Las enfermedades priónicas, también conocidas como EETs (Encefalopatías Espongiformes Transmisibles), son un grupo de enfermedades neurodegenerativas fatales que, debido a su transmisibilidad potencial han tenido un gran impacto social, político y económico en las últimas décadas. Las EETs afectan a los humanos y a algunos grupos de animales, presentan largos períodos de incubación y producen la muerte pocos meses después de la aparición de la sintomatología clínica. Su origen se atribuye a la presencia, multiplicación y deposición de una proteína anormal llamada prión. El prión (o PrPSc) es una forma mal conformada de la proteína priónica celular (PrPc), presente en condiciones fisiológicas en las membranas de las células. El prión es parcialmente resistente a las proteasas, resistente a desinfectantes físico-químicos convencionales, y capaz de convertir de forma auto-catalítica a la PrPc dando lugar a la propagación en cadena de la forma patogénica. El prión es transmisible, no sólo entre individuos de una misma especie sino también entre individuos de especies diferentes. Las EETs animales más importantes son el scrapie, que afecta a las ovejas y las cabras, y la encefalopatía espongiforme bovina (EEB), que afecta a las vacas (vulgarmente conocida como "mal de las vacas locas").En el caso de las EETs humanas, las más relevantes son la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), el síndrome de Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS), el insomnio familiar fatal (FFI) y el Kuru. La ECJ tiene una incidencia de 1 o 2 casos por millón de habitantes y año en todo el mundo, afecta por igual a hombres y mujeres, y cursa con demencia, mioclonías y ataxia cerebelar. Neuropatológicamente, provoca pérdida neuronal, astrocitosis, microgliosis y cambio espongiforme. La presencia de la proteína 14-3-3 en el LCR y de un EEG típico, son factores diagnóstico, aunque el diagnóstico definitivo se hace a nivel post-mortem con la detección de la PrPSc por inmunohistoquímica y/o western blot.El impacto social y sobre la salud pública y animal que han tenido las enfermedades priónicas en las últimas décadas fue originado, en gran medida, por la epidemia de EEB que afectó en los años 90 al Reino Unido, principalmente. Esta epidemia se atribuyó a la alimentación de las vacas con piensos enriquecidos con proteínas procedentes de ovejas infectadas con scrapie. Debido a la transmisibilidad ínter-específica de los priones, éstos infectaron a las vacas y éstas, al pasar a la cadena alimenticia, a los humanos, dando lugar a la nueva variante de la ECJ. La ECJ tiene un origen esporádico en un 85% de los casos, es decir, el inicio de la enfermedad se produce de manera espontánea, a pesar de que éste se asocia a la presencia de priones residuales en el SNC, a la generación de mutaciones puntuales en el gen de la PrP (PRNP) o bien a la conversión espontánea de la PrP debido a alteraciones físico-químicas de la proteína. En el 10% de los casos, la ECJ es genética y hereditaria, es decir, se atribuye a mutaciones en el PRNP que pasan a las células germinales y a la nueva generación. En este escenario, se habla de ECJ familiar. El 5% de los casos de ECJ restantes se asocian a una transmisión iatrogénica, es decir, por contaminación durante transplantes, tratamientos hormonales, manipulación quirúrgica, etc., aunque este tipo de transmisión está prácticamente erradicada. El propósito general de esta tesis es el estudio de las EETs dirigido a incrementar el conocimiento acerca de los mecanismos celulares y moleculares implicados en la neuropatología de estas enfermedades. Si bien la multiplicación y deposición del prión se consideran los detonantes de la neuropatología y sintomatología clínica asociadas a las EETs, es asumible que los mecanismos involucrados en estas alteraciones sean complejos y tengan un origen multifactorial. En este escenario, las alteraciones en la neurotransmisión y la disfunción de algunos grupos de proteínas relacionados con la supervivencia celular se consideran cruciales en el desarrollo de las enfermedades priónicas y de sus fenómenos neuropatológicos asociados. Atendiendo a las observaciones anteriores, esta tesis se ha enfocado a estudiar el papel que juegan ciertos grupos de proteínas en la neurotransmisión, la espongiosis y la muerte neuronal. Para abordar experimentalmente cada una de estas líneas de interés, nuestros estudios van ecaminados a: conocer el estado de la vía de señalización vinculada a la transmisión glutamatérgica y de adenosina; conocer el papel de los canales de agua o aquaporinas cerebrales en relación a la vacuolización y al cambio espongiforme característico de las EETs y, por último, estudiar la vía de señalización de las MAPKs en relación a la degeneración neuronal. Estos estudios se realizan sobre corteza frontal de material humano post-mortem de casos con ECJ y sobre la corteza cerebral de un modelo murino de la EEB, esto es, de ratones transgénicos para la PrP bovina infectados con EEB en diferentes estadíos de desarrollo de la enfermedad. Los resultados obtenidos muestran, en primer lugar, un deterioro de las vías de señalización de los receptores metabotrópicos de glutamato de grupo I en la corteza frontal de ECJ así como en la corteza cerebral de un modelo murino de la EEB asociado al progreso de la enfermedad, lo cual sugiere que las fosfolipasas y los elementos constituyentes de la transducción de señales de dicha vía son particularmente sensibles a las EETs. En segundo lugar, se ha encontrado un incremento de la expresión y la actividad de los receptores A1 de adenosina en la corteza frontal de casos con ECJ así como un aumento de la expresión de estos receptores en corteza cerebral de un modelo murino de la EEB asociado al progreso de la enfermedad. El incremento en los niveles de A1Rs puede ser una respuesta al daño neuronal, teniendo en cuenta su papel neuroprotector en el SNC. En tercer lugar, se ha detectado un incremento de la expresión de AQP1 y AQP4 en la corteza frontal de casos con ECJ así como en la corteza cerebral de un modelo murino de la EEB asociado al progreso de la enfermedad. El incremento de la expresión de AQPs se puede asociar a una alteración de la homeostasis celular y a la formación de vacuolas que pueden contribuir al cambio espongiforme característico de las enfermedades priónicas. Por último, se ha encontrado un descenso de los niveles proteicos de los factores de transcripción c-fos y CREB en la corteza frontal de casos con ECJ, en contraste con el mantenimiento de los niveles de las MAPKs. El agotamiento de c-fos y CREB puede inducir neurodegeneración en estadios terminales de ECJ, considerando su papel mediador en los fenómenos de muerte y supervivencia celular.Si bien, los resultados que se desprenden de esta tesis mejoran la comprensión de los fenómenos celulares y moleculares que acompañan a la patología de las EETs, serán necesarios estudios ulteriores con modelos celulares y animales para conocer con mayor exactitud de qué modo y en qué medida contribuye el prión a estas alteraciones. / Prion diseases, also known as Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSEs), are a group of fatal neurodegenerative diseases that have had an important social, political and economical impact in the last decades, according to their potential transmissibility. TSEs affect human and animals, and their incubation period is long. They caused death after a few months from the first clinical symptoms. TSEs origin is associated to the presence, multiplication and deposition of an abnormal protein called prion. Prion, also called PrPSc, is an abnormal form of the cellular prion protein (PrPC), which is a cell-anchored glycoprotein expressed in a wide range of animal tissues but it is enriched into the central nervous system (CNS). Prions are partially resistant to protease digestion and also resistant to conventional physical-chemical treatments. Prions are able to recruit PrPC leading to the propagation of the pathogenic conformation. Prions are transmissible, not only between individuals from the same specie, but also between individuals from different species.The most important animal TSEs are scrapie, affecting sheep and goats, and Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE) affecting cows (also called mad cow disease). In humans, TSEs include Creutzfeldt-Jakob disease (CJD), Gerstmann-Sträussler-Scheinker syndrome (GSS), Fatal Familial Insomnia (FFI) and Kuru. CJD has an incidence of 1 or 2 cases per million of population within a year around the world, affects both men and women and causes dementia, myoclonia and cerebellar ataxia. Neuropathologically, CJD is characterized by neuron loss, astrocytosis, mycroglyosis and spongiform change. The presence of 14-3-3 protein in CSF and a typical EEG are diagnosis factors but final diagnosis is done by PrPSc detection by immunohistochemistry of Western blotting. The impact of TSEs on public and animal health in the last decades was originated, mainly, by the BSE epidemic which affected United Kingdom in the nineties. This epidemic was attributed to the enrichment of cows food with proteins derived from scrapie-infected sheep. Due to the inter-specific transmissibility of prions, cows became infected from consumption of cow-derived food. CJD has a sporadic origin in 85% of cases. This origin is associated to the presence of residual prions into the brain or to punctual mutations in the prion protein gene (PRNP) or to a spontaneous PrP conversion due to physical or chemical environmental changes. The rest of CJD cases have an inherited or an iatrogenic transmission.The general purpose of this thesis is the study of TSEs directed to increase knowledge about cellular and molecular mechanisms involved in the neuropathology of prion diseases. It can be assumed that the multiplication and accumulation of prions into the CNS are likely the causes of TSEs, but also that mechanisms associated to neuropathologycal alterations linked to prion pathology have probably a multifactor origin. In this scenario, the alterations in neurotransmission and the dysfunction of many groups of proteins related to cell survival are considered crucial in the development of prion diseases and their neuropathological features. Giving some consideration to these observations, this thesis has been focused in the study of the role of some groups of proteins in neurotransmission, spongiform change and neuron loss. More specifically, we have studied signalling pathways linked to glutamate and adenosine transmission, water channel brain aquaporins in relation with vacuolization and spongiform change, and MAPKs signaling in relation with neurodegeneration. All these studies have been done on human cerebral cortex from neurological post-mortem material of CJD cases and on the cerebral cortex of BSE-infected PrP-bovine transgenic mice at different stages of disease progression. The results obtained show, first of all, impaired group I metabotropic glutamate transmission and also increased adenosine A1 receptor signaling in the cerebral cortex of CJD cases and, on the other hand, in the cerebral cortex of a BSE murine model with disease progression. Increased adenosine A1 receptor levels could be a response to neuronal damage due to the neuroprotective role of these receptors into the brain. In addition, we have found an increased AQP1 and AQP4 expression in the cerebral cortex of CJD cases and in the cortex of a BSE murine model with disease progression. Increased AQPs expression in brain could be associated with abnormal cell homeostasis and with the formation of vacuoles which can lead to spongiform change. Finally, we have also found decreased c-fos and CREB levels, in both inactivated and activated forms, in frontal cortex of CJD cases and also in the cerebral cortex of a BSE murine model with disease progression. Decreased c-fos and CREB transcription factors are associated with cell death and cell death, so could lead to neurodegeneration in terminal stages of CJD. Although the results presented here can improve the understanding of cellular and molecular events involved in TSEs pathology, further studies using animals and cell models would be necessary to know more exactly whether prions can lead to these alterations.

INTRODUCCIÓN: Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) o enfermedades por priones son un grupo de enfermedades neurodegenerativas letales que afectan al ser humano y a otros mamíferos. El agente causal de estas enfermedades es el prión, que es una isoforma anómala de una proteína celular normal codificada en el gen PRNP. La Organización Mundial de la Salud, en 1998, estableció, para el diagnóstico de las enfermedades priónicas humanas, las categorías de definitivo, probable y posible. El diagnóstico se confirma en el estudio neuropatológico, o, en el caso de las formas genéticas, en el análisis genético si este demuestra la presencia de una mutación patogénica en el gen de PRNP. El diagnóstico de ECJ in vivo, con categoría de probable, se realiza cuando a una serie de criterios clínicos se añade la presencia de complejos periódicos en el EEG o la prueba de proteína 14-3-3 positiva en el caso de las formas esporádicas. Con el nombre de proteína 14-3-3 se denomina a una familia de proteínas especialmente abundante en sistema nervioso central y su detección a través de un método de inmunoblot, se demostró que se asociaba al diagnóstico de ECJ esporádica.OBJETIVOS: O1: Estudiar la evolución de la demanda y la validez de la prueba de proteína 14-3-3 durante el periodo 1997-2000 en España. O2: Mejorar la sensibilidad y especificidad de la prueba de la proteína 14-3-3 para el diagnóstico de enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ) y analizar los patrones atípicos en el resultado de la prueba. O3: Analizar el polimorfismo del exon 1 del gen Tau en enfermedades por priones y determinar si este modifica la predisposición a padecer enfermedades priónicas o la expresión clínica de estas. O4: Caracterizar clínica y genéticamente las enfermedades por priones humanas en Cataluña en el periodo 1993-2001 TRABAJOS que conforman esta tesis doctoral: T1: Utilización y validez de la prueba de la proteína de 14-3-3 en el diagnóstico de enfermedades priónicas: estudio prospectivo de 4 años. Medicina Clínica 2003 (en prensa). T2: Isoformas de la proteína 14-3-3 y patrones atípicos en la prueba de la 14-3-3 en el diagnóstico de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. Neuroscience Letters 2002; 320: 69-72. T3: Análisis del polimorfismo del exon 1 del gen Tau en las encefalopatías espongiformes transmisibles. Journal of Neurology 2002; 249: 938-939. T4: Características clínicas y genéticas de las enfermedades priónicas humanas en Cataluña (1993-2001). CONCLUSIONES: C1. El número de pruebas de proteína 14-3-3 en LCR solicitadas a nuestro laboratorio se ha incrementado a lo largo del periodo 1997-2000. Paralelamente, han aumentado el número de falsos positivos y disminuido el valor predictivo positivo de la prueba . Las causas más frecuentes de FP pueden y deben ser excluidas por la evaluación clínica y las pruebas complementarias apropiadas. Un resultado negativo es altamente predictivo de ausencia de la enfermedad en nuestro medio. C2. Los anticuerpos frente a las diferentes isoformas de proteína 14-3-3 no aumentan la sensibilidad ni la especificidad obtenida con el anticuerpo estándar para el diagnóstico de ECJ. La banda inferior característica de patrones de positividad atípicos de la prueba de 14-3-3, se origina por una reacción cruzada del anticuerpo anti-proteína 14-3-3 con las cadenas ligeras de immunoglobulinas libres presentes en el LCR. C3. No existe evidencia, en nuestra población, de asociación entre el polimorfismo del exón 1 del gen Tau y la predisposición a padecer enfermedades priónicas, o el perfil de expresión clínico de la enfermedad. C4. La distribución de los subtipos etiológicos y de las características genéticas y clínicas de los pacientes catalanes con enfermedades priónicas es similar a lo descrito en otras poblaciones europeas. Hasta un tercio de las formas genéticas diagnosticadas carecían de antecedentes familiares conocidos. Las formas valina-valina de ECJ esporádica y las formas genéticas presentan con más frecuencias manifestaciones clínicamente atípicas. No se ha detectado ningún caso de variante de ECJ en Cataluña en el periodo estudiado.