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Vital cellular processes such as nutrient uptake, receptor signaling, and cell migration are controlled by a balance between cell surface receptor internalization and recycling. Clathrin-mediated endocytosis is the major mechanism of receptor internalization in which cargo-enriched endocytic vesicles form at, and are released from, the plasma membrane before maturing into early endosomes. The receptors can then be sorted into fast and slow recycling pathways that replenish receptor levels at the cell surface. A major fast recycling pathway is controlled by the small GTPase Rab4a, which plays a central role in cell migration and cancer cell invasion through regulation of integrin αvβ3 recycling. Recent studies have discovered a family of clathrin-coated vesicle proteins, known as adaptin-ear-binding coat-associated proteins (NECAPs), that consists of two family members, NECAP1 and NECAP2. NECAP1 functions in endocytosis and cooperates with the clathrin adaptor AP-2 to control endocytic vesicle size, number and cargo. Importantly, NECAP2 did not rescue the knock-down phenotype of NECAP1, revealing that NECAPs are not functionally redundant. The studies described in this dissertation show that NECAP2 controls the fast recycling of epidermal growth factor receptor and transferrin receptor. Furthermore, NECAP2 specifically functions in Rab4a-mediated fast recycling together with the clathrin adaptor AP-1. In contrast, NECAP2 has no effect on AP-1-mediated transport from the Golgi or on other Rab4a-dependent sorting events that utilize additional clathrin adaptors and effector proteins. Thus, NECAP2 regulates a sub-route within the Rab4a recycling pathway and, in fact, is the first protein known to date to show this level of specificity. NECAP2 knock-down revealed that this sub-route controls cell migration and cancer cell invasion. Specifically, NECAP2 knock-down impaired the recycling of integrin αvβ3 to the cell surface, leading to decreased Rac1 activation and integrin αvβ3-dependent persistent cell migration. NECAP2 depletion also alleviated the inhibitory effect on integrin α5β1 recycling, switching cells to integrin α5β1-dependent cell migration. Notably, loss of NECAP2 function in breast cancer cells inhibited invasive migration in a 3D invasion model system. Therefore, the NECAP2 pathway may provide a therapeutic target, in particular for the 25% of breast cancers with amplification of Rab4a.

L’auto-incompatibilité est une barrière génétique qui permet à une plante de reconnaître et rejeter son propre pollen tout en acceptant le pollen d’individus moins apparentés d’un point de vue génétique. Chez les Brassicacées, l’auto-incompatibilité est contrôlée par un locus hautement polymorphe appelé le locus S, qui contient les déterminants mâle et femelle. Le stigmate exprime le déterminant femelle de l’auto-incompatibilité, S-LOCUS RECEPTOR KINASE (SRK). Chez Brassica oleracea, la localisation subcellulaire d’SRK est unique en son genre : le récepteur est localisé principalement au niveau des endosomes et dans une moindre mesure à la membrane plasmique.Nous avons étudié la fonction de la localisation endosomale de SRK chez Arabidopsis thaliana. Premièrement, nous avons réintroduit l’auto-incompatibilité chez Arabidopsis thaliana grâce à l’expression d’un allèle fonctionnel de SRK en provenance d’Arabidopsis lyrata (une espèce auto-incompatible). Deuxièmement, nous avons montré qu’un mutant perte de fonction de DYNAMIN-RELATED PROTEIN1A, une protéine requise pour l’endocytose, abolissait l’auto-incompatibilité. Nos résultats suggèrent que l’endocytose est requise pour l’auto-incompatibilité, et que SRK pourrait activer sa voie de signalisation depuis les endosomes. / Self-incompatibility is a genetic barrier by which a plant recognizes and rejects its own pollen while allowing pollen from more distantly related plants to germinate. In the Brassicacea family, it is controlled by a highly polymorphic locus called the S-locus, which contains the male and female determinants of self-incompatibility. The stigma expresses the female determinant of self-incompatibility, the plant receptor kinase (PRK) S-LOCUS RECEPTOR KINASE (SRK). In Brassica oleracea, SRK has a unique subcellular localization among PRK: the receptor is mostly localized in endosomes and to a lesser extent at the plasma membrane.We investigated the function of the endosomal localization of SRK in Arabidopsis thaliana. Firstly, we reintroduced self-incompatibility in Arabidopsis thaliana by expression of a functional SRK allele from Arabidopsis lyrata (a self-incompatible species). Secondly, we showed that a loss-of-function mutant of DYNAMIN-RELATED PROTEIN1A, a protein required for endocytosis, abolished self-incompatibility. Our results suggest that endocytosis is required for self-incompatibility, and that SRK may be signaling from endosomal compartments.

Self-incompatibility is a genetic barrier by which a plant recognizes and rejects its own pollen while allowing pollen from more distantly related plants to germinate. In the Brassicacea family, it is controlled by a highly polymorphic locus called the S-locus, which contains the male and female determinants of self-incompatibility. The stigma expresses the female determinant of self-incompatibility, the plant receptor kinase (PRK) S-LOCUS RECEPTOR KINASE (SRK). In Brassica oleracea, SRK has a unique subcellular localization among PRK: the receptor is mostly localized in endosomes and to a lesser extent at the plasma membrane.We investigated the function of the endosomal localization of SRK in Arabidopsis thaliana. Firstly, we reintroduced self-incompatibility in Arabidopsis thaliana by expression of a functional SRK allele from Arabidopsis lyrata (a self-incompatible species). Secondly, we showed that a loss-of-function mutant of DYNAMIN-RELATED PROTEIN1A, a protein required for endocytosis, abolished self-incompatibility. Our results suggest that endocytosis is required for self-incompatibility, and that SRK may be signaling from endosomal compartments.

ITCH est une ligase de l’ubiquitine impliquée dans différents processus cellulaires. Elle contient une région riche en prolines (PRR, proline rich region) qui lui permet de lier le domaine SH3 (Src homology 3) d’Endophiline et d’autres protéines à domaine SH3. Plusieurs de ces protéines sont impliquées dans l’endocytose clathrine-dépendante de récepteurs tel le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR, epidermal growth factor receptor). Après activation, l’EGFR est internalisé dans des vésicules enrobées de Clathrine et un complexe protéique formé par CBL, CIN85 et Endophiline participe à cet évènement. ITCH lie l’ubiquitine à CBL et à Endophiline pour vraisemblablement modifier leurs fonctions, ce qui suggère un lien direct entre cette ligase et l’endocytose de l’EGFR. Afin de déterminer le rôle d’ITCH dans ce processus, plusieurs expériences furent réalisées. Premièrement, la modalité de liaison entre la ligase ITCH et les protéines à domaine SH3 a été étudiée en détails. Une série de mutations dans la région PRR d’ITCH nous a aidé à identifier trois résidus arginines (R252, R255, R258) nécessaires pour son interaction avec Endophiline et d’autres protéines à domaine SH3. Deuxièmement, des lignées cellulaires HeLa et Cos7 furent modifiées génétiquement par CRISPR pour empêcher l’expression d’ITCH. Ces lignées cellulaires knockout furent caractérisées et utilisées dans un essai d’endocytose de l’EGFR, puis examinées par spectrométrie de masse. L’internalisation d’EGFR fut suivie en microscopie confocale à l’aide d’un ligand EGF fluorescent -/- dans les deux types de cellules ITCH . En absence d’ITCH, nous observons une diminution significative du niveau d’EGF internalisé par rapport aux cellules parentales. La surexpression d’ITCH dans les cellules ITCH-/- rétablit l’internalisation normale de l’EGF, confirmant l’implication d’ITCH dans le processus, mais la surexpression des formes mutantes de ITCH incapable de lier Endophiline ou catalytiquement inactive ne rétablit pas l’internalisation de l’EGF. Ces résultats nous permettent de conclure que l’interaction ITCH-Endophiline et la fonction catalytique de ITCH sont nécessaires pour l’endocytose de l’EGFR. Ensemble, ces deux fonctions de ITCH régulent le trafic endocytique de l’EGFR. De plus, les cellules ITCH-/- montrent un délai de dégradation de l’EGFR phosphorylé ainsi qu’une prolongation du temps d’activation de la kinase MAPK (mitogen-activated protein kinase). Finalement, pour explorer l’influence de l’absence d’ITCH sur ses substrats et partenaires moléculaires nous avons effectué une comparaison protéomique des partenaires d’interaction et des protéines ubiquitylées à partir des lysats cellulaires ITCH-/- et WT. Les résultats ont montré que le manque d’expression de la ligase ITCH altère la présence peptidique des protéines liées à la signalisation de l’EGFR, à la voie protéolytique dépendante de l'ubiquitine et à l’adhésion cellulaire. Cette étude révèle pour une première fois que la protéine ITCH est requise pour l’endocytose dépendante de la Clathrine de l’EGFR. / ITCH is a ubiquitin ligase involved in various cellular processes including endocytosis. It contains a proline rich region (PRR) which allows it to bind the SH3 domain of endophilin and other SH3 domain-containing proteins involved in Clathrin-mediated endocytosis (CME). CME is an important regulatory mechanism for growth factor receptor activity. The epidermal growth factor receptor (EGFR) is actively internalized in Clathrin-coated vesicles after activation. This endocytosis is facilitated by a protein complex formed by CBL, CIN85 and Endophilin. ITCH is known to ubiquitinate both CBL and endophilin, providing a potential functional link between the ligase and receptor internalization. In order to determine the role of ITCH in this process, several experiments were performed. First, the mapping of molecular binding sites between the ligase ITCH and SH3 domain proteins has been studied in detail. A series of mutations in the PRR region of ITCH helped us identify three arginine residues (R252, R255, R258) as necessary for its interaction with endophilin and all the tested SH3-domain containing proteins. Secondly, HeLa and Cos7 cell lines were genetically modified by CRISPR to prevent ITCH expression. These knockout cell lines were characterized for use in an EGFR endocytosis assay and for mass spectrometry analysis. EGFR internalization was monitored by confocal microscopy using fluorescent EGF ligand in both ITCH-/- cell types. In the absence of ITCH, a significant decrease in the level of internalized EGF compared to parental cells is visible. Overexpression of WT ITCH in the knockout cells restores normal internalization of EGF, confirming the involvement of ITCH in the process. Overexpression of Endophilin-binding defective or catalytically inactive ITCH does not restore the internalization of EGF in ITCH-/- cells. These results show that the ITCH- Endophilin interaction as well as the catalytic function of ITCH are necessary for the endocytosis of EGFR. In addition, ITCH-/- cells show a delay in the degradation of phosphorylated EGFR accompanied with an extended period of mitogen-activated protein kinase (MAPK) activation. In a last set of experiments, we explored the influence of the absence of ITCH on its substrates and molecular partners. We performed a proteomic comparison of ITCH-binding partners and potential substrates using the ITCH-/- and WT cell lysates. The results showed that the lack of ITCH expression alters the peptide count of proteins mainly related to EGFR signaling, theubiquitin-dependent proteolytic pathway and cell adhesion. This study shows for the first time that the protein ITCH is required for the clathrin-dependent endocytosis of EGFR.

Les cellules dendritiques (DCs) patrouillent les tissus périphériques à la recherche de dangers potentiels en se déplaçant à travers les tissus et en incorporant de grande quantité de matériel extracellulaire. Cet événement précoce de la réponse immunitaire adaptative est susceptible de déterminer l'amplitude et la qualité de l'activation des lymphocytes T et B. De ce fait, les DCs pourraient avoir besoin d'orchestrer leur motilité et leur fonction de capture des antigènes afin d'initier un réponse immunitaire efficace et adaptée. Afin d'étudier les mécanismes responsables de l'optimisation de l'échantillonnage des tissus par les DCs, nous avons suivi leur migration et leur capacité à capturer des antigènes dans des chambres micro-fluidiques contenant des canaux étroits qui permettent de reproduire l'espace confiné des tissus périphériques. De manière surprenante, nous avons découvert que la migration des DCs et leur aptitude à accumuler des antigènes sont des fonctions antagonistes et dépendent de l'activité du moteur moléculaire Myosine II. Nous avons observé que les DCs se déplacent en alternant des phases rapides au cours desquelles la Myosine II est distribuée de manière asymétrique à l'arrière des cellules, et des phases plus lentes pendant lesquelles la Myosine II est enrichie à l'avant. Les enrichissements transitoires de Myosine II à l'avant des DCs dépendent de l'association de la Myosine II avec la chaîne invariante associée au CMH-II (Ii). Ces évenements favorisent l'absorption d'antigènes et leur transport dans les compartiments endolysosomaux. Des expériences menées avec une pince optique nous ont permis de montrer que l'activité de la Myosine II à l'avant des cellules génère des forces mécaniques qui induisent le transport des vésicules vers l'intérieur de la cellule, probablement en modulant le flux rétrograde d'actine. Ainsi, au cours de cette thèse, nous avons montré que la Myosine II était nécessaire à la fois pour la migration cellulaire et la capture d'antigènes, établissant un mécanisme moléculaire qui permet de coordonner ces deux processus dans le temps et l'espace. Nous proposons que l'alternance de phases de haute mobilité et de phases d'arrêt associées à la capture d'antigènes confère aux DCs une stratégie de recherche intermittente qui leur permettrait d'optimiser la surveillance des tissus périphériques. / Dendritic cells (DCs) patrol peripheral tissues in search for potential dangers by actively crawling and internalizing extracellular materiel. This initial event of an adaptive immune response is likely to determine the magnitude and quality of T cell and B cell immunity. Therefore, DCs might need to tightly orchestrate their migration and their antigen uptake function in order to mount an efficient and adapted immune response. To investigate the mechanisms responsible for the optimization of tissues sampling by DCs, we monitored their migration and their ability to capture antigens in micro-fluidic chambers containing narrow channels that mimic the confined space of peripheral tissues. Surprisingly, we found that cell migration and antigen accumulation in endolysosomes are antagonistic, both relying on the activity of the motor protein Myosin II. We observed that DCs alternate between phases of fast motility during which Myosin II is asymmetrically distributed at the cell rear, and phases of slow motility during which Myosin is enriched at the cell front. Transient Myosin II enrichments at the leading edge depends on its association with the MHC-II associated Invariant Chain (Ii). These events promote antigen uptake and arrival in endolysosomal compartments. Using optical tweezers, we further showed that Myosin II activity at the leading edge generates mechanical forces that drive vesicles transport toward the cell body probably through the modulation of F-actin retrograde flow. Thus, during my PhD, we have shown that Myosin II is required for both migration and antigen capture, providing a molecular mechanism to couple these two processes and allow their coordination in time and space. We propose that alternation between phases of fast motility and phases of low motility associated with efficient antigen capture imposes an intermittent search behavior on DCs, which might be optimal for environment patrolling.

Zahlreiche pathogene „missense“-Mutation, die verhindern, dass Proteine korrekt gefaltet werden, befinden sich in geordneten Regionen von Proteinen. Andere krankheitsrelevante Mutationen befinden sich in ungeordneten Regionen und beeinflussen somit nur begrenzt die Funktionalität, zum Beispiel durch Veränderungen kurzer linearer Sequenzmotive, die Protein-Protein Interaktionen vermitteln. In dieser Arbeit wird ein peptidbasierter Interaktionsscreen präsentiert mit dem sich Veränderungen im Interaktom identifizieren lassen. Synthetische Peptide von wild-typ und zugehörigen mutierten Proteinregionen ermöglichen die gleichzeitige Untersuchung von mehr als hundert Mutationen mittels Massenspektrometrie. Mehr als ein Drittel aller getesteten Mutationen hatten veränderte Interaktionen zur Folge. Darunter befanden sich auch drei Prolin zu Leucin Mutationen in zytosolischen Regionen von Transmembranproteinen, die zusammen mit dem benachbarten Leucin einem Dileucinmotiv ergeben und dadurch verstärkt mit Clathrin interagieren. Dieses Motiv wurde bereits mit Clathrin-vermittelter Endozytose in Verbindung gebracht. Die hinzugewonnene Endozytose könnte Krankheitsmechanismen erklären, da die Mislokalisation der betroffenen Transmembranproteine zum effektiven Verlust derer Funktion führen würde. Diese Hypothese wurde hier von verschiedenen in vitro und in vivo Experimenten bezüglich der P485L Mutation im Glukose Transporter-1 (GLUT1), die das GLUT1-Defizit-Syndrom hervorruft, bestätigt. Weitere Evidenz wurde außerdem für die Funktionalität anderer mutationsbedingter Dileucinmotive gewonnen. Die systematische Analyse von pathogenen Mutationen hat gezeigt, dass Dileucinmotive signifikant und spezifisch in ungeordneten zytosolischen Regionen von Transmembranproteinen überrepräsentiert sind. Dieser Peptidescreen macht das Potenzial unvoreingenommener Analysen zur Aufklärung von Krankheitsmechanismen deutlich, die von Veränderungen in Protein-Protein Interaktionen hervorgerufen werden. / Many disease-associated missense mutations prevent proteins from folding correctly and lead to loss-of-function. These mutations are often found in ordered regions of proteins. Another class of disease-related missense mutations can be found in disordered regions. These are thought to impair only specific parts of a protein’s functions. Those mutations could modify short linear motifs that mediate protein-protein interactions. Here, we designed a peptide-based interaction screen to identify interactions that are affected by mutations in disordered regions. We used synthetic peptides corresponding to the wild type and mutated protein regions spotted on cellulose membrane to pull-down interaction partners. This setup allows for the screening of more than hundred mutations at a time via mass spectrometry. Here, we focused on mutations implicated in neurological diseases. More than one-third of tested variant pairs show differential interactions. Three disease-related proline to leucine mutations in cytosolic tails of transmembrane proteins lead to gain of a dileucine sequence. Several dileucine-containing peptide motifs are involved in clathrin-mediated endocytosis (CME). Also in the presented screen, the newly created motifs mediate interaction with the CME machinery. This could explain the disease mechanisms since mislocalization of the affected transmembrane proteins would lead to their loss of function. This hypothesis has been corroborated for glucose transporter-1 (GLUT1) P485L, causing GLUT1 deficiency syndrome. We were able to provide functional evidence also for additional gained dileucine motifs. A systematic analysis of pathogenic mutations revealed dileucine motifs to be overrepresented in structurally disordered cytosolic regions of transmembrane proteins. The data gained with the peptide screen highlights the power of differential interactome mapping as a generic approach to unravel disease mechanisms caused by changes in protein-protein interactions.