Nowadays, the main challenges in the wastewater treatment sector entail the need to advance in the control and optimization of the processes. New strategies and/or treatment systems are in continuous development, in order to decrease the operational costs and to compliance the energy efficiency and quality objectives of wastewater treatment plants (WWTPs). Therefore, it is increasingly necessary to deepen knowledge of the dynamic of the microbial populations in activated sludge, mainly protists, metazoans and filamentous bacteria. Many studies have attempted to relate protists and metazoans to physicochemical and operational variables of WWTPs in order to reveal their possible value as bioindicators. However, these studies have been mainly descriptive and/or exploratory, and moreover they have not focused on the environmental interpretation. Studies about the dynamics of filamentous bacteria population in activated sludge have mainly focused on the elucidation of the taxonomic position, in situ ecophysiology, presence and distribution, as well as strategies for controlling the populations. However, the published works about the biological process from the point of view of the environmental interpretation is still scarce. On the other hand, the environmental variables used to explain the variability of protists, metazoans and filamentous bacteria in activated sludge have been scarce and some of them are poorly explored. Taking into account the previous considerations, the general objective has been to elucidate the relationships between biological variables and physicochemical and operational variables in WWTPs. This has allowed to carried out an ecological interpretation of the processes that take place in the biological reactors, and to propose new tools for monitoring the process and the advance in the knowledge of those filamentous bacteria that cause problems in the treatment plants. To accomplishment the objectives, samples from activated sludge, influent and treated effluent were collected every fifteen days from six bioreactors belonging to four different WWTPs. Environmental and biological variables were independently explored according to bioreactor and seasonal factors, using multivariate non-parametric statistical routines. Subsequently, a dual approach (linear and unimodal) was applied to investigate models of environmental interpretation of biological variables, using distance-based linear models, as well as the canonical correspondence analysis. The results obtained indicate that the dynamics of protists and metazoans populations are influenced by season and bioreactor characteristics. Also, the factor that explain the dynamics of filamentous bacteria is the bioreactor factor. In this study we have proposed certain protists and metazoa as new bioindicators of the nitrification process. On the other hand, the exhaustive exploration of the environmental variables has determined the suitability of its categorization, as well as the study of the biological inertia of the operational variables, prior to the construction of the models. In addition, it is advisable that the ecological interpretation in each bioreactor will be more priority than their joint interpretation. The multivariate models constructed have provided relevant information about the relationships between protists and metazoans and some plant control variables, allowing their ecological interpretation and obtaining bioindicators for monitoring the biological process in active sludge. Finally, the results obtained on the identification and quantification of filamentous bacteria have verified that the results of the conventional microscopy are not comparable with those obtained from the FISH technique, except in the cases of Microthrix parvicella and GALO. In addition, the construction of models allows associating the filamentous bacteria to environmental ranges, obtaining valuable information to the knowledge of these dynamic populations. / En la actualidad, los principales retos en el sector del tratamiento de las aguas residuales implican la necesidad de avanzar en el control y optimización de los procesos, que permitan encontrar nuevas estrategias y/o nuevos sistemas de tratamiento para el ahorro de los costes de explotación y el cumplimiento de los objetivos de eficiencia energética y calidad en las estaciones depuradoras de aguas residuales (EDAR). Por todo ello, cada vez es más necesario el conocimiento de la dinámica de las poblaciones microbianas que componen la comunidad biológica del sistema, principalmente los protistas, metazoos y bacterias filamentosas. Numerosos estudios han intentado relacionar protistas y metazoos con variables fisicoquímicas y operacionales de las plantas para revelar su valor bioindicador, si bien estos han tenido un carácter principalmente descriptivo y/o exploratorio, y no de interpretación ambiental. Respecto al estudio de las poblaciones de bacterias filamentosas en fangos activos, a menudo relacionadas con episodios de bulking y foaming, estos se han centrado principalmente en el esclarecimiento de su posición taxonómica y ecofisiología in situ, presencia y distribución, así como en el estudio de las medidas para su control. Teniendo en cuenta las consideraciones anteriormente descritas, el objetivo general planteado en la presente tesis doctoral ha sido dilucidar las relaciones significativas entre variables biológicas y fisicoquímicas y operacionales en diversas plantas de fangos activos, lo cual nos ha permitido una interpretación ecológica de los procesos que tienen lugar en los reactores biológicos, proponiendo así nuevas herramientas para la monitorización del proceso y el avance en el conocimiento de aquellos microorganismos filamentosos que causan problemas en las instalaciones. Para el cumplimiento de los objetivos se tomaron, con una frecuencia quincenal y durante un año, muestras de fango activo, agua residual afluente y efluente tratado, procedentes de seis biorreactores de cuatro EDAR. Ambos conjuntos de variables, ambientales y biológicas, fueron explorados individualmente según los factores biorreactor y estacional, empleando rutinas estadísticas multivariantes no paramétricas. Posteriormente, se aplicó un doble enfoque (lineal y unimodal) para la búsqueda de modelos de interpretación ambiental de las variables biológicas. Los resultados obtenidos indican que la dinámica poblacional de protistas y metazoos se encuentra influida en muchos casos por ambos factores, estacional y biorreactor, siendo este último el que influye principalmente en la dinámica de las bacterias filamentosas. En el caso de protistas y metazoos, se han propuesto nuevos bioindicadores del proceso de nitrificación. Por otro lado, la exploración exhaustiva de las variables ambientales ha determinado la conveniencia de su categorización, así como el estudio de la inercia biológica de las variables operacionales, anterior a la construcción de los modelos. Además, recomendamos que la interpretación ecológica en cada uno de los biorreactores sea prioritaria a su interpretación conjunta. Los modelos construidos han aportado información relevante sobre las relaciones entre protistas y metazoos y algunas variables de control de planta, permitiendo su interpretación ecológica y la obtención de bioindicadores para la monitorización del proceso biológico en fangos activos. Por último, los resultados obtenidos sobre identificación y cuantificación de bacterias filamentosas nos han permitido constatar que los resultados de la microscopia convencional no son comparables con aquellos obtenidos a partir de la técnica FISH, excepto en los casos de Microthrix parvicella y GALO. Además, la construcción de modelos permite asociar las distintas bacterias filamentosas a diferentes rangos ambientales, obteniendo una información valiosa para el conocimiento de su dinámica poblacional. / En l'actualitat, els principals reptes en el sector del tractament de les aigües residuals impliquen la necessitat d'avançar en el control i optimització dels processos, que permeten trobar noves estratègies i/o nous sistemes de tractament per a l'estalvi dels costos d'explotació i el compliment dels objectius d'eficiència energètica i qualitat en les estacions depuradores d'aigües residuals (EDAR). Per tot això, cada vegada és més necessari el coneixement de la dinàmica de les poblacions microbianes que componen la comunitat biològica del sistema, principalment els protists, metazous i bacteris filamentosos. Nombrosos estudis han intentat relacionar protists i metazous amb variables fisicoquímiques i operacionals de les plantes per a revelar el seu valor bioindicador, si bé estos han tingut un caràcter principalment descriptiu i/o explorador, i no d'interpretació ambiental. Respecte a l'estudi de les poblacions de bacteris filamentosos en fangs actius, sovint relacionades amb episodis de bulking i foaming, estos s'han centrat principalment en l'esclariment de la seua posició taxonòmica i ecofisiologia in situ, presència i distribució, així com en l'estudi de les mesures per al seu control. Tenint en compte les consideracions anteriorment descrites, l'objectiu general plantejat ha sigut dilucidar les relacions significatives entre variables biològiques i fisicoquímiques i operacionals en diverses plantes de fangs actius, la qual cosa ens ha permés una interpretació ecològica dels processos que tenen lloc en els reactors biològics, proposant així noves ferramentes per a la monitorització del procés i l'avanç en el coneixement d'aquells microorganismes filamentosos que causen problemes en les instal·lacions. Per al compliment dels objectius es van prendre amb una freqüència quinzenal i durant un any, mostres de fang actiu, aigua residual afluent i efluent tractat, procedents de sis bioreactors de quatre EDAR. Ambdós conjunts de variables, ambientals i biològiques, van ser explorats individualment segons els factors bioreactor i estacional, emprant rutines estadístiques multivariants no paramètriques. Posteriorment, es va aplicar un doble enfocament (lineal i unimodal) per a la recerca de models d'interpretació ambiental de les variables biològiques, emprant models lineals basats en la distància, així com l'anàlisi de correspondències canònic. Els resultats obtinguts indiquen que la dinàmica poblacional de protists i metazous es troba influïda en molts casos per ambdós factors, estacional i bioreactor, sent aquest últim el que influïx principalment en la dinàmica dels bacteris filamentosos. En el cas de protists i metazous, s'han proposat nous bioindicadors del procés de nitrificació. D'altra banda, l'exploració exhaustiva de les variables ambientals ha determinat la conveniència de la seua categorització, així com l'estudi de la inèrcia biològica de les variables operacionals, prèvia a la construcció dels models. A més, recomanem que la interpretació ecològica en cada uns dels bioreactors siga prioritària a la seua interpretació conjunta. Els models construïts han aportat informació rellevant sobre les relacions entre protists i metazous i algunes variables de control de planta, permetent la seua interpretació ecològica i l'obtenció de bioindicadors per a la monitorització del procés biològic en fangs actius. Finalment, els resultats obtinguts sobre identificació i quantificació de bacteris filamentosos ens han permés constatar que els resultats de la microscopia convencional no són comparables amb aquells obtinguts a partir de la tècnica FISH excepte en els casos de Microthrix parvicella i Gordonia amarae like-organisms. A més, la construcció de models permet associar els distints bacteris filamentosos a diferents rangs ambientals, obtenint una informació valuosa per al coneixement de la seua dinàmica poblacional. / Zornoza Zornoza, AM. (2017). ESTUDIO DE LA DINÁMICA POBLACIONAL DE PROTISTAS, METAZOOS Y BACTERIAS FILAMENTOSAS Y SU INTERPRETACIÓN ECOLÓGICA EN FANGOS ACTIVOS [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/78839 / TESIS

[ES] Las estaciones depuradoras de aguas (EDAR) tienen un papel fundamental en la protección del medio ambiente, evitan la llegada de nutrientes (nitrógeno y fósforo) y otros contaminantes a los ecosistemas acuáticos. El sistema más utilizado para la eliminación de nitrógeno en las EDAR es el proceso biológico de nitrificación-desnitrificación vía nitrato. El rendimiento de los sistemas biológicos está directamente relacionado con la estructura de la comunidad bacteriana y su metabolismo. En este trabajo se monitorizaron las variaciones temporales de las características fisicoquímicas del afluente, los parámetros operacionales y los rendimientos de eliminación del amonio en 6 reactores biológicos con sistemas de fangos activos. Para la caracterización de comunidades involucradas en el proceso de nitrificación se utilizaron diferentes técnicas de biología molecular: hibridación in situ con sondas marcadas con fluoróforos (FISH), secuenciación de segunda generación Illumina y secuenciación de tercera generación SMRT de PacBio, la cual no había sido utilizada hasta la fecha para el análisis de la microbiota de sistemas convencionales de eliminación de nutrientes. Para valorar la actividad de la biomasa nitrificante y de la biomasa heterótrofa se utilizaron técnicas respirométricas y técnicas para la cuantificación del ATP de última generación. Para analizar el gran volumen de datos generado tras la aplicación de las diferentes técnicas, se utilizaron técnicas estadísticas de análisis multivariante, como los modelos de regresión lineal multivariante basados en la distancia (DISTLM). Estas técnicas estadísticas permitieron valorar la contribución de las variables ambientales a la variabilidad observada en la estructura de las comunidades de bacterias nitrificantes, los rendimientos de eliminación del nitrógeno y su actividad. Las técnicas moleculares empleadas permitieron determinar que Nitrosomonas oligotropha, Nitrospira spp. y Nitrotoga sp. fueron las especies responsable de los procesos de nitrificación en las EDAR analizadas. Los resultados alcanzados con las técnicas FISH e Illumina sobre la estructura de la población de bacterias nitrificantes fueron similares, y permitieron detectar los sesgos de la secuenciación SMRT de PacBio. Los modelos de regresión permitieron valorar la contribución de las bacterias nitrificantes a la eliminación del amonio y cuáles fueron los factores que influían en su abundancia en cada una de las EDAR. La carga orgánica, la concentración de sólidos volátiles, la concentración de oxígeno y la temperatura fueron las variables de mayor influencia en la abundancia de estas especies. Mientras que la carga de fósforo influenció significativamente en su actividad. Este estudio reveló que la aplicación de ozono disminuye significativamente a los rendimientos de eliminación del amonio. Los resultados obtenidos ayudaron a mejorar la comprensión sobre el proceso de nitrificación en cada una de las EDAR y manifiestan la importancia de la dinámica poblacional de las bacterias nitrificantes en los rendimientos de eliminación del amonio en las EDAR. Estos resultados establecen que las técnicas moleculares combinadas con respirometría y los modelos de ordenación multivariante empleados en esta tesis, son una herramienta fiable para la monitorización y el control del proceso de nitrificación en sistemas de eliminación biológica de nitrógeno. Los resultados de esta tesis sugieren que la medida de los sólidos suspendidos volátiles activos mediante técnicas de determinación de ATP de segunda generación puede mejorar el cálculo de las variables de diseño y control más habituales de las EDAR. / [CA] Les estacions depuradores d'aigües residuals (EDAR) tenen un paper fonamental en la protecció del medi ambient, eviten l'arribada de nutrients (nitrogen i fòsfor) i altres substàncies contaminants als ecosistemes aquàtics. El sistema més utilitzat per a l'eliminació de nitrogen en les EDAR és el procés biològic de nitrificació-desnitrificació via nitrat. El rendiment dels sistemes biològics està directament relacionat amb l'estructura de la comunitat bacteriana i el seu metabolisme. En aquest treball es van monitorar les variacions temporals de les característiques fisicoquímiques de l'afluent, els paràmetres operacionals i els rendiments d'eliminació de l'amoni en 6 reactors biològics amb sistemes de fangs actius. Per a caracteritzar les comunitats involucrades en el procés de nitrificació s'han utilitzat diferents tècniques de biologia molecular: hibridació in situ amb sondes marcades amb fluoròfors (FISH), seqüenciació de segona generació Illumina i seqüenciació de tercera generació SMRT de PacBio, la qual no havia estat utilitzada fins avui per a l'anàlisi de la microbiota dels sistemes convencionals d'eliminació de nutrients. Per a valorar l'activitat de la biomassa nitrificant i de la biomassa heteròtrofa es van utilitzar tècniques respiromètriques i tècniques per a la quantificació de l'ATP d'última generació. Per a analitzar el gran volum de dades generat després de l'aplicació de les diferents tècniques, es van utilitzar tècniques estadístiques d'anàlisi multivariant, com els models de regressió lineal multivariant basats en la distància (DISTLM). Aquestes tècniques estadístiques van permetre valorar la contribució de les variables ambientals a la variabilitat observada en l'estructura de les comunitats de bacteris nitrificants, els rendiments d'eliminació del nitrogen i la seua activitat. Les tècniques moleculars emprades van permetre determinar que Nitrosomonas oligotropha, Nitrospira spp. i Nitrotoga sp resultaren les espècies responsables del procés de nitrificació en les EDAR analitzades. Les tècniques FISH i Illumnina van mostrar resultats molt similars sobre l'estructura de la població de bacteris nitrificants i van permetre detectar els biaixos de la seqüenciació SMRT de PacBio. Els models de regressió van permetre valorar la contribució dels bacteris nitrificants a l'eliminació de l'amoni i quins van ser els factors d'influència en la seua abundància en cadascuna de les EDAR. La concentració de matèria orgànica, sòlids volàtils en suspensió, la concentració d 'oxigen i la temperatura foren les variables amb més influència en l'abundància d'aquestes especies. Així mateix la càrrega de fòsfor va influir en la seua activitat. Aquest estudi va determinar que l 'aplicació ozó va causar una disminució significativa dels rendiments d 'eliminació del amoni. Aquests models van ajudar a millorar la comprensió sobre el procés de nitrificació en cadascuna de les EDAR i ressalten la importància de la dinàmica poblacional dels bacteris nitrificants en el rendiments de l 'eliminació de l 'amoni. Els resultats estableixen que les tècniques moleculars combinades amb respirometría i els models d'ordenació multivariant emprats en aquesta tesi, són una eina fiable per al monitoratge i el control del procés de nitrificació en sistemes d'eliminació biològica de nitrogen. Els resultats d'aquesta tesi suggereixen que la mesura dels sòlids suspesos volàtils actius mitjançant tècniques de determinació d'ATP de segona generació pot millorar el càlcul de les variables de disseny i control més habituals de les EDAR. / [EN] Wastewater treatment plants play an important role in environmental protection. These facilities protect aquatic ecosystems from excessive inputs of nutrients (nitrogen and phosphorous) and other pollutants. The most widespread system of nitrogen removal in wastewater treatment plants is a conventional method involving a biological nitrification-denitrification via nitrate. The efficiency of biological systems is directly related to bacterial community structure and its metabolism. In this work, the temporal variations of influent characteristics, operational parameters and ammonium removal efficiency in 6 bioreactors with activated sludge systems were monitored. To characterize the microbial communities involved in the nitrification process different molecular biology techniques were used: fluorescence in situ hybridization (FISH); second generation sequencing (Illumina), and third generation sequencing (SMRT PacBio). To assess the activity of nitrifying and heterotrophic bacteria, respirometric tests and second-generation ATP determination techniques were used. To analyse the large volume of data generated, statistical multivariate analysis techniques were used, including distance-based multivariate linear regression models (DISTLM). These statistical techniques allowed us to assess the contribution of environmental variables to the variability observed in the nitrifying community structure, in nitrogen removal performance and nitrifying activity. The molecular techniques employed determined that Nitrosomonas oligotropha, Nitrospira spp. and Nitrotoga sp. where the dominant nitrifying bacteria in the monitored WWTP. FISH and Illumnina technique showed very similar results and allowed for the detection of biases in PacBio SMRT sequencing. The regression models determined the contribution of nitrifying bacteria to ammonium oxidation and the factors influencing their abundance and activity. The main factors influencing the nitrifying bacteria abundance were organic load, volatile suspended solids concentration, dissolved oxygen and temperature. The activity of nitrifying bacteria also was influenced by phosphorous loading rate. This study revealed that ozone concentration was the main factor determining the low ammonium removal performance. These models helped to improve our understanding of the nitrification process in each WWTP and highlight the importance of nitrifying bacterial community structure in nitrogen removal performance. The results establish that the molecular techniques combined with respirometry and the multivariate ordering models used in this thesis, are a reliable tool for the monitoring and control of the nitrification process. The results of this thesis suggest that the measurement of active volatile suspended solids by means of second- generation ATP determination techniques can improve calculation of the most common design and control parameters of WWTPs. / A la Entidad de Saneamiento y Depuración de la Región de Murcia (ESAMUR) por la financiación del proyecto “Influencia de las variables operacionales y fisicoquímicas en la dinámica y estructura de la población de bacterias nitrificantes”, al Grupo de Química y Microbiología del Agua del IIAMA. A la Entidad Pública de Saneamiento de Aguas Residuales de la Comunidad Valenciana (EPSAR), por la financiación del proyecto “Estudio integrado del proceso biológico en plantas de tratamiento por fangos activos, análisis de interrelación entre los distintos componentes y optimización de métodos moleculares para la identificación de bacterias formadoras de espumas” al Grupo de Química y Microbiología del Agua del IIAMA / Barbarroja Ortiz, P. (2019). Estudio de la dinámica poblacional y actividad de los organismos nitrificantes en sistemas de depuración de aguas residuales [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/124063 / TESIS