Dissertation submitted for obtain the degree of Doctor of Philosophy, at the University of Cambridge - Darwin College, under the supervision of Dr. D. Harrison

Dissertação apresentada para obtenção do grau de Doutor, na Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto, sob a orientação do Prof. Doutor Augusto Medina

Dissertação apresentada para obtenção do grau de Doutor, na Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto, sob a orientação do Prof. Doutor Manuel Álvaro Neto Coelho

Dissertação apresentada para obtenção do grau de Doutor, na Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto, sob a orientação do Prof. Doutor Alírio E. Rodrigues

Dissertação apresentada para obtenção do grau de Doutor, na Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto, sob a orientação dos Prof. Doutores Alírio E. Rodrigues, José Miguel Loureiro e Carlos Albino V. Costa

Dissertação apresentada para obtenção do grau de Doutor em Engenharia Química, na Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto, sob a orientação dos Prof. Doutor Alírio Rodrigues e Prof. Doutor Rui Boaventura

Dissertação apresentada para obtenção do grau de Doutor, na Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto, Departamento de Engenharia Química

Dissertação apresentada para obtenção do grau de Doutor, na Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto, sob a orientação do Prof. Doutor Alírio Egídeo Rodrigues

Dissertação apresentada para obtenção do grau de Doutor, na Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2016-01-15T14:35:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 335487.pdf: 1878669 bytes, checksum: 14e3d9e4b4b707f3a67ac29e279e854b (MD5) Previous issue date: 2013 / O bioetanol brasileiro é obtido a partir da fermentação da sacarose, um dissacarídeo presente no caldo de cana-de-açúcar, utilizando a levedura Saccharomyces cerevisiae, principal microorganismo utilizado pelas usinas produtoras de etanol no Brasil. Entre estas leveduras, a linhagem mais amplamente utilizada é a diplóide CAT-1. Esta linhagem de levedura foi isolada do processo industrial de produção de etanol a partir de sacarose da cana-de-açúcar, portanto, adaptada às condições de estresse fermentativo tais como altas concentrações de açúcar e de etanol, temperatura, pH, pressão hidrostática e osmótica, etc. Com estas leveduras, a sacarose é primeiro hidrolisada pela invertase extracelular e/ou periplasmática codificada pelo gene SUC2, gerando glicose e frutose, que são transportados do meio fermentativo para o interior da célula via transporte facilitado por transportadores de hexoses HXT. O processo de hidrólise da sacarose é mais rápido que o transporte das hexoses, o que leva a um acúmulo destes açúcares no meio, causando efeitos negativos à levedura e ao processo industrial. Dentre estes efeitos, destacam-se as perdas de açúcar devido à utilização dos monossacarídeos por bactérias e leveduras selvagens, já presentes no mosto de alimentação da dorna, e o estresse osmótico. Com a propagação de bactérias, é necessário o uso de antibióticos e ajuste do pH devido à produção de ácidos orgânicos no meio. No sentido de evitar a hidrólise extracelular da sacarose e mudar o modo da sua captação pela célula, onde a sacarose passaria a ser transportada ativamente, para o interior da célula, pela permease de alta afinidade AGT1, modificações genéticas no gene SUC2 da levedura industrial CAT-1 foram realizadas visando sobre-expressar a invertase intracelular. A levedura industrial geneticamente modificada passou a ser capaz de captar a sacarose (via co-transporte sacarose-H+ mediado pela permease AGT1) diretamente para o interior da célula, onde é hidrolisada e então fermentada. Duas linhagens geneticamente modificadas com características fenotípicas distintas foram testadas e analisadas neste trabalho. Nas condições testadas, os resultados apresentados mostram que é possível fermentar a sacarose eficientemente via sua captação para o interior da célula, além da grande vantagem da ausência de glicose e frutose no meio fermentativo. Além disso, espera-se outros ganhos como menor estresse osmótico e menor grau de contaminação, com a futura aplicação industrial destas leveduras. Estes ganhos trazem como consequência uma menor utilização de antibiótico e ácido sulfúrico, menor floculação e maior manutenção da viabilidade celular.<br> / Abstract : Brazilian bioethanol is obtained from the fermentation of sucrose, a disaccharide present in sugarcane juice, using Saccharomyces cerevisiae. This yeast is the microorganism most commonly used industrially to produce ethanol in Brazil. The most widely used strain is diploid CAT-1, which was isolated from the industrial ethanol production process from sugarcane sucrose, and it is therefore adapted to the harsh fermentation conditions, such as high concentrations of sugar and ethanol, temperature, pH, and osmotic and hydrostatic pressures. With the use of this yeast, the sucrose is first hydrolyzed by extracellular and/or periplasmic invertase encoded by the SUC2 gene, producing glucose and fructose, which are transported from the fermentation medium into the cell, a process facilitated by hexose transporters (HXT). The hydrolysis of sucrose is faster than the transport of hexoses, leading to an accumulation of these sugars in the medium, which has negative effects on the yeast cells and the industrial process. These effects include a loss of sugar due to the use of monosaccharides by bacteria and wild yeast strains, present in the wort fed to the tank, and osmotic stress. With the propagation of bacteria it is necessary to use antibiotics and adjust the pH due to the production of organic acids in the medium. In order to avoid the extracellular hydrolysis of sucrose and change the mode of its uptake by the yeast cell, where the sucrose would be transported actively by the high-affinity permease AGT1, the modification of the SUC2 gene from of industrial yeast was performed to over-express intracellular invertase. The genetically modified industrial yeast was analyzed in this study and found to be able to carry out sucrose uptake (via sucrose-H+ co-transport mediated by AGT1 permease) directly to the cell interior, where it is hydrolyzed and then fermented. Two genetically modified strains with phenotypically distinct characteristics were tested and analyzed. Under the conditions tested, the results presented by the genetically modified yeasts showed that it is possible to efficiently ferment sucrose via its uptake into the interior of the cell, in addition to obtaining the advantage of the absence of glucose and fructose in the medium. Furthermore, it is expected that with the future industrial application of these yeast strains, other benefits will be verified such as a lower osmotic stress and degree of contamination. These gains lead to a lower demand for antibiotics and sulfuric acid, less flocculation and greater maintenance of cell viability.