Made available in DSpace on 2014-07-29T16:11:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao lenis farmacia.pdf: 979538 bytes, checksum: 87e0e8efbc86129446e270aa9e9aa8b5 (MD5) Previous issue date: 2009-06-26 / Before the approval of an active compound, metabolism studies are necessary to ensure its safety, once active metabolites could be synthesized during human biotransformation. The use of eukaryotic microorganisms for the study of drug metabolism has been widely explored, due to its capability of producing metabolites similar to the mammalians, and in silico studies consist in a fast strategy when compared with traditional metabolism studies. In this context, molecular modeling, using docking of molecules of interest in the active site of enzymes involved in drug metabolism, is a useful tool to evaluate the interactions between drug and receptor, because it could predict favorable orientations that could be biotransformated. In this work, sixteen filamentous fungi strains, obtained from collections and isolated from soil in the central Brazil, were evaluated for their capability of the antiretroviral stavudine biotransformation, also complemented by animal metabolism studies and molecular modeling of the most relevant cytochrome P450 isoform of human metabolism: CYP3A4. From the bioconversion experiments, the fungus Cunninghamella elegans ATCC 26169 was capable of metabolize stavudine, forming mammalian metabolites, producing the thymine derivative. Dynamic molecular studies demonstrated that the most probable reactions for stavudine, catalyzed by CYP3A4, involves hydroxylation of methyl group (position C-7) and the double bond epoxidation of the furanic ring, showing the importance of some residues of the active site in this process, like Arg212 / Antes da aprovação de uma substância ativa, estudos do metabolismo são necessários para garantir sua segurança, uma vez que metabólitos ativos podem ser produzidos durante a biotransformação no organismo humano. O uso de microrganismos eucarióticos para estudos do metabolismo de fármacos tem sido bastante explorado, devido à sua capacidade de produzir metabólitos semelhantes aos de mamíferos, e os estudos in silico consistem em uma estratégia rápida quando comparada com os estudos tradicionais. Dentro deste contexto, a modelagem molecular, utilizando docking de moléculas de interesse no sítio ativo de enzimas envolvidas no metabolismo, é empregada para a avaliação das interações entre o fármaco e a proteína, podendo prever as orientações favoráveis à biotransformação. Neste trabalho, dezesseis cepas de fungos filamentosos, obtidas de coleções e isoladas do Cerrado, foram utilizadas para o estudo do metabolismo do anti-retroviral estavudina, e complementadas pelo estudo do metabolismo animal e pelo emprego da modelagem molecular da isoforma humana de citocromo P-450 mais importante para o metabolismo: CYP3A4. A partir dos experimentos de bioconversão, a cepa Cunninghamella elegans ATCC 26169 foi capaz de biotransformar a estavudina de forma semelhante aos mamíferos, produzindo o derivado timina. Os estudos de dinâmica molecular, por sua vez, demonstraram que as reações mais prováveis para a estavudina, catalisadas pelo CYP3A4, envolvem a hidroxilação da metila (posição C-7) e a epoxidação da dupla ligação pertencente ao anel furânico, evidenciando, ainda, a importância de determinados resíduos do sítio ativo neste processo, como a arginina 212

O sistema celulolítico do fungo filamentoso Trichoderma reesei é induzido transcricionalmente em pelo menos 1000 vezes pelo crescimento do fungo na presença de celulose e fortemente reprimido por glicose. Usando a abordagem de deleção no promotor, determinou-se que a região localizada entre -241 e -72 bp, em relação ao TATA box, denominada UARcb1, é responsável pela transcrição estimulada por celulose da enzima celobiohidrolase I (cbhl). Neste trabalho mostramos que essa região controla a transcrição de um gene repórter, sofrendo repressão por glicose, em Saccharomyces cerevisiae, um microrganismo que não possui os genes necessários para a utilização de celulose. A transcrição mediada por UARcbl, que é controlada por glicose, requer o produto do gene SNFl, uma proteína quinase, e dois repressores: SSN6 e TUP1, cujos papéis no controle de genes reprimidos por glicose, na levedura, são bem estabelecidos. Nossos resultados indicam um mecanismo conservado de controle por glicose em microrganismos eucarióticos. / The cellulotic system of the filamentous fungus Trichoderma reesei is transcriptionally induced 1000 -fold in presence of cellulose and is strongly repressed by glucose. Using the promoter deletion approach, the upstream activating region (UARcbl) responsible for cellulose-stimulated transcription of the major member of the cellulase system, cellobiohydrolase I, was localized between -241 and -72 relative to the TATA box. In this work we show that this region controls transcription and mediates glucose repression of a reporter gene in Saccharomyces cerevisiae, a unicellular microorganism that lacks the genes required for the utilization of cellulose. Glucose-controlled transcription mediated by the UARcbl requires the product of SNF1 gene, a protein kinase, and two repressors SSN6 and TUP1, which are well estalished in controlling glucose-represible yeast genes. Our results indicate a conserved mechanism of glucose control in eukariotic microorganisms.

O sistema celulolítico do fungo filamentoso Trichoderma reesei é induzido transcricionalmente em pelo menos 1000 vezes pelo crescimento do fungo na presença de celulose e fortemente reprimido por glicose. Usando a abordagem de deleção no promotor, determinou-se que a região localizada entre -241 e -72 bp, em relação ao TATA box, denominada UARcb1, é responsável pela transcrição estimulada por celulose da enzima celobiohidrolase I (cbhl). Neste trabalho mostramos que essa região controla a transcrição de um gene repórter, sofrendo repressão por glicose, em Saccharomyces cerevisiae, um microrganismo que não possui os genes necessários para a utilização de celulose. A transcrição mediada por UARcbl, que é controlada por glicose, requer o produto do gene SNFl, uma proteína quinase, e dois repressores: SSN6 e TUP1, cujos papéis no controle de genes reprimidos por glicose, na levedura, são bem estabelecidos. Nossos resultados indicam um mecanismo conservado de controle por glicose em microrganismos eucarióticos. / The cellulotic system of the filamentous fungus Trichoderma reesei is transcriptionally induced 1000 -fold in presence of cellulose and is strongly repressed by glucose. Using the promoter deletion approach, the upstream activating region (UARcbl) responsible for cellulose-stimulated transcription of the major member of the cellulase system, cellobiohydrolase I, was localized between -241 and -72 relative to the TATA box. In this work we show that this region controls transcription and mediates glucose repression of a reporter gene in Saccharomyces cerevisiae, a unicellular microorganism that lacks the genes required for the utilization of cellulose. Glucose-controlled transcription mediated by the UARcbl requires the product of SNF1 gene, a protein kinase, and two repressors SSN6 and TUP1, which are well estalished in controlling glucose-represible yeast genes. Our results indicate a conserved mechanism of glucose control in eukariotic microorganisms.