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Les microorganismes jouent un rôle prépondérant dans le fonctionnement des écosystèmes aquatiques, où ils sont à la base de la minéralisation et du recyclage de la matière organique. Les« vrais » champignons, ou Eumycètes, font partie de ces microorganismes hétérotrophes qui permettent le renouvellement de la matière organique dans les écosystèmes. Pourtant, la diversité et l’importance quantitative et fonctionnelle des champignons restent très largement méconnues dans les milieux pélagiques. Récemment, l’utilisation de méthodes moléculaires pour étudier la diversité des picoeucaryotes (de taille < 5 μm) lacustres a mis en évidence l’importance des champignons microscopiques avec, notamment, la présence de chytridiomycètes (chytrides). Cette découverte, en conjonction avec le rôle important connu des Eumycètes dans d’autres écosystèmes naturels, nous a amené à poser l’hypothèse d’une diversité et d’un rôle fonctionnel importants des champignons dans les écosystèmes pélagiques. Ce travail vise à préciser la diversité globale, la structure génétique et l’importance quantitative des différentes divisions du règne des Eumycota dans les écosystèmes pélagiques lacustres, et à proposer des outils méthodologiques pour l’étude écologique de ces peuplements. La diversité phylogénétique et l’importance des champignons de taille comprise entre 0,6 et 150 μm ont été analysées dans trois milieux pélagiques différents. Une étude de clonage-séquençage de l’ADNr 18S et de l’ITS a été réalisée au printemps 2007 dans les lacs Pavin (oligomésotrophe), Aydat (eutrophe) et Vassivière (mésotrophe, humique). L’affiliation phylogénétique des séquences a permis, non seulement de confirmer la présence d’une importante diversité de chytridiomycètes parasites du phytoplancton, mais aussi de mettre en évidence la présence non négligeable d’ascomycètes et de basidiomycètes, potentiellement saprophytes. L’étude de la dynamique saisonnière de la structure des peuplements (par TRFLP) et de l’importance quantitative de différentes divisions (par PCR quantitative) de la communauté fongique ont permis de déceler des différences en fonction des saisons et de l’écosystème. Ces différences ont été reliées à la dynamique des peuplements phytoplanctoniques, avec une influence des apports allochtones, principalement dans le lac eutrophe d’Aydat. De plus, les séquences moléculaires générées au cours de ces dernières années ont permis l’élaboration d’amorces ciblant des clades de champignons microscopiques d’intérêt, pour une étude écologique de la dynamique des peuplements, par des approches PCR à temps réel et FISH (fluorescent in situ hybridization). Enfin, nous considérons que l’acquisition de données complémentaires permettra d’intégrer les champignons saprophytes et parasites dans les flux de matière et d’énergie qui transitent par les écosystèmes pélagiques et les cycles biogéochimiques associés. / Microorganisms play major roles in aquatic ecosystems, primarily as the main actors for organic matter mineralization and recycling. “True” fungi (i.e. Eumycota) are among heterotrophic microorganisms that are highly efficient in recycling organic materials in natural ecosystems. However, the overall diversity of fungi and their quantitative and functional importance remain largely unknown in typical pelagic ecosystems. Environmental 18S rDNA surveys have recently highlighted the importance of microscopic fungi in the diversity of picoeukaryotes (size < 5 μm) in lake ecosystems, including particularly the members of chytridiomycetes (i.e. chytrids) as the dominant phyla. These studies and the known major roles of fungi in natural ecosystems such as soils have leaded us to venture the hypothesis that fungal diversity and functional roles are important structuring factors in pelagic ecosystems. The main aims of the thesis were to examine the overall diversity, genetic structure and quantitative importance of various phyla belonging to the Kingdom Fungi in freshwater pelagic ecosystems. Methodological tools were also developed for ecological investigations of fungal populations of interest. Phylogenetic diversity and quantitative importance of fungi (size classe: 0.6 and 150 μm) were analysed in three contrasting pelagic lakes. Environmental 18S and ITS rDNA surveys were performed during spring 2007 in the oligomesotrophic Lake Pavin, the eutrophic Lake Aydat, and the mesotrophic and humic Lake Vassivière, all located in the French Massif Central. Phylogenetic affiliation of sequences confirmed the presence and the substantial diversity of chytridiomycetes, known as parasites of primarily phytoplankton. We also have unveiled a sizeable number of sequences belonging to the fungal lineages of ascomycetes and basidiomycetes, mainly known as saprophytes. The seasonal dynamics of fungal community structure (essayed by TRFLP),and the quantitative importance of various taxonomic divisions (estimates by real time quantitative PCR or qPCR), revealed significant differences with seasons and with ecosystems. These differences were linked to phytoplankton composition and population successions, with at times the influence of allochthonous inputs, primarily for the eutrophic Lake Aydat. Finally, molecular sequences obtained during the few past years allowed the development of primers for targeting microscopic fungal lineages of interest, and the ecological study of their in situ dynamics using qPCR and FISH (fluorescent in situ hybridization) approaches. Overall, we consider that the acquisition of complementary data is necessary to allow the inclusion of fungi and their main functions (i.e. saprophytisms and parasitism) in the energy and matter fluxes in pelagics ecosystems, and the related biogeochemical cycling.