Le travail effectué au cours de cette thèse a porté sur le développement et la mise en œuvre de nouvelles stratégies en microscopie non linéaire permettant d'augmenter le nombre de signaux non linéaires simultanément observables d'une part, et la vitesse d'acquisition d'autre part. Dans un premier temps, nous avons exploré la possibilité de produire des signaux multiples au moyen de deux trains d'impulsions synchronisés de longueur d'onde centrale distincte. Nous avons montré que cette approche permet d'exciter de façon optimale et simultanée trois protéines fluorescentes respectivement bleue, jaune, et rouge. Une application de cette méthode consiste à imager de grands volumes de tissus marqués avec des transgènes Brainbow dans le but d'étudier la connectivité ou le lignage cellulaire. Plus généralement, nous avons montré que cette approche permet de combiner plusieurs signaux non linéaires tels que la fluorescence, la génération de seconde (SHG) et de troisième (THG) harmoniques, ainsi que le mélange à quatre ondes (FWM). Dans un deuxième temps, nous avons étudié la possibilité d'augmenter la vitesse d'imagerie. Pour cela, nous avons mis en œuvre plusieurs manières de produire des faisceaux de Bessel focalisés afin d'augmenter la profondeur de champ d'un microscope à balayage. Enfin, en vue d'augmenter la vitesse d'acquisition tout en préservant le sectionnement optique, nous avons construit un microscope biphotonique à nappe de lumière de profil spatial programmable. Dans cette géométrie nous avons comparé les propriétés d'imagerie de profils d'excitation de type gaussien et de Bessel pour des applications en biologie du développement.