Infections in critically ill patients are a problem for the healthcare system and at any one time, 70 % of all intensive care unit (ICU) patients are treated with antibiotics. Antibiotics bind toproteins in the blood, but only unbound drug can diffuse over capillary membranes and bindto the targeted receptor. Standard protein binding percentages for antibiotics have been developed from studies on healthy volunteers and dosing regimens for patients are adapted accordingly. The determination of the total concentration of antibiotics in patients’ bloodsamples is, based on the standard percentages, ordinarily representative for the pharmacological effect of the antibiotic. However, certain conditions that are common incritically ill patients can alter protein binding percentages, resulting in a larger or smaller unbound fraction. This in turn can result in toxicity or therapeutic failure. The aim of this project was to develop an analytical method for the determination of the unbound concentration of the Beta-Lactam antibiotics cefotaxime, flucloxacillin, cloxacillin and piperacillin in plasma. A method was successfully developed using ultrafiltration for the extraction of unbound analytes and ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry, UHPLC-MS/MS, for their quantification. The method was partly validated according to the European Medicines Agency’s guidelines on bioanalytical method validation. / Kritiskt sjuka patienter med infektioner är en börda för sjukvården och 70 % av alla patienter på intensivvårdsavdelningar är ordinerade antibiotika. Antibiotika binder till proteiner i blodet, men enbart den icke-proteinbundna (fria) fraktionen kan diffundera över kapillära membran och binda till receptorer. Standardproteinbindningsgrad för olika antibiotika har utvecklats från studier på friska frivilliga och doseringen av läkemedlen är anpassade därefter. Den totala koncentrationen av antibiotika i patienters blod är vanligen representativ för den farmakologiska effekten. Dock kan vissa sjukdomar påverka proteinbindningsgraden vilket resulterar i en större eller mindre mängd fria antibiotika i blodcirkulationen. Det här kan i sintur resultera i toxicitet eller otillräcklig effekt av läkemedlet. Syftet med det här projektet var att utveckla en analytisk metod för att bestämma den fria koncentrationen av Beta-Lactam antibiotikan cefotaxim, flukloxacillin, kloxacillin och piperacillin i plasma. En metod utvecklades med ultrafiltrering för extraktion av den fria fraktionen och högupplösande vätskekromatografi och tandem masspektrometri, UHPLCMS/MS, för kvantifiering av analyterna. Metoden validerades delvis enligt den Europeiska Läkemedelsmyndighetens riktlinjer för bioanalytisk metodvalidering.