Ribonuklease P (RNaseP) ist eine essentielle Endonuklease, welche die 5'-Flanke von pre-tRNAs entfernt. In nahezu allen bisher untersuchten Organismen und Organellen besteht das Holoenzym aus einer RNA-Untereinheit und einer Protein-Komponente. Nur die Zusammensetzung des Enzyms in den Chloroplasten und Mitochochondrien mehrzelliger Eukaryonten scheint unklar. Eine RNA-Untereinheit konnte hier bis jetzt nicht nachgewiesen werden. Um den Aufbau der RNaseP aus photosynthetischen Organellen zu klären, wurde die RNaseP aus den Cyanellen von Cyanophora paradoxa untersucht. Das Enzym enthält eine RNA, welche im Gegensatz zu bakteriellen RNaseP-RNAs nicht in der Lage ist, die pre-tRNA-Prozessierung unter invitro-Bedingungen durchzuführen, obwohl sie eindeutig dem cy- anobakteriellen Strukturtyp zugeordnet werden kann. Die Cyanellen-RNaseP-RNA aus C.paradoxa kann mit rekombinanten cyanobakteriellen RNaseP-Proteinen zum katalytisch aktiven Holoenzym rekonstituiert werden. Das Einführen der hochkonservierten Nukleotide G22 und G213 in die Cyanellen-RNaseP-RNA führt nicht zu signifikanten Unterschieden im Prozessierungsverhalten des heterologen Holoenzyms. Durch Mutationsanalyse einer cyanobakteriellen RNaseP-RNA an den entsprechenden Positionen wurde gezeigt, dass diese Konsensus-Nukleotide keinen essentiellen Einfluss auf die Katalyse ausüben. Die funktionelle Charakterisierung der RNaseP-RNA aus den Cyanellen von G. nostochinearum bestätigt die Ergebnisse für C.paradoxa. Die RNA besitzt keine Ribozym-Aktivität und kann mit cyanobakteriellen RNaseP-Proteinen zum aktiven Holoenzym rekonstituiert werden. Um zu klären, ob die fehlende Ribozym-Aktivität der Cyanellen-RNaseP-RNAs auf das Fehlen der Fähigkeit zur Substratbindung zurückzuführen ist, wurden zirkular permutierte Cyanellen-RNase P-RNAs mit kovalent verknüpften pre-tRNAs konstruiert. Entsprechende Transkripte weisen keine Ribozymaktivität auf, können aber mit cyanobakteriellem RNaseP-Protein zum aktiven Komplex rekonstituiert werden. Die Reaktion läuft intramolekular, da die Prozessierungsreaktion mit zirkular permutierten Konstrukten nicht durch reife tRNAs gehemmt wird. Zur Identifizierung der Protein-Untereinheit(en) aus Cyanellen-RNaseP wurden polyklonale Antikörper gegen das rekombinate RNaseP-Protein aus dem Cyanobakterium Synechocystis PCC 6803 gewonnen. Immunoblots zeigen spezifische Signale im homologen und im Cyanellen-Extrakt, jedoch keinerlei Bindung des RNase P Proteins aus E. coli. Die hohe Spezifität der Antikörper für ein Cyanellen-RNase P-Protein konnte durch Immunopräzipitations-Experimente bestätigt werden. Da im vollständig sequenzierten Cyanellen-Genom keine zu RNaseP-Proteinen homologe Sequenz identifiziert werden kann, muss das Cyanellen RNaseP-Protein im Kern codiert sein. Um die Proteinkomponente der Cyanellen-RNase P zu klonieren, wurde eine cDNA-Expressionsbank für Cyanophora paradoxa angelegt. Versuche zum Immuno-Screening wurden aufgrund eines schlechten Signal:Hintergrund-Verhältnisses nicht weiter verfolgt. Durch Screening der cDNA-Expressionsbank mit Cyanellen-RNaseP-RNA konnten zwei Cyanophora-Proteine mit hoher Homologie zu eukaryontischen RNA-bindenden Proteinen identifiziert werden. Das Molekulargewicht des C.paradoxa-Holoenzyms wurde durch Ultrazentrifugation im Glyceringradienten zu etwa 280kD bestimmt. RNaseP-Aktivität und RNaseP-RNA-Untereinheit korrelieren im Gradienten mit einem 30kD-Protein, welches im Immunoblot mit cyanobakteriellen RNaseP-Protein-Antikörpern spezifisch erkannt wird. Das Cyanellen-Holoenzym zeigt in wesentlichen Merkmalen eine Übereinstimmung mit eukaryontischer RNaseP. Dennoch scheint die katalytische Aktivität in der RNA-Untereinheit lokalisiert zu sein, da die native, relativ große Cyanellen-Protein-Untereinheit ohne Funktionsverlust gegen sehr viel kleinere cyanobakterielle Protein-Untereinheiten ausgetauscht werden kann. Die Protein-Komponente der Cyanellen RNaseP scheint deshalb trotz ihrer Größenzunahme im Vergleich zu ihren evolutiven, bakteriellen Vorfahren, keine weiteren essentiellen Aufgaben übernommen zu haben. Eukaryontische RNaseP ist aus bis zu zehn Protein-Untereinheiten aufgebaut. Durch Genom-Analyse konnte in Arabidopsis thaliana das potentielle RNaseP-Protein Pop1 identifiziert werden. Mit der experimentell bestätigten Identität dieses Proteins wurde erstmals ein RNaseP-Protein aus A.thaliana eindeutig identifiziert. Durch spezifische Antikörper gegen dieses Protein kann RNaseP-Aktivität aus Weizen-Extrakt präzipitiert werden. / The essential tRNA-processing enzyme ribonucleaseP (RNaseP) is a striking example for evolution of an RNP enzyme. It is a ribonucleoprotein in bacteria, archea, and eukaryotic nuclei. No RNA component is found in mitochondria and chloroplasts of multicellular organisms to date, posing the question of enzyme evolution in these organelles of bacterial descent. The plastids (cyanelles) of some primitive algae, such as Cyanophora paradoxa and Glaucocystis nostochinearum, are intermediates in the evolution from cyanobacteria to chloroplasts and are an ideal model system to study the evolution of structure and function of RNaseP from organelles. C.paradoxa RNaseP has an essential RNA component which conforms to the bacterial consensus except for two highly conserved positions. The naked RNA has no ribozyme activity. Recombinant RNaseP-proteins from different cyanbacteria can form an active chimaeric holoenzyme with the catalytically inactive cyanelle RNaseP-RNA.Restoration of the bacterial consensus does not increase substrate turnover in the corresponding heterologous holoenzyme. Mutational analysis of cyanobacterial RNaseP-RNA ribozyme proved that these two consensus nucleotides have no essential influence on catalysis. The results for C.paradoxa RNaseP-RNA could be confirmed by analysis of G. nostochinearum RNaseP-RNA. This RNA can form an active holoenzyme with cyanobacterial RNaseP proteins, but shows no ribozyme activity either. To establish whether the lack of substrate binding ability is the reason for the missing ribozyme activity of cyanelle RNaseP-RNA, circularly permuted RNaseP-RNAs were designed in which the RNaseP-RNA is covalently linked to pre-tRNA substrates with variable flank lengths. Corresponding transcripts showed no ribozyme activity, but coudl be reconstituted with cyanobacterial protein. Cleavage of these tethered substrates is not inhibited by an excess of mature tRNAs, proving that it is an intramolecular reaction. To facilitate identification of cyanelle RNase P protein(s), polyclonal antibodies were generated against the recombinant cyanobacterial RNaseP-protein from the cyanobacterium Synechocystis PCC6803 Immunoblots show specific signals in homologous and cyanelle extracts, but no binding of E. coli RNase P protein. The high specificity of these antibodies is supported by immunoprecipitation of RNaseP activity from the same preparation. As no sequence similarity to bacterial-type RNaseP proteins can be identified in the cyanelle genome, this RNaseP protein must be encoded in the nucleus or is of a completely new type. With the aim of isolating the cyanelle RNaseP protein subunit, a C.paradoxa cDNA-expression-library was constructed. Due to a poor signal-to-background ratio, immuno-screening experiments were not embarked on. Screening the expression library using labelled cyanelle RNaseP-RNA resulted in cDNAs for two cyanelle proteins showing significant homology to eukaryotic RNA binding proteins. The molecular weight of the cyanelle holoenzyme was determinated to 280kD by ultrazentrifugation in glycerol gradients. RNaseP activity and the RNaseP-RNA subunit correlate with a 30kD-protein, which is specifically recognised in immunoblots by antibodies against cyanobacterial RNaseP protein. Although the overall composition of cyanelle RNaseP seems more similar to the eukaryote- than to the bacterial-type enzymes, the catalytic activity still seems to reside in the RNA subunit as the sizeable protein complement of the native cyanelle RNaseP can be functionally replaced by the much smaller cyanobacterial protein subunit. Therefore it can be concluded that the cyanelle protein subunit has not gained significant additional functions if compared to its bacterial ancestor. Eukaryotic nuclear RNaseP is composed of one RNA and up to ten protein subunits. Genomic analysis of A.thaliana revealed at least five protein subunits similar to those found in humans und yeast. Antibodies against the Pop1p-homolog from A.thaliana specifically recognize a single protein in a variety of plant species and can immunoprecipitate RNaseP activity from a wheat germ preparation. Thus, ATPOP1p is the first known RNaseP-protein of A.thaliana which has been verified by direct experimental evidence. The antibodies specific for this protein will facilitate the purification of RNaseP from wheat extracts.

Würzburg, Universiẗat, Diss., 2004. / Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2004.

Ribonuklease P (RNase P) ist eine essentielle Endonuklease, welche die 5'-Flanke von pre-tRNAs entfernt. Die RNase P RNA des Cyanobakteriums Prochlorococcus marinus ist in vitro katalytisch aktiv und bevorzugt in heterologen Prozessierungssystemen Substrate mit vollständigem 3’-CCA-Ende. Diese Substratspezifität widerspricht den Erwartungen, da tRNAs in P. marinus nicht mit dem CCA-Ende codiert sind und die RNase P RNA auch nicht das GGU-Bindungsmotiv für diese CCA-Enden aufweist. Um die Substratspezifität und Aufbau des Ribozym-Substrat-Komplex von P. marinus RNase P RNA im homologen System untersuchen zu können, wurden Transkriptionsklone für P. marinus pre- und mat-tRNAArgCCU konstruiert, mit denen nach entsprechender Restriktionshydrolyse Transkripte mit stufenweise verkürzten 3’-CCA-Ende synthetisiert werden können. Durch enzymkinetische Untersuchungen der Prozessierung durch P. marinus RNase P RNA wurde unter steady-state-Bedingungen für pre-tRNACCA eine Michaelis-Menten Konstante von 6,92 µM ermittelt. Die Entfernung von A76 und C75 des 3’-CCA-Endes führt zu einer Erhöhung der KM (7,13 µM bzw. 19,68µM). Diese Substrate werden folglich weniger stark gebunden, was sich auch in der freien Bindungsenthalpie von 0,02 und 0,65 kcal/mol ausdrückt. Die Entfernung des vollständigen 3’-CCA-Endes führt zu einer erheblichen Erniedrigung der KM (0,83µM) und zu einer energetisch begünstigten, stärkeren Substratbindung (–1,31 kcal/mol). P. marinus RNase RNase P RNA zeigt folglich bei der in vitro Prozessierung im homologen System unter steady-state-Bedingungen eine Substratspezifität für das Substrat mit deletiertem 3’-CCA-Ende. Durch die Methode des Crosslinking, die in dieser Arbeit etabliert und optimiert wurde, können RNA-Protein und RNA-RNA Interaktionen nachgewiesen werden. Mit ihr wurde die Bindung von Substrat und Produkt im Komplex mit der RNase P RNA untersucht. Durch interne Modifizierung der P. marinus RNase P RNA-Komponente mit dem photosensiblen Nukleotidanalogon s4U wurden Kontaktstellen in 5’-Flanke, Acceptor-Stamm, D-Stamm, D-Schleife, Anticodon-Schleife und in der variablen Schleife der P. marinus pre-tRNAArg identifiziert. Diese lokalisierten Kontaktstellen stehen denen in der 5’-Flanke, dem Acceptor-Stamm und der 3’-Flanke, wie sie für den Ribozym-Substrat-Komplex mit E. coli RNase P RNA identifiziert wurden, gegenüber. In P. marinus RNase P RNA werden folglich alternative Kontaktstellen zur Substratbindung benutzt. Mit Hilfe der hier überexprimierten E. coli Nukleotidyltransferase, konnte pre- und mat-tRNAArg durch eine neue Synthesestrategie am 3’-CCA-Ende mit dem Crosslink-Reagenz Azidophenacyl (APA) modifiziert werden. Durch die Positionierung von APA am 5’-Terminus von pre- und mat-tRNAArg wurden weitere modifizierte tRNAs synthetisiert. Durch Crosslink-Experimente im homologen P. marinus System mit diesen modifizierten pre- und mat-tRNAArg-Varianten wurden die selben Regionen des katalytischen Zentrums (J18/2, Region P15/P16, J5/15) der RNase P RNA identifiziert, wie sie von E. coli und B. subtilis RNase P RNA bekannt sind. Dies bedeutet, dass die 5’-Flanke, die Prozessierungsstelle und das 3’-CCA-Ende der tRNAs auf einer vergleichbaren Oberfläche positioniert werden wie in anderen Ribozymen. Durch die fehlende Fixierung des 3’-CCA-Endes über Basenpaarungen mit dem GGU-Bindungsmotiv werden die tRNAs in P. marinus RNase P RNA weniger starr an das Ribozym gebunden und das 3’-CCA-Ende besitzt eine flexiblere Positionierung im Komplex mit dem Ribozym. Die Existenz unterschiedlicher Crosslink-Muster in P6, P18, J5/15 und J3/4 zeigt, dass pre-tRNAs und reife tRNAs durch verschiedene Modi an das P. marinus Ribozym gebunden werden. Die Identifizierung von vernetzten Nukleotiden in P15, J15/16, P16 und J16/15, die mit vergleichbaren modifizierten tRNAs in E. coli RNase P RNA nicht gefunden wurden, belegen, dass in P. marinus RNase P RNA ein anderer Produkt-Bindungs-Modus existiert als in E. coli. Erstmals konnten in dieser Arbeit auch zu erwartende Interaktionen mit dem katalytischen Zentrum identifiziert werden, die in bisherigen Crosslink-Experimenten in E. coli und B. subtilis RNase P RNA nicht oder nur geringfügig auftraten. Um die erhaltenen Ergebnisse besser veranschaulichen zu können, wurde mit dem Programm ERNA 3D ein Raumstrukturmodell für P. marinus RNase P RNA und tRNAArg erstellt. Die RNase P RNA der Cyanellen von Cyanophora paradoxa, ist in vitro katalytisch inaktiv. Um zu klären, ob die fehlende Ribozym-Aktivität dieser RNase P RNA auf eine fehlerhafte Substratbindung zurückzuführen ist, sollten Crosslink-Experimente mit den modifizierten P. marinus tRNAArg durchgeführt werden. Es konnte gezeigt werden, dass 5’- und 3’-modifizierte pre-tRNAs in C. paradoxa in einem anderen Modus gebunden werden, als durch die katalytisch aktive P. marinus RNase P RNA. / Ribonuclease P (RNase P) is the essential endonuclease responsible for the removal of the 5’-flank of precursor tRNAs. The RNase P RNA from the cyanobacterium Prochlorococcus marinus shows in vitro catalytic activity and specificity for heterologous substrates containing the complete 3’-CCA end. This preference is in contrast to the fact that the P. marinus RNase P RNA does not possess the binding motif for the CCA terminus, which is not encoded in tRNA genes in this organism. To analyse the substrate specificity and architecture of the ribozyme-substrate-complex of P. marinus RNase P RNA in a homologous system, transcription clones for P. marinus pre- and mat-tRNAArg were generated to obtain different transcripts with stepwise shortened 3’-CCA ends. In the kinetic analysis of P. marinus RNase P RNA, the Michaelis constant (KM) for pre-tRNACCA was 6,92 µM, as determined under steady-state conditions. The subsequent deletion of A76 and C75 from the 3’-CCA end results in an increase of KM (7,13 µM and 19,69 µM, respectively). These substrates are bound less strongly, which is expressed in loss of binding energy (0,02 and 0,65 kcal/mol, respectively).The removal of the complete CCA end results in an considerable decrease of KM (0,83 µM) and an energetically favoured and stronger binding of substrate (–1,31 kcal/mol). In conclusion, in the homologous in vitro system, P. marinus RNase P RNA has a preference for substrate lacking the 3’-CCA end. The method of Crosslinking, which was established and optimised in this work, is generally used to determine RNA-protein and RNA-RNA interactions. This method was used to examine the binding of substrate and product in the complex composed with RNase P RNA. P. marinus RNase P RNA was internally modified with the photoinducible nucleotide analogue s4U. With this modified RNA, interactions of the 5’-flank, acceptor stem, D-stem and loop, anticodon loop and variable loop of pre-tRNAArg with RNase P RNA were detected. These contacts are in contrast to signals in the 5’-flank, acceptor stem and 3’-flank which have been identified in the ribozyme-substrate-complexes of E. coli RNase P RNA. Thus, in P. marinus RNase P RNA, alternative interactions are used for substrate binding. Using purified recombinant E. coli Nucleotidyltransferase, pre- and mat-tRNAArg were modified at the 3’-CCA end by a new strategy using the crosslink-reagent azidophenacyl (APA). Additional modified tRNAs were obtained by positioning the APA-reagent at the 5’-end. In the homologous P. marinus system, crosslinking experiments with the modified tRNAs identified the same regions of the catalytic centre (J18/2, region P15/P16, J5/15) which have been established in E. coli and B. subtilis RNase P RNA. This observation indicates that 5’-flank, cleavage site and 3’-CCA end are positioned on a similar surface, as in the other ribozymes. Due to the missing interaction between the GGU motif and the CCA end, tRNAs are bound less rigid to the ribozyme in P. marinus and the 3’-CCA end is more flexible in the complex. Different crosslink patterns in P6, P18, J5/15 and J3/4 indicate that pre-tRNAs and mat-tRNAs are bound in a different mode by P. marinus RNase P RNA. The identification of crosslinked nucleotides in P15, J15/16, P16 and J16/15 which are not observed with analogous modified tRNAs in E. coli RNase P RNA, show that a different mode of product binding exists in P. marinus RNase P RNA. For the first time, interactions within the catalytic centre could be identified which had been anticipated, but were only weakly detectable in the E. coli and B. subtilis RNase P RNAs. The crosslinks in P4, J3/4 and P3 are a distinctive feature, which is supported by mutational studies, phosphorothioate interference and NAIM analysis. To obtain a good visualization of the crosslinking results, a 3D-model of P. marinus RNase P RNA and tRNAArg was created with the program ERNA-3D. RNase P RNA from the cyanelles of Cyanophora paradoxa does not show catalytic activity in vitro. To establish whether the lack of substrate binding ability is the reason for the missing ribozyme activity, crosslinking experiments with the modified P. marinus tRNAArg were done. 5’- and 3’- modified pre-tRNAArg are bound by cyanelle RNase P RNA in a different mode than by the catalytically active P. marinus RNase P RNA.

Universiẗat, Diss., 2003--Würzburg. / Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2003.

In allen Organismen wird die genetische Information der DNA in mRNA umgeschrieben und diese im Cytosol als Vorlage für die Proteinbiosynthese benutzt. Dabei dienen tRNAs als codonspezifische Adaptermoleküle, die als Vorläufermoleküle (pre-tRNA) transkribiert werden. Eine Reaktion bei der Reifung übernimmt die Ribonuklease P (RNase P). Sie ist eine essentielle Endonuklease, die die 5\\\'-Flanke von pre-tRNAs entfernt. Eine weitere Endonuklease ist die RNase MRP (Mitochondrial RNA Processing), die mit der RNase P bis zu zehn Proteine gemeinsam hat. Ein Unterschied ist die eigene RNA-Untereinheit sowie die Funktion. RNase MRP ist bei der Reifung der mitochondrialen 5,8S rRNA beteiligt. Während die RNase P/MRP in den Eukaryoten Hefe und Mensch sehr detailliert untersucht werden, gibt es bis dato nur wenig Wissen über die RNase P/MRP in Pflanzen. In dieser Arbeit wurden vier Proteine, die homolog zu den menschlichen RNase P/MRP Proteinen sind, identifiziert und näher charakterisiert. Zwei als RNase MRP-Typ annotierte RNAs wurden in dieser Arbeit in vivo nachgewiesen. Der Fokus dieser Arbeit lag dabei in der Charakterisierung der Transkriptions- und Translationsprodukte sowie deren Beziehung zu RNase P/MRP. Dabei wurden annotierte mRNAs bestätigt und neue Spleißvarianten identifiziert. Mit spezifischen Antikörpern, die die identifizierten Proteine erkennen, konnten die Proteine im Arabidopsis thaliana Proteinextrakt sowie im Weizenkeimproteinextrakt nachgewiesen werden. Mit AtPOP1p-spezifischen Antikörpern konnte RNase P-Aktivität aus einem Proteinextrakt isoliert werden. Darin befand sich auch eine der beiden RNase MRP RNAs, die Bestandteil der RNase P Funktion sein könnte. In dieser Arbeit wurden Grundlagen geschaffen, um das RNase P/MRP-System in Pflanzen genauer zu verstehen und zu untersuchen.

Ulm, Univ., Diss., 1999. / http://vts.uni-ulm.de/query/longview.meta.asp?documentid=351.

In allen Organismen wird die genetische Information der DNA in mRNA umgeschrieben und diese im Cytosol als Vorlage für die Proteinbiosynthese benutzt. Dabei dienen tRNAs als codonspezifische Adaptermoleküle, die als Vorläufermoleküle (pre-tRNA) transkribiert werden. Eine Reaktion bei der Reifung übernimmt die Ribonuklease P (RNase P). Sie ist eine essentielle Endonuklease, die die 5\\\''-Flanke von pre-tRNAs entfernt. Eine weitere Endonuklease ist die RNase MRP (Mitochondrial RNA Processing), die mit der RNase P bis zu zehn Proteine gemeinsam hat. Ein Unterschied ist die eigene RNA-Untereinheit sowie die Funktion. RNase MRP ist bei der Reifung der mitochondrialen 5,8S rRNA beteiligt. Während die RNase P/MRP in den Eukaryoten Hefe und Mensch sehr detailliert untersucht werden, gibt es bis dato nur wenig Wissen über die RNase P/MRP in Pflanzen. In dieser Arbeit wurden vier Proteine, die homolog zu den menschlichen RNase P/MRP Proteinen sind, identifiziert und näher charakterisiert. Zwei als RNase MRP-Typ annotierte RNAs wurden in dieser Arbeit in vivo nachgewiesen. Der Fokus dieser Arbeit lag dabei in der Charakterisierung der Transkriptions- und Translationsprodukte sowie deren Beziehung zu RNase P/MRP. Dabei wurden annotierte mRNAs bestätigt und neue Spleißvarianten identifiziert. Mit spezifischen Antikörpern, die die identifizierten Proteine erkennen, konnten die Proteine im Arabidopsis thaliana Proteinextrakt sowie im Weizenkeimproteinextrakt nachgewiesen werden. Mit AtPOP1p-spezifischen Antikörpern konnte RNase P-Aktivität aus einem Proteinextrakt isoliert werden. Darin befand sich auch eine der beiden RNase MRP RNAs, die Bestandteil der RNase P Funktion sein könnte. In dieser Arbeit wurden Grundlagen geschaffen, um das RNase P/MRP-System in Pflanzen genauer zu verstehen und zu untersuchen.