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Desenvolvimento, mecanismo e reversão da resistência ao Temephos na linhagem Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Recife-resistente (RecR)

Cibele de Souza Gomes, Tatiane 31 January 2009 (has links)
Made available in DSpace on 2014-06-12T15:07:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3039_1.pdf: 2500078 bytes, checksum: b93d1edbb699a82170ab820d9edc8267 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Brasil, desde 1996, levou ao aparecimento de populações de mosquitos resistentes a esse composto. Apesar disso, o produto continua sendo usado pelo governo, exceto nos locais de detecção da resistência, onde foi substituído por larvicidas biológicos. O conhecimento sobre a forma de desenvolvimento e reversão da resistência em campo, bem como os mecanismos que modulam sua manifestação, pouco avançou nos últimos anos, apesar destas informações serem necessárias para a elaboração de esquemas seguros de manejo da resistência. Este trabalho se propôs a avaliar, utilizando uma linhagem de A. aegypti resistente ao temephos, os mecanismos responsáveis, ao menos em parte, por esta resistência, a possibilidade de respostas cruzadas com outros inseticidas e a reversão à susceptibilidade a este composto, em diferentes situações que simulam a realidade em campo. Assim, diferentes gerações da linhagem de A. aegypti, Recife-Resistente, RecR (14ª e 17ª gerações) mantidas sob forte pressão de seleção ao temephos, foram utilizadas. Como controle, utilizou-se uma linhagem padrão de susceptibilidade, a Rockefeller. Ensaios in vivo com concentrações múltiplas do temephos foram realizados para calcular a CL50 e CL90 e definir a razão de resistência (RR) nas diferentes gerações da RecR. A susceptibilidade da RecR a outros inseticidas, como o regulador de crescimento pyriproxyfen e os adulticidas malathion (organofosforado), deltametrina e cipermetrina (piretróides) foi verificada através de bioensaios dose-resposta (DR) e dosediagnóstica (DD). Para estudos preliminares dos mecanismos que conferem resistência, a atividade de enzimas associadas à detoxificação de inseticidas, como a glutationa S-transferase (GST s), esterases (EST s) α e β e oxidases de função mista (MFO s), também foi analisada na RecR. Para o estudo da reversão da resistência foram estabelecidas três sublinhagens. Duas delas foram provenientes da 14ª geração da RecR (RecRF14), sendo que uma foi mantida sem exposição ao temephos (RecRev1) e a outra sem exposição e com introdução de 30% de indivíduos com baixa resistência (RecRev2). A terceira sublinhagem, proveniente da 17ª geração da RecR (RecRF17), além de não ter sido exposta contou com a introdução de 50% de indivíduos susceptíveis-Rockefeller (RecRev3), a cada nova geração. Os resultados demonstraram que a RecR, apesar de altamente resistente ao temephos, apresentou resposta alterada ao pyriproxyfen e à cipermetrina e susceptibilidade à deltametrina e ao malathion, o que revela a inexistência de resistência cruzada aos dois últimos compostos. Todas as enzimas, em especial as GST s, mostraram atividade alterada nas fases adulta e larvária da RecRF17, exceto as MFO s, portanto é possível sugerir o envolvimento do mecanismo metabólico na resistência ao temephos. Quanto à reversão da resistência, observou-se que cessada a pressão de exposição ao temephos, após nove gerações consecutivas, houve uma redução na RR90 de 14 vezes (8,7) e 42 vezes (3,0) para RecRev1 e RecRev2, respectivamente. A RecRev3 recuperou a susceptibilidade ao composto na F3. Estes resultados demonstraram uma queda drástica na RR nas três condições avaliadas, mas revelam que a resistência ao composto não regride rapidamente diante da simples interrupção de seu uso, como observado na RecRev1, que permaneceu com nível intermediário de resistência (RR= 8,7). Por outro lado, os esquemas que tentaram simular condições de campo relativas à migração de indivíduos susceptíveis ou com baixa resistência mostraram-se mais eficientes na recuperação da susceptibilidade, revelando o caráter instável desta resistência. É possível sugerir, por fim, que a resistência ao composto é reversível e que métodos baseados na liberação de machos susceptíveis possam representar mais uma forma de manejar a resistência ao temephos em campo
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Dinâmica da resistência a inseticidas de populações de Aedes aegypt (Linnaeus, 1762) de quatro regiões do Brasil

Garcia, Gabriela de Azambuja January 2012 (has links)
Made available in DSpace on 2015-10-21T12:19:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 gabriela_garcia_ioc_mest_2012.pdf: 5953983 bytes, checksum: 9330fc410b9489226898cb3a6791b904 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-05-21 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A utilização de inseticidas neurotóxicos contra insetos vetores ainda tem um papel crucial nos programas de controle de doenças. No Brasil é uma estratégia importante no controle do vetor da dengue, o Aedes aegypti. O principal larvicida utilizado para este fim em ca mpo tem sido o organofosforado (OP) temephos, desde 1967, com utilização intensificada a partir da epidemia de 1986. Em função do diagnóstico de resistência em diversas populações brasileiras a este OP, atualmente se encontra em andamento a substituição pelo inibidor de síntese de quitina (ISQ) diflubenzuron. Para o controle da fase adulta dos mosquitos, os inseticidas mais utilizados atualmente pertencem à classe dos piretróides (PI). Contamos no país com a Rede Nacional de Monitoramento da Resistência de Aedes aegypti a Inseticidas (MoReNAa), com metodologias consolidadas para a avaliação da resistência e de seus mecanismos em populações do vetor de dengue. No presente estudo, essas metodologias foram empregadas para avaliar ao longo de um ano, em quatro localidades do Brasil, de quatro regiões distintas, a resistência aos inseticidas citados anteriormente. Identificamos alterações de susceptibilidade ao larvicida temephos em todas as populações participantes do estudo; entretanto, observamos, em todos os casos, tendência de queda da razão de resistência ao longo do estudo, que atribuímos à interrupção do uso deste composto em campo Em relação ao outro larvicida investigado, o diflubenzuron, foram constatadas razões de resistência baixas para todas as populações, em todos os momentos, provavelmente em função da sua recente incorporação no âmbito do controle químico no país. Ressaltamos no entanto a importância de avaliações deste ISQ mediante simulados de campo para uma melhor compreensão sobre o significado funcional das razões de resistência encontradas neste estudo, e seu impacto no controle efetuado em campo no país. Já para o adulticida investigado, a deltametrina (PI), observamos uma resistência disseminada no país, sendo extremamente elevada em três das quatro populações estudadas. Os resultados indicam uso público indiscriminado de inseticidas em uma das localidades e sugerem correlação entre a resistência a PI e a utilização doméstica deste inseticida, o que chama atenção para a necessidade de adoção de medidas de conscientização do uso deste tipo de ferramenta pela sociedade. Após a quantificação da resistência a estes três inseticidas, partimos para a investigação dos mecanismos responsáveis, analisando a resistência metabólica \2013 derivada de alterações nas atividades de enzimas que detoxificam estes compostos \2013 por meio de ensaios bioquímicos e a resistência por alteração no sítio alvo \2013 derivada de modificações estruturais nas moléculas alvo dos inseticidas - por meio de ensaios bioquímicos e moleculares Foram diagnosticadas principalmente alterações na atividade de duas enzimas na fase adulta das quatro populações, GST e PNPA. Estas enzimas já haviam sido relacionadas à resistência a PI anteriormente. Na fase de larvas, não foi possível estabelecer qualquer correlação diagnóstica com a resistência a temephos ou diflubenzuron: alterações na atividade das enzimas variaram entre as populações estudadas. De maneira geral, verificamos tendência de queda na atividade de PNPA em Duque de Caxias, de MFO em Parnamirim e das Esterases ALFA e BETA em Campo Grande . Em relação aos ensaios moleculares, diagnosticamos três diferentes mutações no canal de sódio das populações avaliadas (nas posições 1011, 1016, 1534). Destas, duas mutações (1016 e 1534) foram correlacionadas com a elevada resistência a PIs neste estudo. Este trabalho possibilitou uma melhor compreensão sobre a dinâmica da resistência a inseticidas no país. Esperamos, desta forma, contribuir para o manejo do controle químico de Ae. aegypti, auxiliando a recomendação de inseticidas, tanto para larvas quanto para adultos, de uma forma eficiente e racional / The utilization of neurotoxic insecticides against insect vectors has a crucial role in disease control programs. In Bra zil it is an important strategy against the dengue vector, Aedes aegypti . Since 1967 the main larvicide used in the field has been the organophosphate (OP) temephos, with a strong utilization after the dengue epidemy in 1986. Due to OP resistance of seve ral Brazilian vector populations, nowadays it’s substitution by the chitin synthesis inhibitor (CSI) diflubenzuron is in progress. Pyrethroids (PI) are the most widely used insecticides in the control of adult mosquitoes. In Brazil the National Network f or Aedes aegypti Insecticide Resistance Monitoring (MoReNAa) relies on consolidated methodologies for assessing resistance and the underlying its mechanisms in populations of the dengue vector. In the present study, we employed these methodologies to eval uate resistance to the above mentioned insecticides of four municipalities, belonging to four Brazilian regions , during one year. We identified changes in the susceptibility levels to the larvicide temephos in all populations considered in the study. How ever , there was a tendency of temephos resistance ratio decrease throughout the period of evaluation, probably due to the interruption of the use of this compound in the field. Diflubenzuron, the other larvicide investigated, elicited low resistance ratio s in all populations considered, and this was attributed to its recent incorporation as a chemical control tool in the country. However, we emphasize the importance of field simulated assays with this CSI in order to better understand the significance of the resistance values found and their impact on vector control. For the adulticide investigated, deltamethrin (PI), we observed widespread resistance all over the country . Resistance levels were particularly high in three out of the four investigated pop ulations. Our results point to an indiscriminate public use of PI in one municipality and suggest correlation between PI resistance and the intense domestic use of this class of insecticides. This calls attention to the need of adopting measures to raise society awareness to the limitations of this kind of tools. After resistance quantification to these three insecticides, we investigated the mechanisms potentially involved by analyzing both metabolic resistance - derived from changes in the activity of detoxifying enzymes - and resistance by altered target site - derived from structural modifications in the insecticide target molecules. Biochemical and molecular assays were employed. GST and PNPA were the main enzymes altered, and this was observed in adult specimens of all populations. These enzymes have been previously associated with PI resistance. In the larval stage, no diagnostic correlation between enzymes activity and temephos or diflubenzuron resistance could be established , enzymatic alterat ions varying among the evaluated populations . In general, we detected tendency of decrease in the PNPA activity at Duque de Caixas, MFO at Parnamirin and ALFA and BETA Esterases at Campo Grande. Regarding the molecular assays, it was possible to identify three different mutations in the sodium channel, the PI target site (at positions 1011, 1016 and 1534). Of these, two mutations (1016 and 1534) were correlated to high resistance levels to PIs. This study contributed to a better understanding of the dyn amics of insecticide resistance in Brazil. We expect to have been contributed to the management of Ae. aegypti chemical control, support ing the recommendation of efficient and rational usage of insecticides for both larvae and adults
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Resistência de Sitophilus zeamais (Coleoptera: Curculionidae) a inseticidas: detecção e mecanismos / Resistance of Sitophilus zeamais (Coleoptera: Curculionidae) to insecticides: detection and mechanisms

Ribeiro, Berghem Morais 23 February 2001 (has links)
Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-07-06T13:14:32Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 281782 bytes, checksum: 55a6b921ddc9e16a34e099872f6b9ef1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-06T13:14:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 281782 bytes, checksum: 55a6b921ddc9e16a34e099872f6b9ef1 (MD5) Previous issue date: 2001-02-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Este estudo foi conduzido com o objetivo de detectar a resistência a seis inseticidas e os prováveis mecanismos bioquímicos de resistência em populações de Sitophilus zeamais, oriundas de seis estados brasileiros. Os bioensaios foram feitos em frascos de 20 ml que foram impregnados por toda a sua área interna, com inseticida ou sinergista. Os bioensaios de detecção de resistência foram feitos utlizando as concentrações letais para 95% dos indivíduos, CL 95 , para a população padrão de susceptibilidade de cada inseticida, obtidas através de análise de próbite. Os resultados destes testes mostraram seis populações resistentes. A população de Cristalina-GO apresentou resistência apenas a cipermetrina, o mesmo acontecendo com a população de Nova Andradina-MS. Já a populaç ão de Jacarezinho-PR se mostrou resistente a todos os inseticidas piretróides testados: deltametrina, cipermetrina e permetrina. A população de Penápolis/Barbosa-SP apresentou resistência à cipermetrina, ao clorpirifós metílico e ao pirimifós metílico. Na população de Fátima do Sul-MS foi detectada resistência apenas para clorpirifós metílico. A população de São José do Rio Preto-SP se mostrou resistente a cipermetrina e pirimifós metílico. Para os bioensaios com os sinergistas trifenil fosfato (TPP), butóxido de piperonila (PBO) e dietil maleato (DEM), foram aplicadas nas populações resistentes as CL 95 para a população padrão de susceptibilidade dos inseticidas combinados com os sinergistas. Os resultados destes bioensaios mostraram que os compostos TPP e DEM bloquearam a resistência a cipermetrina nas populações de Cristalina-GO, Nova Andradina-MS, Penápolis/Barbosa-MS e São José do Rio Preto-SP. Estes compostos e o PBO também ocasionaram a perda da resistência a clorpirifós metílico nas populações de Fátima do Sul-MS e Penápolis/Barbosa- SP. Os resultados dos bioensaios com PBO também mostraram que este composto provocou um aumento na resistência a cipermetrina nas populações de Cristalina-GO e Nova Andradina-MS; o mesmo efeito foi constatado para o inseticida pirimifós metílico nas populações de Penápolis/Barbosa e São José do Rio Preto. Este estudo mostrou evidências de que os mecanismos bioquímicos de resistência baseados nas glutationa-S-transferase, inibidas pelo DEM, e esterases, inibidas pelo TPP, atuaram de forma mais frequente do que as monoxigenases dependentes do citocromo P-450, cuja ação é suprimida pelo PBO. Além do envolvimento destas enzimas na resistência de S. zeamais a inseticidas, é provável a ocorrência de insensibilidade ao sítio de ação na resistência da população de Jacarezinho-PR a piretróides. / This study was carried out with the objective of detecting the resistance to six insecticides and the possible biochemical mechanisms of resistance in populations of Sitophilus zeamais , from six Brazilian states. The bioassay was carried out in 20 mL vials which were impregnated with insecticide or sinergist on their inner walls. The bioassay of resistance detection was carried out using the LC 95 for the susceptible standard population and each insecticide. The results of these tests showed six resistant populations. The Cristalina-GO population just showed resistance to the cypermethrin, like the population from Nova Andradina-MS. The Jacarezinho population showed resistance to all of the tested pyrethroids: deltamethrin, cypermethrin and permethrin. The population from Penápolis/Barbosa-SP showed resistance to cypermethrin, chlorpirifos methyl and pirimiphos methyl. For the population of Fátima do Sul- MS, only resistance to chlorpyrifos methyl was detected. The São José do Rio Preto-SP population showed resistance to cypermethrin and pirimiphos methyl. Bioassays with the sinergists triphenyl phosphate (TPP), piperonyl butoxide (PBO) and diethyl maleate (DEM) were carried out using the LC 95 of the standard susceptible population for the insecticides combined with the sinergists. The results of these bioassays showed that TPP and DEM are able to suppress cypermetrin resistance in the population of Cristalina-GO, Nova Andradina-MS, Penápolis/Barbosa-MS and São José do Rio Preto-SP. All three sinergists provided suppression of the resistance to chlorpyrifos methyl resistance in the population of Fátima do Sul-MS and Penápolis/Barbosa-SP. The results of the bioassays with PBO also showed that this synergist antagonizes the insecticide action increasing its resistance to cypermetrin in the populations of Cristalina-GO and Nova Andradina-MS. The same effect was observed for the insecticide pirimiphos methyl in the population from Penápolis/Barbosa-SP and São José do Rio Preto -SP. This study provided preliminary evidence of a major involvement of biochemical mechanisms of resistance based on enhanced detoxification activity of the glutathione-S- transferases enzyme group inhibited by DEM, and of the esterases, enzyme group inhibited by TPP, with a minor involvement of the cytochrome P-450 dependent monoxigenases, whose action is suppressed by PBO. Besides the likely involvement of these enzymes in S. zeamais resistance, there also seems to occur site of action insensibility leading to pyrethroid resistance in the population from Jacarezinho-PR. / Dissertação importada do Alexandria
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Método para fenotipagem de raiz e mapeamento associativo para tolerância à deficiência hídrica em arroz / Method for root phenotyping and associative mapping to drought tolerance in rice

Guimarães, Paulo Henrique Ramos 27 March 2017 (has links)
Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2017-06-08T18:55:23Z No. of bitstreams: 2 Tese - Paulo Henrique Ramos Guimarães - 2017.pdf: 4205018 bytes, checksum: 87a9e54e29ba3388626b1fcbf1564e5a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-06-09T11:15:28Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Paulo Henrique Ramos Guimarães - 2017.pdf: 4205018 bytes, checksum: 87a9e54e29ba3388626b1fcbf1564e5a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-09T11:15:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Paulo Henrique Ramos Guimarães - 2017.pdf: 4205018 bytes, checksum: 87a9e54e29ba3388626b1fcbf1564e5a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-03-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Climate change and its influence on agriculture have been a recurring theme at world leaders' meetings. Expected climate change to be accompanied by increases in temperature, periods of water restriction and changes in the biological cycle of pests and diseases. Perhaps there will be changes in agricultural geography, regions suitable for growing of the crops may become unfit. The rice (Oryza sativa L.) which is considered to be an important food source, but is sensitive to water restriction conditions, may be drastically affected by such changes. In this way, the aims of this study were: (i) evaluated the root system of the accessions of the upland rice; (ii) identify SNPs markers and associate then with the morphologic traits to early vigour in rice under water restriction. We evaluated a panel of rice diversity. In the first trial we evaluated 217 accessions on a phenotyping platform (Integrated System for Induced Drought Treatment - SITIS). This trial was conducted in 2014, under well water conditions, we evaluated the tiller number and different characteristics of root system (root length, root volume and Indices derived from the root length system) in two layers (0-20 cm and 20-40 cm). These traits were evaluated through non-invasive root scanner images. We observed that there was variability to root length and root volume besides there was accessions with well root system distribution in the two layers evaluated. Using the variables:𝐿𝑇1𝑃1 , α𝐿1, Δ𝐿𝑃1, Δ𝐿𝑃2, 𝐿𝑇1𝑃2 _𝑅𝐺 and NBT was possible to discriminate the accessions as well recover and describe the root system architecture. The second trial was conducted with a subset with 140 accessions (selected in previous years). This trial was conducted in the 2015 and 2016 in field conditions under two water conditions (well water and water restriction). The traits evaluated were: leaf number (NBL), tiller number (NBT), plant height (PH), length of blade (LLL), blade width (LLW) and shoot dry weight (SDW). These evaluations were done 30 and 45 days after sowing (DAS). At 30 DAS the plants were submitted to water restriction for 15 days. There was significant differences for the all traits evaluated. There was significant reduction in shoot dry weight (43%), plant height and blade width (18%). The traits evaluated were related to each other, the most of correlations there were low, however positive and significant. We identified 64 significant markers (p-value<0.05), however these markers were associated only the PH at 30 DAS and 45 DAS. The markers detected showed small effect explaining between 15 and 30% of the total phenotypic variation. Thus is connotative that the early vigour in rice is controlled by many genes of small effect. The locus identified as associated may improve understanding of the mechanisms underlying water deficit tolerance in rice. These can be used for marker assisted breeding. / As mudanças climáticas e a sua influência na agricultura têm sido assunto recorrente nas reuniões de lideranças mundiais. Espera-se que essas sejam acompanhadas por aumento na temperatura, períodos de deficiência hídrica e mudanças no ciclo biológico de pragas e doenças. Esperam-se grandes mudanças na geografia agrícola, pois regiões aptas ao cultivo de determinadas culturas poderão se tornar inaptas. O arroz (Oryza sativa L.) que é tido como importante fonte alimentar e sensível às condições de restrição hídrica pode ser drasticamente afetada por tais mudanças. Os objetivos deste trabalho foram: (i) avaliar o sistema radicular de acessos de arroz de terras altas; (ii) identificar SNPs e associá-los com características morfológicas ligadas ao vigor vegetativo em arroz sob condições de restrição hídrica. Foi utilizado um painel de diversidade de arroz, os acessos desse painel foram avaliados em dois ensaios (casa de vegetação e a campo). No primeiro ensaio foram avaliados 217 acessos em casa de vegetação, em uma plataforma de fenotipagem (Sistema Integrado para Tratamento Induzido de Seca - SITIS). Este ensaio foi conduzido no ano de 2014 sob condições ideais de irrigação e foram avaliados o número de perfilhos e diferentes caracteres do sistema radicular (comprimento e volume de raízes, porcentagem de raízes grossas e índices derivados do comprimento do sistema radicular), em duas camadas (0 a 20 cm e 20 a 40 cm). Estes caracteres foram avaliados por meio de imagens geradas por um scanner de raízes. Observou-se variabilidade para o comprimento e volume do sistema radicular, além da existência de acessos com sistema radicular bem distribuído nas duas camadas avaliadas. Utilizando as variáveis 𝐿𝑇1𝑃1 , α𝐿1, Δ𝐿𝑃1, Δ𝐿𝑃2, 𝐿𝑇1𝑃2 _𝑅𝐺 e NBT foi possível distinguir os acessos bem como recuperar e descrever a arquitetura do sistema radicular. O segundo ensaio foi conduzido utilizando-se um subgrupo composto por 140 acessos (selecionados a partir dos 217 avaliados em anos anteriores). Este ensaio foi conduzido nos anos de 2015 e 2016 a campo sob duas condições hídricas (com e sem restrição hídrica). Os caracteres avaliados foram: número de folhas (NBL), número de perfilhos (NBT), altura de plantas (PH), comprimento da folha (LLL), largura da folha (LLW) e matéria seca (SDW). As avaliações foram realizadas aos 30 e 45 dias após a semeadura (DAS). Aos 30 DAS as plantas foram submetidas ao déficit hídrico durante 15 dias. Por meio da análise de variância observaram-se diferenças significativas para todos os caracteres avaliados. Os acessos apresentaram redução significativa na matéria seca (43%), altura de plantas e largura de folhas (18%) sob restrição hídrica. Os caracteres avaliados foram relacionados entre si, a maioria das correlações foram positivas e significativas. Foram identificados 64 marcadores significativos (p-valor < 0,05), no entanto, estes foram associados somente à PH aos 30 DAS e 45 DAS sob estresse hídrico. Os marcadores detectados foram de pequenos efeitos, pois explicaram entre 15 e 30% da variação fenotípica total. Os locus identificados como associados podem melhorar a compreensão sobre os mecanismos subjacentes à tolerância à deficiência hídrica em arroz. Estes poderão ser utilizados pelo melhoramento assistido por marcadores moleculares.
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Bases genéticas e moleculares da resistência de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) a lufenuron / Genetic and molecular basis of Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) resistance to lufenuron

Antonio Rogério Bezerra do Nascimento 23 January 2014 (has links)
As bases genéticas e moleculares da resistência de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) a lufenuron foram exploradas no presente estudo. Inicialmente, uma linhagem de S. frugiperda resistente a lufenuron foi selecionada a partir de uma população coletada na cultura do milho na região de Montevidiu-GO com intenso uso desse inseticida. As curvas de concentração-resposta a lufenuron para as linhagens de S. frugiperda suscetível (SUS) e resistente (LUF-R) a lufenuron foram caracterizadas pelo método de bioensaio com tratamento superficial da dieta artificial. As CL50 (I.C. 95%) estimadas para as linhagens SUS e LUF-R foram de 0,23 (0,18 - 0,28) e 210,6 (175,90 - 258,10) ?g de lufenuron.mL-1 respectivamente, com razão de resistência de ? 915 vezes. A partir dos resultados de cruzamentos recíprocos entre as linhagens SUS e LUF-R, concluiu-se que a herança da resistência de S. frugiperda a lufenuron é autossômica e incompletamente recessiva. Os testes de retrocruzamentos da progênie F1 de cruzamentos recíprocos com o parental LUF-R demonstraram um efeito poligênico para a resistência, com a estimativa do número mínimo de segregações independentes entre 1,54 e 1,71, indicando que o número de loci associado à resistência é baixo. Para conhecer o perfil de transcritos de lagartas de S. frugiperda e avaliar o padrão de expressão gênica diferencial entre lagartas da linhagem LUF-R em comparação ao de lagartas da linhagem SUS, buscando identificar o(s) mecanismo(s) de resistência a lufenuron, foram utilizadas novas tecnologias de sequenciamento em larga escala. Para isso, foram utilizados sequenciamentos de quatro bibliotecas de cDNA (plataforma HiScan 1000, Illumina©) obtidas de lagartas de 4º ínstar de S. frugiperda das linhagens LUF-R e SUS, induzidas ou não com lufenuron. O transcritoma foi construído utilizando aproximadamente 19,6 milhões de leituras single-end, o que gerou 18.506 transcritos, com N50 de 996 pb. A pesquisa contra o banco de dados nr (NCBI) proporcionou anotação funcional de 51,1% (9.457) dos transcritos obtidos, grande parte dos alinhamentos apresentaram homologia a insetos, com o maior número deles (45%) se assemelhando aos de Bombyx mori (Lepidoptera: Bombycidae), enquanto 10% se assemelharam a sequências de diversas espécies do gênero Spodoptera (Lepidoptera: Noctuidae), sendo 3% dos alinhamentos obtidos contra sequências de Spodoptera frugiperda. A análise comparativa da expressão gênica entre lagartas de S. frugiperda resistente e suscetível a lufenuron identificou 1.224 transcritos expressos diferencialmente (p <= 0,05, teste t; expressão relativa > 2). Sete destes transcritos foram associados ao metabolismo da cutícula, sendo cinco deles superexpressos na linhagem LUFR. O metabolismo de detoxificação apresentou 48 transcritos expressos diferencialmente, dos quais foram identificados 40 transcritos associados às monooxigenases P450, cinco a glutationa-S-transferase, dois às carboxilesterases e um a esterase. Foi observado que 39 dos 48 transcritos associados ao metabolismo de detoxificação foram superexpressos na linhagem resistente. Este padrão foi confirmado a partir da expressão relativa utilizando \"PCR quantitativa em Tempo Real - qPCR\". Estes resultados representam um importante passo para o entendimento dos mecanismos moleculares da resistência de S. frugiperda a lufenuron, proporcionando, ainda, uma visão mais ampla do perfil de expressão gênica de insetos a inseticidas. / The genetic and molecular basis of resistance to lufenuron in Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) were exploited in this study. The resistant population of S. frugiperda was selected from a population collected in Montevidiu, Goiás. Initially, a luferunon-resistant strain of S. frugiperda was selected from a population collected in cornfields located in Montevidiu, Goiás State, Brazil, with intense use of this insecticide. The diet surface treatment bioassay was used to characterize the concentration-response to lufenuron in the susceptible (SUS) and resistant (LUF-R) strains of S. frugiperda. The estimated LC50s (95% C.I.) for the SUS and LUF-R strains were 0.23 (0.18 - 0.28) and 210.6 (175.90 - 258.10) ?g of lufenuron.mL-1 respectively, with resistance ratio of ? 915-fold. Based on reciprocal crosses between SUS and LUF-R strains, the inheritance of S. frugiperda resistance to lufenuron was incomplete autosomal recessive. Backcrosses between F1 of the reciprocal crosses and the parental LUF-R revealed a polygenic resistance, with an estimation of the minimum number of resistance genes from 1.54 to 1.71, indicating that the number of loci associated to resistance is low. Then, a new high-throughput cDNA sequencing technologies was explored to characterize the transcriptional profile of larvae of Spodoptera frugiperda, and to compare the differential gene expression between resistant and susceptible strains of S. frugiperda to lufenuron in order to identify the resistance mechanism(s) involved. Four cDNA libraries obtained from fourth instars of the resistant (LUF-R) and the susceptible (SUS) S. frugiperda strains, exposed or not to lufenuron, were sequenced in a HiScan1000® platform (Illumina©). The transcriptome was de novo assembled using nearly 19.6 million single-end reads, leading to 18,506 transcripts with a N50 of 996 bp in length. A Blast search against the non-redundant database available in NCBI allowed the functional annotation of 51.1% (9,457) of the obtained transcripts. Most of these transcripts aligned with insect sequences, and a majority of them (45%) with Bombyx mori (Lepidoptera: Bombycidae). Nearly 10% of the transcripts aligned with species belonging to Spodoptera (Lepidoptera: Noctuidae), with 3% of the alignments matching sequences from Spodoptera frugiperda. Differential gene expression analysis between the resistant and the susceptible strains identified 1,224 differentially expressed transcripts (p <= 0.05, t-test; fold change > 2). Seven of them were associated with the cuticle metabolism, and five out seven were up-regulated in the resistant strain (LUF-R). A large set of transcripts (48) associated with the detoxification metabolism was differentially expressed; 40 P450 monooxygenases, five glutathione-Stransferases, two carboxylesterase and one esterase were identified. Thirty-nine out of these 48 transcripts were up-regulated in the resistant strain. Gene expression data obtained by RNA-Seq analysis was validated by quantitative real time PCR (qPCR) of several selected target transcripts. These results represent an important step toward the understanding of the molecular mechanisms of resistance of S. frugiperda to lufenuron, and provide a broader view on the gene expression profile of insects to insecticides.
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Bases genéticas e moleculares da resistência de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) a lufenuron / Genetic and molecular basis of Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) resistance to lufenuron

Nascimento, Antonio Rogério Bezerra do 23 January 2014 (has links)
As bases genéticas e moleculares da resistência de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) a lufenuron foram exploradas no presente estudo. Inicialmente, uma linhagem de S. frugiperda resistente a lufenuron foi selecionada a partir de uma população coletada na cultura do milho na região de Montevidiu-GO com intenso uso desse inseticida. As curvas de concentração-resposta a lufenuron para as linhagens de S. frugiperda suscetível (SUS) e resistente (LUF-R) a lufenuron foram caracterizadas pelo método de bioensaio com tratamento superficial da dieta artificial. As CL50 (I.C. 95%) estimadas para as linhagens SUS e LUF-R foram de 0,23 (0,18 - 0,28) e 210,6 (175,90 - 258,10) ?g de lufenuron.mL-1 respectivamente, com razão de resistência de ? 915 vezes. A partir dos resultados de cruzamentos recíprocos entre as linhagens SUS e LUF-R, concluiu-se que a herança da resistência de S. frugiperda a lufenuron é autossômica e incompletamente recessiva. Os testes de retrocruzamentos da progênie F1 de cruzamentos recíprocos com o parental LUF-R demonstraram um efeito poligênico para a resistência, com a estimativa do número mínimo de segregações independentes entre 1,54 e 1,71, indicando que o número de loci associado à resistência é baixo. Para conhecer o perfil de transcritos de lagartas de S. frugiperda e avaliar o padrão de expressão gênica diferencial entre lagartas da linhagem LUF-R em comparação ao de lagartas da linhagem SUS, buscando identificar o(s) mecanismo(s) de resistência a lufenuron, foram utilizadas novas tecnologias de sequenciamento em larga escala. Para isso, foram utilizados sequenciamentos de quatro bibliotecas de cDNA (plataforma HiScan 1000, Illumina©) obtidas de lagartas de 4º ínstar de S. frugiperda das linhagens LUF-R e SUS, induzidas ou não com lufenuron. O transcritoma foi construído utilizando aproximadamente 19,6 milhões de leituras single-end, o que gerou 18.506 transcritos, com N50 de 996 pb. A pesquisa contra o banco de dados nr (NCBI) proporcionou anotação funcional de 51,1% (9.457) dos transcritos obtidos, grande parte dos alinhamentos apresentaram homologia a insetos, com o maior número deles (45%) se assemelhando aos de Bombyx mori (Lepidoptera: Bombycidae), enquanto 10% se assemelharam a sequências de diversas espécies do gênero Spodoptera (Lepidoptera: Noctuidae), sendo 3% dos alinhamentos obtidos contra sequências de Spodoptera frugiperda. A análise comparativa da expressão gênica entre lagartas de S. frugiperda resistente e suscetível a lufenuron identificou 1.224 transcritos expressos diferencialmente (p <= 0,05, teste t; expressão relativa > 2). Sete destes transcritos foram associados ao metabolismo da cutícula, sendo cinco deles superexpressos na linhagem LUFR. O metabolismo de detoxificação apresentou 48 transcritos expressos diferencialmente, dos quais foram identificados 40 transcritos associados às monooxigenases P450, cinco a glutationa-S-transferase, dois às carboxilesterases e um a esterase. Foi observado que 39 dos 48 transcritos associados ao metabolismo de detoxificação foram superexpressos na linhagem resistente. Este padrão foi confirmado a partir da expressão relativa utilizando \"PCR quantitativa em Tempo Real - qPCR\". Estes resultados representam um importante passo para o entendimento dos mecanismos moleculares da resistência de S. frugiperda a lufenuron, proporcionando, ainda, uma visão mais ampla do perfil de expressão gênica de insetos a inseticidas. / The genetic and molecular basis of resistance to lufenuron in Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) were exploited in this study. The resistant population of S. frugiperda was selected from a population collected in Montevidiu, Goiás. Initially, a luferunon-resistant strain of S. frugiperda was selected from a population collected in cornfields located in Montevidiu, Goiás State, Brazil, with intense use of this insecticide. The diet surface treatment bioassay was used to characterize the concentration-response to lufenuron in the susceptible (SUS) and resistant (LUF-R) strains of S. frugiperda. The estimated LC50s (95% C.I.) for the SUS and LUF-R strains were 0.23 (0.18 - 0.28) and 210.6 (175.90 - 258.10) ?g of lufenuron.mL-1 respectively, with resistance ratio of ? 915-fold. Based on reciprocal crosses between SUS and LUF-R strains, the inheritance of S. frugiperda resistance to lufenuron was incomplete autosomal recessive. Backcrosses between F1 of the reciprocal crosses and the parental LUF-R revealed a polygenic resistance, with an estimation of the minimum number of resistance genes from 1.54 to 1.71, indicating that the number of loci associated to resistance is low. Then, a new high-throughput cDNA sequencing technologies was explored to characterize the transcriptional profile of larvae of Spodoptera frugiperda, and to compare the differential gene expression between resistant and susceptible strains of S. frugiperda to lufenuron in order to identify the resistance mechanism(s) involved. Four cDNA libraries obtained from fourth instars of the resistant (LUF-R) and the susceptible (SUS) S. frugiperda strains, exposed or not to lufenuron, were sequenced in a HiScan1000® platform (Illumina©). The transcriptome was de novo assembled using nearly 19.6 million single-end reads, leading to 18,506 transcripts with a N50 of 996 bp in length. A Blast search against the non-redundant database available in NCBI allowed the functional annotation of 51.1% (9,457) of the obtained transcripts. Most of these transcripts aligned with insect sequences, and a majority of them (45%) with Bombyx mori (Lepidoptera: Bombycidae). Nearly 10% of the transcripts aligned with species belonging to Spodoptera (Lepidoptera: Noctuidae), with 3% of the alignments matching sequences from Spodoptera frugiperda. Differential gene expression analysis between the resistant and the susceptible strains identified 1,224 differentially expressed transcripts (p <= 0.05, t-test; fold change > 2). Seven of them were associated with the cuticle metabolism, and five out seven were up-regulated in the resistant strain (LUF-R). A large set of transcripts (48) associated with the detoxification metabolism was differentially expressed; 40 P450 monooxygenases, five glutathione-Stransferases, two carboxylesterase and one esterase were identified. Thirty-nine out of these 48 transcripts were up-regulated in the resistant strain. Gene expression data obtained by RNA-Seq analysis was validated by quantitative real time PCR (qPCR) of several selected target transcripts. These results represent an important step toward the understanding of the molecular mechanisms of resistance of S. frugiperda to lufenuron, and provide a broader view on the gene expression profile of insects to insecticides.
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AVALIAÇÃO DE MÚLTIPLOS MECANISMOS DE RESISTÊNCIA ASSOCIADOS EM ISOLADOS CLÍNICOS DE Klebsiella pneumoniae RESISTENTE AOS CARBAPENÊMICOS / EVALUATION OF MULTIPLES ASSOCIATED RESISTANCE MECHANISMS IN CLINICAL ISOLATES OF K. pneumoniae RESISTANT TO CARBAPENEMS

Dalmolin, Tanise Vendruscolo 21 August 2015 (has links)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Antimicrobial resistance is considered a serious public health problem worldwide and complicates the treatment of infections caused by resistant microorganisms. The carbapenems are antimicrobial agents considered the last resource for treatment of severe infections caused by Klebsiella pneumoniae and the resistance to β-lactams can result in the accumulation of different resistance mechanisms (carbapenemases, efflux pump and loss of porins). This study aimed to evaluate multiple resistance mechanisms in 27 clinical isolates of K. pneumoniae resistant to carbapenems coming from the University Hospital of Santa Maria-RS from July 2013 to August 2014. These isolates were evaluated the susceptibility profiles through broth microdilution against ciprofloxacin, imipenem, ertapenem, meropenem, cefepime, ceftazidime and cefoxitin. Carbapenemase detection was performed through phenotypic tests with combined disc test with phenylboronic acid (AFB) and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and Blue-Carba test. In addition, genotypic tests to detect genes enconding carbapenemase were performed. Efflux pump was evaluated by broth microdilution together with efflux pump inhibitor and loss of porins were evaluated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). High levels of resistance verified by the minimum inhibitory concentration (MIC) 50 and 90 for ciprofloxacin (64 and 128μg/mL), imipenem (32 to >128μg/mL), ertapenem (>128 and >128μg/mL), meropenem (128 and >128 μg/mL), cefepime (>128 and >128 μg/mL), ceftazidime (64 and 128μg/mL) and cefoxitin (128 and >128 μg/mL), respectively. In the resistance through carbapenemases production, 89% of the clinical isolates showed blaKPC gene and no clinical isolated showed genes encoding the metallo- β-lactamases. It was observed that the Blue-Carba test and combined disc test with AFB showed 100% concordance, while the combined disc test with EDTA showed high number of false positive (48%) when compared with genotypic test. Four isolates showed phenotypic profile consistent with the presence of efflux pump and all clinical isolates had lost one or both porins, being that in three isolated, this was the only resistance mechanism found. In 14% of the isolates can observe simultaneously observe the presence of three resistance mechanisms. Consequently, it is of fundamental scientific interest that studies are conducted in order to investigate and understand the mechanisms involved in resistance to carbapenems in order to assist strategies of prevention and infection control. / A resistência aos antimicrobianos é considerada um grave problema de saúde pública em âmbito mundial e dificulta o tratamento de infecções causadas por microrganismos resistentes. Os carbapenêmicos são os antibacterianos considerados último recurso para o tratamento de infecções graves causadas por Klebsiella pneumoniae e a resistência a esse grupo de β-lactâmicos pode resultar da acumulação de diferentes mecanismos de resistência (carbapenemases, bomba de efluxo e perdas de porinas). Este trabalho teve como objetivo avaliar os múltiplos mecanismos de resistência de 27 isolados clínicos de K. pneumoniae resistente a carbapenêmicos oriundos do Hospital Universitário de Santa Maria-RS no período de julho de 2013 a agosto de 2014. Foram avaliados os perfis de suscetibilidade desses isolados através de microdiluição em caldo frente aos antimicrobianos ciprofloxacino, imipenem, ertapenem, meropenem, cefepima, ceftazidima e cefoxetina. A detecção de carbapenemases foi realizada através de testes fenotípicos com a utilização do disco de antimicrobiano associado com os inibidores ácido fenilborônico (AFB) e ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) e através do teste Blue-Carba. Também foram realizados testes genotípicos para detectar os genes que codificam as carbapenemases. Bombas de efluxo foram avaliadas através de microdiluição em caldo juntamente com inibidor de bomba de efluxo e a perda de porinas foi avaliada pela eletroforese em gel de sulfato de dodecilo de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE). Altos níveis de resistência foram verificados nesses isolados pela concentração inibitória mínima (CIM) 50 e 90 para ciprofloxacino (64 e 128μg/mL), imipenem (32 e >128μg/mL), ertapenem (>128 e >128μg/mL), meropenem (128 e >128 μg/mL), cefepima (>128 e >128μg/mL), ceftazidima (64 e 128μg/mL) e cefoxitina (128 e >128 μg/mL), respectivamente. Na resistência através da produção de carbapenemases, 89% dos isolados apresentaram o gene blaKPC e nenhum isolado apresentou genes que codificam as metalo-β-lactamases. Foi observado que os testes Blue-Carba e disco combinado com AFB apresentaram 100% de concordância, enquanto o teste de disco combinado com EDTA apresentou elevado número de falso-positivos (48%) quando comparados com o teste genotípico. Quatro isolados apresentaram perfil fenotípico compatível com a presença de bomba de efluxo e todos os isolados apresentaram perda de uma ou ambas porinas, sendo que em três isolados, esse foi o único mecanismo de resistência encontrado. Em 14% dos isolados pode-se observar concomitantemente a presença dos três mecanismos de resistência. Devido ao exposto, é de fundamental interesse científico que estudos sejam realizados para investigar e compreender os mecanismos envolvidos na resistência aos carbapenêmicos, a fim de auxiliar em estratégias de prevenção e controle de infecção.
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Resistance to pyrethroid and oxadiazine insecticides in Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) populations in Brazil / Resistência de Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) a inseticidas dos grupos piretroides e oxadiazinas no Brasil

Durigan, Mariana Regina 07 May 2018 (has links)
Helicoverpa armigera (Hübner) was officially reported in Brazil in 2013 causing serious damage to several crops, especially soybean and cotton crops. Because of this severe damage and also because H. armigera is more tolerant to insecticides in compare to other lepidopteran pests in Brazil, there was a significant increase of selection pressure with insecticides in the field. Many cases of insecticide resistance, especially to pyrethroids, have been reported in some countries of the Old World. The main objective of the present study was to characterize the susceptibility of H. armigera and to investigate the mechanisms of its resistance to pyrethroids and indoxacarb in Brazilian populations. Mortality of H. armigera populations was less than 50% when treated with the highest dose of 10 &mu;g a.i./3rd-instar larva of fenvalerate and deltamethrin. Field populations of H. armigera monitored from 2013 to 2016 growing seasons showed mean mortalities of 10 to 40% at the diagnostic dose of 10 &mu;g a.i./3rd-instar larva. The resistance ratio to pyrethroid was 780-fold. The frequency of the chimeric P450 CYP337B3 gene was above 0.95 in all 33 populations screened. The genetic basis of H. armigera resistance to pyrethroids was also investigated. The dominance degree varied from 0.66 to 0.92, i.e., incompletely to completely dominant, and resistance was characterized as autosomal and polygenic. Possible mutations in the sodium channel were investigated, as well as the expression of other P450 genes via RT-qPCR. Two non-synonymous mutations, V937G and Q960H were found, and the genes CYP6AB10, CYP301A, CYP4S13 and CYP321A5 were up-regulated in the Brazilian pyrethroid-resistant strain compared to the susceptible strain. The susceptibility of H. armigera populations to indoxacarb was characterized with a diet overlay bioassay in 3rd-instar larvae. LC50 values ranged from 0.22 (0.16-0.28) &mu;g a.i./cm2 to 0.57 (0.41-0.82) &mu;g a.i./cm2, varying 2.6-fold. The populations were monitored through the 2013-2017 growing seasons, with the diagnostic dose of 6.1 &mu;g a.i./cm2; during the period, the susceptibility to indoxacarb decreased. An indoxacarb-resistant strain was selected under laboratory conditions and showed a resistance ratio of 297.5-fold. These results will contribute to decision-making and implementation of insect resistance-management (IRM) programs in Brazil and other recently invaded countries in Brazil. / Helicoverpa armigera (Hübner) foi reportada oficialmente no Brasil em 2013, ano em que causou grandes perdas em lavouras de soja e algodão no país. Devido ao ataque severo de H. armigera e por ser mais tolerante do que as demais pragas que ocorriam no Brasil, houve um aumento significativo da pressão de seleção com inseticidas no campo. Inúmeros casos de resistência desta praga a inseticidas do grupo dos piretroides já havia sido reportado em alguns países do Velho Mundo. Dentro desse contexto o objetivo desse trabalho foi caracterizar a suscetibilidade e investigar possíveis mecanismos de resistência a piretroides bem como indoxacarb no Brasil. A mortalidade das populações de H. armigera foi menor do que 50 % quando tratadas com a dose máxima de 10 &mu;g i.a./lagarta de 3º instar para fenvalerato e deltametrina. As populações de campo de H. armigera monitoradas entre os anos de 2013 a 2016 na dose diagnóstica de 10 &mu;g i.a./lagarta de 3º instar apresentaram mortalidade de 10 a 40%. A frequência do gene P450 CYP337B3 foi maior do que 0,95 em 33 populações testada. Além disso, as bases genéticas da resistência de H. armigera a piretroides foram investigadas e a razão de resistência com a linhagem suscetível foi de 780 vezes. O grau de dominância variou de 0,66 a 0,92, incompletamente e completamente dominante e a resistência foi caracterizada como autossômica e poligênica. Adicionalmente investigou-se a presença de possíveis mutações no canal de sódio bem como a expressão de outros genes P450 em uma linhagem resistente a piretroides. Foi possível detectar duas mutações não-sinonímias V937G, e Q960H no canal de sódio e os genes CYP6AB10, CYP301A, CYP4S13 e CYP321A5 foram super expressos na linhagem resistente. A suscetibilidade de populações de H. armigera para o inseticida indoxacarb foi caracterizada a partir de bioensaios de ingestão com lagartas de 3° instar. Os valores de CL50 variaram de 0,22 (0,16 - 0,28) &mu;g i.a./cm2 até 0,57 (0,41 - 0,82) &mu;g i.a./cm2 variando em 2,6 vezes. As populações foram monitoradas ao longo das safras agrícolas entre 2013 e 2017 com a concentração diagnóstica de 6,1 &mu;g i.a./cm2 e observou-se uma diminuição na suscetibilidade da praga a indoxacarb. Uma linhagem resistente a indoxacarb foi selecionada em laboratório e comparada com uma linhagem suscetível de referência, apresentando uma razão de resistência de 297,5 vezes. Os resultados obtidos são extremamente importantes e poderão contribuir na tomada de decisões bem como na implementação de programas de manejo da resistência de insetos (MRI) no Brasil.
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Investigações sobre os mecanismos de resistência em larvas e adultos de Aedes aegypti, Linnaeus, 1762

Medeiros, Priscila Fernandes Viana January 2011 (has links)
Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-09-21T12:34:57Z No. of bitstreams: 1 priscila_f_v_medeiros_ioc_bp_0058_2011.pdf: 6129115 bytes, checksum: a9a22a0f84ef8206e0afcbc77535046a (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-21T12:34:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 priscila_f_v_medeiros_ioc_bp_0058_2011.pdf: 6129115 bytes, checksum: a9a22a0f84ef8206e0afcbc77535046a (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O uso de inseticidas neurotóxicos contra o mosquito Aedes aegypti ainda é um componente importante nos programas de controle de dengue. No Brasil, organofosforados (OP) e piretróides (PI) são usados para o controle de larvas e adultos de A. aegypti, respectivamente, desde 1967 e 2000. O uso frequente destes produtos selecionou populações resistentes do vetor, e motivou o Ministério da Saúde (MS) a coordenar, desde 1999, uma rede nacional de monitoramento da resistência de A. aegypti (MoReNAa), da qual nosso laboratório participa desde o início. A resistência é principalmente derivada de fatores metabólicos (enzimas que detoxificam o inseticida) ou de mutações nos sítios-alvo dos inseticidas, no Sistema Nervoso Central. Bioensaios com larvas revelaram a resistência de várias populações ao OP temephos, larvicida empregado há mais de 40 anos no país. A Rede MoReNAa conta também com bioensaios para adultos, com testes moleculares para avaliação de alteração no alvo de PI, o canal de sódio regulado por voltagem (AaNav) e com ensaios bioquímicos para quantificação, em mosquitos adultos, da atividade enzimática de Glutationa S-Transferases (GST), Esterases e Oxidases de Função Mista (MFO) (relacionadas à resistência metabólica), e de Acetilcolinesterase (Ace) (alvo de OP e carbamatos - CB). Além de serem usadas classes distintas de inseticidas contra larvas e adultos, as aplicações são feitas de maneira diferenciada: em 4-6 ciclos anuais sobre as larvas, e apenas em situações de emergência sobre os mosquitos adultos - procedimento que tem o potencial de elicitar mecanismos (e intensidades) de resistência diferentes. Além disso, bioensaios para quantificação da resistência a OP são feitos com larvas, enquanto os ensaios bioquímicos estavam disponíveis apenas para mosquitos adultos. Estes foram os principais motivos para adaptar, no âmbito desta dissertação, ensaios bioquímicos para o estágio larvar do vetor. Em relação ao ensaio da Ace, que conta com duas reações, uma na presença e a outra na ausência do CB propoxur verificamos, por meio de curvas do tipo dose- resposta, diferenças entre larvas e adultos. Além disto identificamos, em algumas populações do vetor resistentes a OP, alterações na atividade total desta enzima. Uma vez que algumas destas enzimas participam também de processos endógenos, que ocorrem naturalmente nos insetos, quantificamos sua atividade ao longo do desenvolvimento da cepa referência de suscetibilidade, Rockefeller, e de duas populações de campo. Nestes ensaios foram observadas quatro grandes “categorias” de perfis de atividade enzimática: 1) maiores atividades no estágio adulto (AChE); 2) maiores atividades no estágio larval (Esterases “α-EST” e “β-EST”); 3) atividades que aumentam no decorrer de cada estágio avaliado (MFO) e 4) atividades que tendem a aumentar no estágio larvar e a diminuir nos primeiros dias de vida adulta (DVA) (Esterase “ρNPA” e GST). Posteriormente, ensaios bioquímicos com larvas e adultos de populações de campo revelaram alterações de Ace e Esterases preferencialmente no estágio larvar, alterações de GST mais restritas ao estágio adulto, e alteração de MFO nos dois estágios do vetor. Estes ensaios possibilitam conhecer com detalhe os mecanismos de resistência em diferentes populações do vetor e podem contribuir com a definição de estratégias racionais para o controle de A. aegypti. / The use of neurotoxic insecticides against the mosquito Aedes aegypti is still an important component in dengue control programs. In Brazil, organophosphates (OP) and pyrethroids (PI) are used for the control of A. aegypti larvae and adults since, respectively, 1967 and 2000. The frequent use of these products has selected resistant vector populations, and prompted the Ministry of Health (MS) to start the coordination, in 1999, of an Aedes aegypti insecticide resistance monitoring network (MoReNAa); our laboratory participates in the network since its beginning. Resistance is mainly derived from metabolic factors (enzymes detoxifying the insecticides) or from mutations at the target sites of insecticides (in the Central Nervous System). Bioassays with larvae disclosed resistance of various populations to the OP temephos, larvicide employed for over 40 years in the country. MoReNAa network also performs bioassays with adults, molecular tests to assess substitution at the PI target site, the voltage regulated sodium channel (AaNAv), and biochemical assays that quantify, in adult mosquitoes, the activity of Glutathione S-Transferases (GST), Esterases and Mixed Function Oxidases (MFO) (related to metabolic resistance), and of Acetylcholinesterase (Ace) (target of OP and carbamates - CB). Besides using different insecticide classes against larvae and adults, the treatment are performed differently: in 4-6 times per year for larvae and only in emergency situations in the case of adult mosquitoes – a procedure that has the potential to elicit different mechanisms (and intensities) of resistance. Furthermore, bioassays for quantification of resistance to OP are made with larvae, while biochemical assays were available only for adult mosquitoes. These were the main reasons to adapt, in the context of this dissertation, biochemical assays for the larval stage of the vector. Considering the Ace test, consisting of two reactions, in the presence or in the absence of the CB propoxur, we identified - through the use of inhibition curves - differences between larvae and adults. We also detected, in some OP resistant vector populations, changes in the total activity of this enzyme. Since some of the enzymes of metabolic resistance are also involved in endogenous processes, that occur naturally in insects, we quantified their activity during the development of the reference strain of susceptibility, Rockefeller, and of two field populations. In these experiments we observed four major "categories " of enzyme activity profiles: 1) higher activity in the adult stage (AChE); 2) higher activity in the larval stage (“α-EST” and “β- EST” Esterases); 3) activities that increase during each stage evaluated (MFO) and 4) activities tending to increase in the end of the larval stage and to decrease in the first days of adult life (DVA) (Esterase “ρNPA” and GST). Subsequently, biochemical assays with larvae and adults of field populations revealed main changes in Ace and Esterases in the larval stage, GST changes preferably in the adult stage, and MFO alterations on both vector stages. These assays enable the detailed knowledge of resistance mechanisms of different vector populations and can contribute to define rational strategies for A. aegypti control.

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