatory genes and one transporter gene. The in silico analysis of this cluster showed that the cysteine is the substrate of the NRPS. The transcriptional analyzes showed that the three key genes which encode for NRPS, thioredoxin and thioesterase could be involved in dithiolopyrrolone biosyntheses. Two genes, actA and actB, encode for two putative acyltransferases were identified, the transcriptional analyzes suggests that these genes may be responsible for the acylation of pyrrothine core. The characterizations of two activities, acetyltransferase and benzoyltransferase, in the crude extract of Sa. algeriensis led the determination of the optimal parameters (pH and T °C) to detect these activities. Moreover, the effect of temperature and pH on these activities was determined. Finally, the kinetic parameters of these activities showed different values, which confirm the presence of, at least, two activities in Sa. algeriensis.