Orientador: Wilma de Grava Kempinas / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T11:02:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Arena_ArielleCristina_D.pdf: 6263469 bytes, checksum: 65be2ee6efd96baa2f00b966ad068e99 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O fenvalerato é um inseticida piretróide sintético amplamente utilizado na agricultura para o controle de pragas. Embora seja considerado de baixa toxicidade para os mamíferos, trabalhos têm demonstrado que certos piretróides podem apresentar atividade estrogênica e atuar como desreguladores endócrinos, acarretando disfunções reprodutivas importantes no sexo masculino. Está documentado na literatura que a exposição de ratas prenhes ao fenvalerato reduziu os níveis plasmáticos de testosterona e os pesos da vesícula seminal e do ducto deferente dos filhotes machos na idade adulta, além de alterações no comportamento sexual desses animais. Também foi observado que ratos adultos expostos à formulação de fenvalerato, por inalação, exibiram uma redução significativa no peso dos testículos e na contagem espermática no epidídimo. Até o momento pouco se sabe sobre os mecanismos pelos quais o fenvalerato exerce sua ação na reprodução, assim, o objetivo do presente trabalho foi investigar a atividade estrogênica e os efeitos do inseticida piretróide fenvalerato sobre o sistema reprodutor masculino e fertilidade de ratos machos adultos. Para tanto, ratos machos adultos (90 dias de idade) receberam durante 30 dias consecutivos, por gavage (via oral), 40 mg/kg/dia de fenvalerato (grau técnico; 96,8% de pureza). O grupo controle recebeu apenas o veículo (óleo de milho), segundo o mesmo protocolo experimental. No final do tratamento, foram avaliados os seguintes parâmetros: peso corporal; peso absoluto de órgãos da reprodução, fígado e rins; níveis plasmáticos de testosterona; contagem de células germinativas no testículo e no epidídimo; morfologia espermática; estudo da fertilidade através de cruzamentos naturais e inseminação artificial in utero; contagem de espermatozóides ejaculados no útero; avaliação do comportamento sexual; análises do testículo e epidídimo em nível de microscopia óptica e eletrônica e avaliação da possível atividade estrogênica de diferentes doses do fenvalerato (0,4; 1,0; 4,0; 8,0 e 40 mg/kg) através do teste uterotrófico. A quantificação de resíduos de fenvalerato por Cromatografia Líquida de Alta Precisão (HPLC) em órgãos reprodutores e vitais e análises de proteínas espermáticas e epididimárias também foram realizadas. Os resultados foram comparados pelos testes ¿t¿ de Student e Mann-Whitney, dependendo da natureza da distribuição dos dados, enquanto os resultados do teste uterotrófico comparados pela ANOVA seguida pelo teste de Tukey. Os resultados da quantificação de fenvalerato revelaram que o piretróide foi retido em órgãos reprodutores (testículo e epidídimo) e vitais (cérebro e fígado). O tratamento com fenvalerato reduziu os pesos absolutos do testículo e do epidídimo. Além disso, o tratamento não provocou diminuição nos níveis plasmáticos de testosterona. Verificou-se também que os ratos tratados apresentaram redução na produção espermática no testículo e no número de espermatozóides no epidídimo. No entanto, não foi observado comprometimento na fertilidade desses machos quando acasalados com fêmeas controles. As análises morfológicas do testículo e epidídimo assim como as análises de proteínas espermáticas e epididimárias não mostraram alterações. Além disso, o fenvalerato, nas doses testadas, não apresentou atividade estrogênica in vivo. Concluiu-se que o fenvalerato, nestas condições experimentais, foi retido em órgãos reprodutores e vitais. O fenvalerato foi espermatotóxico, visto que reduziu tanto a produção quanto as reservas espermáticas dos animais tratados. No entanto, apesar dessa alteração, a fertilidade dos animais tratados não foi comprometida, uma vez que o rato tem uma grande eficiência reprodutiva, diferentemente do que acontece com o ser humano / Abstract: Fenvalerate is a synthetic pyrethroid insecticide widely used in agriculture to control a variety of insects. Although it is considered to be of low acute toxicity to mammals, studies have showed that pyrethroids can have estrogenic activity and can act as endocrine disruptors, causing important reproductive impairment in males. It is documented in the literature that the exposure of pregnant rats to fenvalerate decreased plasma testosterone levels and weights of seminal vesicle and vas deferens in male pups during adult life, besides alterations in their sexual behavior. It was also observed that adult rats exposed to formulated fenvalerate,by inhalation, exhibited a significant reduction in the testis weight and epididymal sperm count. Little is known about the mechanisms by which fenvalerate exerts its action on reproduction; thus, the objective of the present study was to investigate the estrogenic activity and the effects of fenvalerate on the reproductive system and fertility of adult male rats. For this, adult male rats (aged 90 days) received, for 30 consecutive days, by oral gavage, 40 mg/kg/day of fenvalerate (technical grade; 96.8% purity). The control group received only the vehicle (corn oil), in the same experimental conditions. At the end of the treatment, the following parameters were analyzed: body weight; absolute weight of reproductive organs, liver and kidneys; plasma testosterone levels; germ cell count in the testis and epididymis; sperm morphology; fertility tests by natural matings and artificial insemination in utero; ejaculated sperm counts in uterus; sexual behavior; analysis of testis and epididymis at the optical and electron microscopic levels, and evaluation of possible estrogenic activity of different doses (0.4; 1.0; 4.0; 8.0 and 40 mg/kg) of fenvalerate by the uterotrophic test. Fenvalerate residues were quantified using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) in reproductive and vital organs; sperm and epididymal protein were also realized. The results were compared by Student-t and Mann-Whitney tests, according to the characteristics of each variable, while the results of the uterotrophic test were compared by ANOVA followed by the Tukey test. The results of fenvalerate quantification revealed that the pyrethroid was retained in reproductive (testis and epididymis) and vital organs (brain and liver). The treatment with fenvalerate decreased the absolute weights of testis and epididymis. Furthermore, the treatment did not provoke reduction of plasma testosterone levels. It was also verified that the treated rats presented a reduction in daily sperm production and in epididymal sperm number. The fertility tests did not reveal differences related to the treatment. The results of the fenvalerate quantification revealed high concentrations of insecticide residues in the epididymis, testis, brain and liver. The histopathology of the testis and epididymis as well as analysis of sperm and epididymal proteins did not show alterations. Moreover, fenvalerate, at the tested doses, did not present estrogenic activity in vivo. It was concluded that fenvalerate, in these experimental conditions, was retained in reproductive organs and was spermatotoxic, since it reduced sperm production and storage, but this alteration was not sufficient to compromise fertility by virtue of the high reproductive efficiency of rodents in contrast with humans / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Helicoverpa armigera (Hübner) was officially reported in Brazil in 2013 causing serious damage to several crops, especially soybean and cotton crops. Because of this severe damage and also because H. armigera is more tolerant to insecticides in compare to other lepidopteran pests in Brazil, there was a significant increase of selection pressure with insecticides in the field. Many cases of insecticide resistance, especially to pyrethroids, have been reported in some countries of the Old World. The main objective of the present study was to characterize the susceptibility of H. armigera and to investigate the mechanisms of its resistance to pyrethroids and indoxacarb in Brazilian populations. Mortality of H. armigera populations was less than 50% when treated with the highest dose of 10 μg a.i./3rd-instar larva of fenvalerate and deltamethrin. Field populations of H. armigera monitored from 2013 to 2016 growing seasons showed mean mortalities of 10 to 40% at the diagnostic dose of 10 μg a.i./3rd-instar larva. The resistance ratio to pyrethroid was 780-fold. The frequency of the chimeric P450 CYP337B3 gene was above 0.95 in all 33 populations screened. The genetic basis of H. armigera resistance to pyrethroids was also investigated. The dominance degree varied from 0.66 to 0.92, i.e., incompletely to completely dominant, and resistance was characterized as autosomal and polygenic. Possible mutations in the sodium channel were investigated, as well as the expression of other P450 genes via RT-qPCR. Two non-synonymous mutations, V937G and Q960H were found, and the genes CYP6AB10, CYP301A, CYP4S13 and CYP321A5 were up-regulated in the Brazilian pyrethroid-resistant strain compared to the susceptible strain. The susceptibility of H. armigera populations to indoxacarb was characterized with a diet overlay bioassay in 3rd-instar larvae. LC50 values ranged from 0.22 (0.16-0.28) μg a.i./cm2 to 0.57 (0.41-0.82) μg a.i./cm2, varying 2.6-fold. The populations were monitored through the 2013-2017 growing seasons, with the diagnostic dose of 6.1 μg a.i./cm2; during the period, the susceptibility to indoxacarb decreased. An indoxacarb-resistant strain was selected under laboratory conditions and showed a resistance ratio of 297.5-fold. These results will contribute to decision-making and implementation of insect resistance-management (IRM) programs in Brazil and other recently invaded countries in Brazil. / Helicoverpa armigera (Hübner) foi reportada oficialmente no Brasil em 2013, ano em que causou grandes perdas em lavouras de soja e algodão no país. Devido ao ataque severo de H. armigera e por ser mais tolerante do que as demais pragas que ocorriam no Brasil, houve um aumento significativo da pressão de seleção com inseticidas no campo. Inúmeros casos de resistência desta praga a inseticidas do grupo dos piretroides já havia sido reportado em alguns países do Velho Mundo. Dentro desse contexto o objetivo desse trabalho foi caracterizar a suscetibilidade e investigar possíveis mecanismos de resistência a piretroides bem como indoxacarb no Brasil. A mortalidade das populações de H. armigera foi menor do que 50 % quando tratadas com a dose máxima de 10 μg i.a./lagarta de 3º instar para fenvalerato e deltametrina. As populações de campo de H. armigera monitoradas entre os anos de 2013 a 2016 na dose diagnóstica de 10 μg i.a./lagarta de 3º instar apresentaram mortalidade de 10 a 40%. A frequência do gene P450 CYP337B3 foi maior do que 0,95 em 33 populações testada. Além disso, as bases genéticas da resistência de H. armigera a piretroides foram investigadas e a razão de resistência com a linhagem suscetível foi de 780 vezes. O grau de dominância variou de 0,66 a 0,92, incompletamente e completamente dominante e a resistência foi caracterizada como autossômica e poligênica. Adicionalmente investigou-se a presença de possíveis mutações no canal de sódio bem como a expressão de outros genes P450 em uma linhagem resistente a piretroides. Foi possível detectar duas mutações não-sinonímias V937G, e Q960H no canal de sódio e os genes CYP6AB10, CYP301A, CYP4S13 e CYP321A5 foram super expressos na linhagem resistente. A suscetibilidade de populações de H. armigera para o inseticida indoxacarb foi caracterizada a partir de bioensaios de ingestão com lagartas de 3° instar. Os valores de CL50 variaram de 0,22 (0,16 - 0,28) μg i.a./cm2 até 0,57 (0,41 - 0,82) μg i.a./cm2 variando em 2,6 vezes. As populações foram monitoradas ao longo das safras agrícolas entre 2013 e 2017 com a concentração diagnóstica de 6,1 μg i.a./cm2 e observou-se uma diminuição na suscetibilidade da praga a indoxacarb. Uma linhagem resistente a indoxacarb foi selecionada em laboratório e comparada com uma linhagem suscetível de referência, apresentando uma razão de resistência de 297,5 vezes. Os resultados obtidos são extremamente importantes e poderão contribuir na tomada de decisões bem como na implementação de programas de manejo da resistência de insetos (MRI) no Brasil.