EINFÜHRUNG: Endotheliale Vorläuferzellen (EPCs) können in vivo aus dem Knochenmark in die periphere Blutzirkulation mobilisiert und gezielt zu ischämischem Gewebe oder Gefäßläsionen rekrutiert werden. Im Zielgewebe differenzieren EPCs in situ zu reifen Endothelzellen und tragen auf diese Weise zur Neovaskularisation und Endothelregeneration bei. Der therapeutische Einsatz von EPCs ist durch die geringe Zellzahl limitiert, die aus dem Blut eines Patienten gewonnen werden kann. Folglich ist ein Verfahren zur ex vivo Expansion von EPCs erforderlich. Das Cystein-reiche Protein 61 (CYR61) ist ein matrizelluläres Signalprotein der CCN-Familie, das in vitro in der Lage ist die Proliferation, Migration und Adhäsion von Endothelzellen zu steigern. In vivo ist CYR61 im Rahmen von Geweberegeneration und Neovaskularisation verstärkt exprimiert. Die Beteiligung von EPCs und CYR61 an der Blutgefäßbildung legt eine mögliche Interaktion dieser beiden angiogenetischen Faktoren nahe. In dieser Arbeit wurde der Frage nachgegangen, ob CYR61 ein potenter Stimulator der ex vivo Expansion von EPCs ist, ohne dabei den Phänotyp der Zellen zu verändern. MATERIAL UND METHODEN: Das rekombinante CYR61-Protein wurde in Insektenzellen als Fusionsprotein mit der Fc-Domäne des humanen IgG exprimiert und affinitätschromatographisch aufgereinigt. Mononukleäre Zellen des peripheren venösen Blutes von adulten humanen Spendern wurden mittels Dichtegradientenzentrifugation isoliert und anschließend mit einem für die Selektion von EPCs geeigneten Grundmedium in vitro kultiviert. Vom 2. Kulturtag an wurde das Grundmedium mit CYR61 supplementiert. Die Kontrollzellen wurden in reinem oder mit Fc-tag supplementiertem Grundmedium kultiviert. Das Wachstum und die Entwicklung der Zellen wurden über die gesamte Kulturdauer hinweg beobachtet und fotografiert. Die Zellproliferation wurde mittels Zellzählung quantifiziert. Zudem wurden die Zellen mittels FACS-Analyse und immunhistochemischer Färbung bezüglich der Expression charakteristischer Oberflächenmarker phänotypisch analysiert. ERGEBNISSE: Die in vitro Kultur von aus dem Blut isolierten EPCs unter CYR61-Supplementierung führte zu einer konzentrationsabhängigen Steigerung der Zellproliferation, im Konzentrationsbereich von 0,05 bis 1,5µg/ml CYR61. Die Behandlung von EPCs mit 0,5µg/ml CYR61 führte zu einer durchschnittlich 4,1-fachen Zellzahlzunahme im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen. Die FACS-Analysen und immunhistochemischen Färbungen ergaben ein für EPCs charakteritisches Oberflächenmarkerexpressionsprofil der Zellen. Sowohl die mit CYR61 behandelten als auch die unbehandelten Kontrollzellen zeigten eine identische EPC-typische Markerexpression, wodurch gezeigt werden konnte, dass der Phänotyp der EPCs von der Behandlung mit CYR61 unbeeinflusst bleibt. SCHLUSSFOLGERUNG: Folglich ist CYR61 ein potenter Stimulator der ex vivo Expansion von aus dem peripheren humanen Blut isolierten EPCs. Dieses Ergebnis legt eine mögliche Verwendung von ex vivo unter CYR61 Behandlung expanierten EPCs zur Stimulation von Neovaskularisation und Endothelregeneration nahe. Derartige neue Zell-basierte therapeutische Strategien könnten dazu beitragen beispielsweise die Behandlung der ischämischen Herzkrankheit, die Knochenregeneration oder die Vaskularisierung von mittels Tissue Engineering hergestellten Gewebekonstrukten zu verbessern. / BACKGROUND: Endothelial progenitor cells (EPCs) can in vivo be mobilized from the bone marrow into the peripheral blood, home to sites of ischemia or vascular injury and differentiate into endothelial cells in situ, resulting in an enhanced neovascularisation and reendothelialisation. The use of EPCs as a potential therapeutic agent is limited by the small number of EPCs that can be isolated from peripheral blood. Consequently an ex vivo expansion technique for EPCs is required. The cystein-rich protein 61 (CYR61) is a matricellular signal protein of the CCN family, that promotes endothelial cell proliferation, migration and adhesion in vitro and is shown to be over expressed in the context of tissue regeneration and neovascularisation in vivo. The involvement of EPCs and CYR61 in neovascularisation suggests possible interaction between these two angiogenic factors. This study explores the question whether CYR61 is a potent stimulator of ex vivo expansion of EPCs, without altering the cell phenotype. MATERIALS AND METHODS: The recombinant CYR61 protein was expressed in insect cells as a fusion protein with the IgG Fc-domain and purified via protein G sepharose. Mononuclear cells were isolated from peripheral venous blood of adult healthy human volunteers using density gradient centrifugation, followed by in vitro cultivation with a basic medium for selection of EPCs. From day 2 of cultivation onwards the basic medium was supplemented with CYR61. Control cells were cultured in basic medium alone or were treated with Fc-tag. Cell growth and development was monitored and photographed during the time of culture. Cell proliferation was quantified by cell counting. Phenotypic analysis of EPC based on cell surface marker expression was performed using FACS-analysis and immunhistochemical staining. To evaluate the influence of the treatment with CYR61 on the phenotype of EPCs, the marker expression of the treated an untreated cells was compared. RESULTS: Medium supplementation with CYR61 during in vitro culture of EPCs isolated from peripheral blood resulted in a dose-depend increase of cell proliferation in the concentration range between 0.05 and 1.5µg/ml CYR61. Treatment of EPCs with 0.5µg/ml CYR61 resulted in a 4.1-fold average EPC number increase compared to untreated control cells. FACS analysis and immunhistochemical staining revealed a characteristic EPC surface marker expression profile. Both CYR61 treated and untreated cells showed the same EPC marker expression, demonstrating that CYR61 treatment has no influence on EPC phenotype. CONCLUSION: In conclusion, CYR61 represents a potent stimulator of ex vivo expansion of EPCs isolated from peripheral human blood. This finding suggests a possible application of EPCs expanded ex vivo under CYR61 treatment to stimulate neovascularisation and endothelial regeneration. Such novel cell-based therapeutic strategies may help improve for instance treatment for ischemic heart disease, bone regeneration or vascularisation of tissue engineered constructs.

In der Sepsis kommt es zu einer mikrovaskulären Schrankenstörung. Die genauen Mechanismen hierfür sind noch nicht bekannt. Im klinischen Alltag gibt es noch keine spezifische diagnostische Möglichkeit für den (frühen) Nachweis oder Therapie für die mikrovaskuläre Schrankenstörung. Ein wichtiger Bestandteil der endothelialen Barriere und deren Integrität ist das Adhärenskontaktprotein VE-Cadherin. Es wird vermutet, dass Shedding durch ADAM-10 eine wichtige Rolle bei der Permeabilitätssteigerung spielt. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass es unter Inflammationsbedingungen erstens zu einem Zusammenbruch der Endothelbarriere kommt, zweitens, dass korrespondierend dazu vermehrt sVE-Cadherin im Überstand nachweisbar ist und drittens, dass eine Stabilisierung der Endothelbarriere und Reduktion von sVE-Cadherin sowohl durch einen PDE-4 Inhibitor, als auch durch spezifische ADAM-10 Inhibition möglich ist. Erstmalig konnte dargestellt werden, dass der ADAM-10-Inhibitor GI254023X zu einer wirksamen Barrierestabilisierung und verringerten sVE-Cadherin-Werten führt. Dies lässt darauf schließen, dass Shedding eine Rolle beim Zusammenbruch der Endothelbarriere spielt. Möglicherweise ist sVE-Cadherin selbst ein Faktor, der zum Zusammenbruch der Endothelbarriere führt. Auch bei Sepsispatienten mit schwerer mikrosvaskulärer Schrankenstörung konnten erhöhte sVE-Cadherin-Werte im Serum nachgewiesen werden. Zusammenfassend kann daher die Vermutung aufgestellt werden, dass die Bildung von sVE-cadherin bei der Entzündung eine wichtige Rolle sowohl für die Detektion, als auch bei der Induktion der mikrovaskulären Schrankenstörung spielt. Der Nachweis von sVE-cadherin bei Sepsispatienten könnte als geeigneter Biomarker für den Nachweis einer mikrovaskulären Schrankenstörung in der klinischen Anwendung eine Bedeutung erhalten. / In Sepsis microvascular barrier disruption occurs. The specific mechanisms are not yet known. In the clinical daily routine there is no specific diagnostic possibility for (the early) detection or therapy of microvascular barrier disruption. A major component of the endothelial barrier and her integrity is the adherensprotein VE-cadherin. It is suspected that shedding via ADAM 10 has a major role by increased permeability of the endothelial barrier. In this paper it is shown that amongst inflammatory condition first a breakdown of the endothelial barrier occurs and second corresponding to that more sVE-Cadherin is detectable at cell culture supernatant and third a stabilisation of endothelial barrier and reduction of sVE-Cadherin is possible via PDE-4-inhibitor as well as through specific inhibition of ADAM 10. For the first time it could be shown that the ADAM 10 inhibitor GI254023X leads to an effective stabilisation of the barrierintegrity and reduces sVE-Cadherin. These findings suggests that sVE-Cadherin itself plays a role at the breakdown of endothelial barrier in sepsis. Also in patients with sepsis and severe microvascular barrier disturbance increased sVE-Cadherin amounts in serum were detected. In summary the presumption could be taken that formation of sVE-Cadherin in inflammation plays an important role for detection and induction of microvascular barrier disturbance. Maybe the verification of sVE-Cadherin in sepsis could be an appropriate predictive marker for proof of microvascular barrier disturbance in clinical use.

Univ., Diss., 2006--Giessen

Tübingen, Univ., Diss., 2007.

Zsfassung in dt. Sprache. - Würzburg, Univ., Diss., 2008

Habilitation - Universität, Düsseldorf, 1999.

Universiẗat, Diss., 2007--Frankfurt (Main). / Zsfassung in dt. und engl. Sprache.

Universiẗat, Diss., 2006--Frankfurt (Main). / Zsfassung in dt. und engl. Sprache.

Ca2+ dependent cell adhesion molecules (cadherins) are central for a variety of cell and tissue functions such as morphogenesis, epithelial and endothelial barrier formation, synaptic function and cellular signaling. Of paramount importance for cadherin function is their specific extracellular adhesive trans-interaction. Cadherins are embedded in a cellular environment of intracellular and extracellular regulators that modify cadherin binding in response to various physiological and pathological stimuli. Most experimental approaches used for studying cadherin interaction however lack a physiological proof of principle mostly by not investigating cadherins in their physiological environment. In the present cumulative dissertation, experimental approaches were applied to characterize and modulate vascular endothelial (VE)-cadherin and desmocadherin functions in the (patho-)physiological contexts of endothelial permeability regulation and disturbance of epidermal barrier function, which is typical to the blistering skin disease pemphigus, respectively. Whereas VE-cadherin is a key regulator of the endothelial barrier that separates the blood compartment from the interstitial space of tissues, desmosomal cadherins are crucial for maintenance of epidermal integrity and separation of the external environment from the body’s internal milieu. Cadherin functions were both investigated in cell-free and cell-based conditions: by using biophysical single molecule techniques like atomic force microscopy (AFM), cadherin function could be investigated in conditions, where contributions of intracellular signaling were excluded. These experiments were, however, compared and combined with cell-based experiments in which cadherins of epidermal or endothelial cell cultures were probed by laser force microscopy (laser tweezers), fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and other techniques. The autoimmune blistering skin diseases pemphigus foliaceus (PF) and pemphigus vulgaris (PV) are caused by autoantibodies directed against the extracellular domains of the desmosomal cadherins desmoglein (Dsg) 1 and 3, which are important for epidermal adhesion. The mechanism of autoantibody-induced cell dissociation (acantholysis) in pemphigus, however, is still not fully understood. For the first time, it is shown by AFM force spectroscopy that pemphigus autoantibodies directly inhibit Dsg3 adhesion by steric hindrance but do not inhibit adhesion of Dsg1. However, the full pathogenicity of the autoantibodies depended on cellular signaling processes, since autoantibodies targeting Dsg1 also resulted in loss of cadherin-mediated adhesion in cell-based experiments. However, two other signaling pathways that have been reported to be involved in pemphigus pathogenesis, i.e. epidermal growth factor receptor (EGFR) and c-Src activation, were not found to be important in this context. Furthermore, peptide-based modulators of cadherin functions were generated for Dsg1/3 and VE-cadherin. By comparing Dsg1, Dsg3 and VE-cadherin sequences to published X-ray structures of cadherin trans-interactions, specific amino acid sequences of the binding pockets of these cadherins were identified. Peptide versions of these motifs were synthesized and the antagonistic functions of these “single peptides” were validated by AFM force spectroscopy as well as by cell-based assays. By linking two single peptides in tandem, stabilization of cadherin bonds because of by cross-bridge formation between trans-interacting cadherins was demonstrated. Protective effects of tandem peptides were shown by partly preventing pemphigus autoantibody-induced acantholysis, or in the case of VE-cadherin, by stabilizing endothelial barrier properties against barrier disrupting agents like the Ca2+ ionophore A23187 and an inhibitory VE-cadherin antibody. Most importantly, VE-cadherin tandem peptides abolished microvascular hyperpermeability induced by the physiologic inflammatory agent tumor necrosis factor-α in the rat mesentery in vivo. Both classes of tandem peptides therefore can be considered as a starting point for the generation of potential therapeutic agents that might prevent cell dissociation in pemphigus and breakdown of the endothelial barrier under inflammatory conditions. / Die Familie der Ca2+ - abhängigen Adhäsionsproteine (Cadherine) spielt eine zentrale Rolle bei elementaren zellulären, geweblichen und Entwicklungsprozessen. Eine in der vorliegenden kumulativen Dissertation untersuchte Funktion von Cadherinen ist ihre Rolle beim Aufbau und der Aufrechterhaltung der epidermalen Barriere der Haut und der endothelialen Barriere von Blutgefäßen. Cadherine vermitteln Adhäsion über die extrazelluläre Bindung mit Cadherinen auf der Zelloberfläche angrenzender Zellen. Die durch Cadherine vermittelte Zelladhäsion ist ein dynamischer Prozess, der durch extrazelluläre und intrazelluläre Modulatoren im Zusammenspiel mit vielfältigen physiologischen Prozessen reguliert wird. Vielen Experimentalsystemen fehlt der realistische physiologische und gewebliche Bezug zur funktionellen Bedeutung der untersuchten Eigenschaften der Cadherine. In der vorliegenden kumulativen Dissertation wurden verschiedene Ansätze zur Untersuchung und Modulation von Cadherinen im Hinblick zweier (patho-)physiologischer Prozesse durchgeführt. Zum einen befasst sich die Doktorarbeit mit den Blasen-bildenden Hauterkrankungen der Pemphigus-Gruppe, bei welcher die Funktionsstörung desmosomaler Cadherine im Mittelpunkt steht. Zum anderen wurde das vaskuläre endotheliale (VE)-Cadherin und dessen Rolle bei der Regulation und pathologischen Entgleisung der Gefäßpermeabilität untersucht. Die Funktion dieser Cadherine wurde in der Arbeit sowohl in Zell-freien als auch in Zell-basierten Experimenten analysiert: mittels biophysikalischer Charakterisierung auf Einzelmolekülebene durch Kraftspektroskopie mit dem Atomkraftmikroskop (AFM) konnte die Adhäsion (Transinteraktion) von Cadherinen frei von zellulären Einflüssen isoliert untersucht werden. Diese Einzelmolekülstudien wurden durch Laserkraftmikroskopie (Laserpinzette) und verschiedene zellphysiologische Untersuchungen an epithelialen und endothelialen Zellkulturen und Geweben komplettiert. Bei der autoimmunen Hauterkrankung Pemphigus foliaceus (PF) und Pemphigus vulgaris (PV) bewirken Autoantikörper, die gegen die desmosomale Cadherine Desmoglein (Dsg) 1 und 3 gerichtet sind, eine Zelldissoziation (Akantholyse), die zu einer charakteristischen Blasenbildung auf der Haut der Patienten teils mit Ablösung der Epidermis führt. In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe der AFM-Kraftspektroskopie zum ersten Mal gezeigt, dass Pemphigus-Autoantikörper direkt die Dsg3-vermittelte Adhäsion durch sterische Behinderung inhibieren. Zusätzlich wurden auch Unterschiede in der Pathogenität der Autoantikörper in Abhängigkeit von zellulären Signalwegen gefunden. In früheren Studien konnte bereits gezeigt werden, dass neben der vermuteten Hemmung der Cadherinbindung durch die Autoantikörper auch inhibitorische, die Zelladhäsion herabsetzende zytoplasmatische Signalwege für die Pathogenese dieser Krankheit wichtig sind. Daneben belegen Experimente dieser Arbeit, dass die durch Autoantikörper vermittelte Akantholyse in unseren Versuchsbedingungen unabhängig von der in anderen Studien postulierten Beteilung des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) und von c-Src war. In weiteren Experimenten wurden Peptide zur Modulation der Funktion von Dsg1/3 und VE-Cadherin entwickelt. Dazu wurden die Sequenzen von Dsg1, Dsg3 und VE-Cadherin mit bereits beschriebenen Röntgenkristallstrukturen von anderen Cadherinen verglichen und eigene Strukturmodelle auf der Grundlage einer Analogiemodellierung generiert. Auf diese Weise wurden Sequenzabschnitte identifiziert, die für die Cadherin-Transinteraktion wichtig sind. Aus diesen Sequenzen wurden Peptide abgeleitet, die die Cadherinfunktion entweder in einer agonistischen oder antagonistischen Weise beeinflussen sollten. Die inhibitorische Funktion der Einzelpeptide wurde sowohl durch AFM-Kraftspektroskopie als auch in Zell-basierten Laserpinzetten-Studien validiert. Durch das Zusammenfügen von zwei separaten Einzelpeptidsequenzen wurden Tandempeptide erzeugt. Diese sollten die jeweilige Cadherininteraktion durch das Überbrücken benachbarter adhäsiver Cadherindomänen stabilisieren. Das Dsg-spezifische Tandempeptid verhinderte teilweise die durch Autoantikörper hervorgerufene Akantholyse beim Pemphigus und das VE-Cadherin-spezifische Tandempeptid schützte die Endothelbarriere vor Permeabilitätserhöhung durch das Ca2+ - Ionophor A23187 oder durch einen inhibitorischen VE-Cadherin-Antikörper. In in-vivo-Experimenten an perfundierten Mikrogefäßen des Rattenmesenteriums verhinderte das VE-Cadherin-Tandempeptid den Anstieg der Endothelpermeabilität durch den physiologischen Entzündungsmediator Tumornekrosefaktor-α. Die Tandempeptide können als Ausgangspunkt für die Identifikation von spezifischen therapeutischen Agenzien zur Prävention der Akantholyse beim Pemphigus oder Verlust der VE-Cadherin-Bindung bei vaskulärer Hyperpermeabilität angesehen werden.

Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der endothelialen Stickstoffmonoxid-Synthase in Hinblick auf die Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen bei der spontanen Arterioskleroseentwicklung zu untersuchen. Apolipoprotein E knockout-Mäuse und Apolipoprotein E knockout/endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase knockout-Mäuse dienten dabei als genetisches Modell. Durch IVM-, Real-time PCR-, Western Blot und immunhistochemische Versuche konnte gezeigt werden, dass apoE/eNOS dko-Tiere im Vergleich zu apoE ko-Kontrollen signifikant erhöhte L/E-Interaktionen, eine verstärkte endotheliale Adhäsionsmolekülexpression und eine gesteigerte Makrophagen-Infiltration in die Gefäßwand aufweisen. Duplexsonographisch vergleichbare Widerstands-Indices bei beiden Genotypen belegen eine ähnliche Hämodynamik und schließen veränderte Flussbedingungen als Ursache der erhöhten L/E-Interaktionen aus. Zusammenfassend kann man sagen, dass die verminderte NO-Produktion in apoE/eNOS dko-Mäusen die gesteigerten Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen in diesem Modell bedingt und andere Quellen vaskulären Stickstoffmonoxids, genauer gesagt nNOS und iNOS, dies nicht zu kompensieren vermögen. Überraschenderweise nahm die eNOS-Deletion keinen Einfluss auf die Thrombozyten-Endothelzell-Interaktionen, was gegen eine bedeutende Rolle von Blutplättchen bei der beschleunigten Arterioskleroseentwicklung von apoE/eNOS dko-Mäusen spricht. / It was the aim of the study to analyse the role of the endothelial nitric oxide synthase with regard to the leukocyte-endothelial cell-interactions in spontaneous arteriosclerosis development. Apolipoprotein E knockout mice and apolipoprotein E/endothelial nitric oxide synthase double knockout mice served as genetic models. Intravital microscopy, real-time PCR, western blot and immunohistochemical experiments revealed significantly increased leukocyte-endothelial cell (L/E)-interactions, an elevated expression of endothelial surface adhesion molecules and a heightened macrophage infiltration in carotid arteries in apoE/eNOS dko mice compared to apoE ko control animals. Comparable resistance indexes in duplex ultrasonography of both genotypes show similar hemodynamics and exclude altered flow conditions as cause of increased L/E-interactions. In summary you can say that reduced NO-production in apoE/eNOS dko mice causes the increased L/E-interactions and that other sources of vascular nitric oxide, more precisely nNOS and iNOS, are unable to compensate for that. Surprisingly, eNOS deletion didn’t influence platelet-endothelial cell-interactions, which argues against an important role of platelets in accelerated arteriosclerosis development of apoE/eNOS dko mice.