Dans cette thèse, nous avons développé une nouvelle technique de microscopie holographique digitale hétérodyne pour détecter et localiser en trois dimensions des nanoparticules d'or utilisées comme marqueurs biologiques dans des cellules vivantes. On combine la géométrie hors-axe et l'interférométrie par décalage de phase, où deux modulateurs Acousto-Optique minutieusement synchronisés sont utilisés, afi n d'obtenir des hologrammes sans alias. La détéction hétérodyne permet d'atteindre la limite de bruit théorique (shot-noise). Nous avons aussi élaboré une méthode de reconstruction numérique astucieuse : les images reconstruites ne souff rent pas de distortions longitudinales, les parmètres de reconstruction sont obtenus sans avoir besoin de les mesurer en e ffectuant une calibration expérimentale supplémentaire, la compensation des aberrations et les corrections de courbure de phase sont automatiquement obtenus. Nous avons pu imager et localiser, pour la première fois dans le contexte de la microscopie holographique digitale, des billes d'or de 40 nm de diamètre, attachées aux récepteurs transmembrannaires intégrine de fibroblastes 3T3 vivantes avec une précision de localization de 5 nm latéralement et 100 nm en profondeur quand un moyennage sur 32 images est eff ectué. De plus, une exploration 3D, dans un volume relativement grand (90x90x90) microm, de la totalité du champ diff usé est obtenu. Finalement, nous avons pu caractériser les régimes de di ffusion des marqueurs d'or et des structures cellulaires en analysant la forme 3D des motifs de diff usion correspondants qui sont facilement accessible par holographie digitale.