Tesis para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de especialización en Bioquímica de Proteínas y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / En el metabolismo heterotrófico, NADH y NADPH se producen a partir de la oxidación de intermediarios por las deshidrogenasas presentes en las vías del metabolismo central. Durante el crecimiento de Escherichia coli en glucosa como única fuente de carbono, un tercio de la producción total del NADPH proviene de las deshidrogenasas de la rama oxidativa de la vía de las pentosas fosfato: la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa y la 6-fosfogluconato deshidrogenasa. Diversos grupos han estudiado como se altera la fisiología de E. coli cuando se modifican las razones NADH/NAD y NADPH/NADP, encontrando que la sobreproducción de NADPH puede llevar a la inviabilidad celular cuando se utiliza glucosa como única fuente de carbono. Estudios para comprender la importancia del balance de cofactores han llevado a cambiar la especificidad de sustrato de estas enzimas, de modo que puedan usar NAD como cofactor en lugar de NADP. Este enfoque ha sido fructífero en el caso de glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, pero no en el caso de 6-fosfogluconato deshidrogenasa. Esta enzima cataliza la descarboxilación de 6-fosfogluconato para producir ribulosa 5-fosfato, usando NADP como cofactor con alta especificidad. Una forma de estudiar este problema es investigando el efecto en el metabolismo, de forzar el flujo de glucosa hacia la vía de las pentosas fosfato. Bajo condiciones de crecimiento en glucosa, la sobreproducción de NADPH generaría una reducción significativa de la tasa de crecimiento de E. coli. La hipótesis de este trabajo es que el cambio de especificidad in vivo de la 6-fosfogluconato deshidrogenasa de Escherichia coli desde NADP a NAD, permite una recuperación parcial en la tasa de crecimiento en una cepa Δpgi ΔudhA, incapaz de sobrevivir en medio mínimo con glucosa como única fuente de carbono, debido a la alteración en la topología de las vías centrales del metabolismo. Para cambiar la especificidad por cofactor de la 6-fosfogluconato deshidrogenasa, en este trabajo, se implementaron metodologías de diseño racional y evolución dirigida para lograr la forma NAD específica. Para identificar posiciones determinantes de la especificidad por NAD(P) se realizó un análisis de traza evolutiva de la familia 6-fosfogluconato deshidrogenasa. Se encontró 3 loops que serían relevantes para la especificidad por NAD(P), incluyendo el motivo NRX3K contenido en el loop β2-α2 del bolsillo de unión a dinucleótido en la enzima de E. coli. Desde este análisis, se generó mediante mutagénesis sitio dirigida la variante N33D-R34V-S35K-K38N. Debido a la presencia de estas mutaciones, la KM para NAD disminuyó 5 veces mientras que no se observó actividad con NADP. Se generó la cepa de E. coli Δpgi Δ(edd-eda) ΔudhA Δgnd mediante la eliminación del gen de fosfoglucosa isomerasa, el operón Entner-Doudoroff, de la 6-fosfogluconato deshidrogenasa y de la transhidrogenasa UdhA, que reoxida el NADPH. Esta cepa presentó una marcada disminución en la tasa de crecimiento debido al incremento en la producción de NADPH al desviar el flujo de glucosa a través de la vía de las pentosas fosfato. Esta mutante se transformó con un plásmido que poseía la versión del gen de 6-fosfogluconato deshidrogenasa dependiente de NAD, encontrándose que la presencia de la 6-fosfogluconato deshidrogenasa productora de NADH le permite a esta bacteria recuperar la capacidad de crecer en medio mínimo suplementado con glucosa como única fuente de carbono. Para incrementar la especificidad de la enzima por NAD, se generó una librería por mutagénesis de saturación de sitios en 4 residuos dentro de los 3 loops. Además, se desarrolló un sistema de selección basado en la cepa de E. coli Δpgi Δ(edd-eda) ΔudhA Δgnd. Debido a las diferencias en las velocidades de crecimiento, se logró diseñar un sistema de selección basado en el enriquecimiento de cultivo, aislando aquellas cepas que estaban complementadas con 6-fosfogluconato deshidrogenasa productora de NAD. Sin embargo, al usar el protocolo propuesto se observó que los niveles de expresión de las variantes de enzimas varían considerablemente entre antes y después de someter la cepa a selección en medio mínimo, por lo que el protocolo debe ser optimizado para que el cepa sea utilizada como sistema de selección para una librería de variantes 6-fosfogluconato deshidrogenasa. De este trabajo se concluye que el uso in vivo de una variante de 6-fosfogluconato deshidrogenasa con un cambio de especificidad de cofactor desde NADP a NAD, permite recuperar parcialmente el crecimiento en medio mínimo suplementado con glucosa como única fuente de carbono, probablemente debido a modificaciones en el balance de los cofactores NAD(P)H/NAD(P). Finalmente, la relación entre el crecimiento y la especificidad de las deshidrogenasas del metabolismo central puede ser utilizada como método de selección de variantes con especificidad de cofactor cambiada de NADP a NAD mediante evolución dirigida / In the heterotrophic metabolism, NADH and NADPH are produced from the oxidation of intermediates by dehydrogenases present in central metabolism pathways. During the growth of Escherichia coli in glucose as sole carbon source, one third of the total NADPH production belongs to the oxidative branch of the pentose phosphate pathway: the glucose 6-phosphate dehydrogenase and the 6-phosphogluconate dehydrogenase. Several groups have been studying how the E. coli physiology is modified when NADH/NAD and NADPH/NADP are altered, finding that NADPH overproduction could lead to cell unviability when glucose is the sole carbon source. Studies to understand the importance of cofactor balance have lead to change the substrate specificity of theses enzymes, in order to use NAD as cofactor instead of NADP. This approach has been succeeding for glucose 6-phosphate dehydrogenase, but not for 6-phosphogluconate dehydrogenase. This enzyme catalyzes the decarboxylation of 6-phosphogluconate to produce ribulose 5-phosphate, using NADP as cofactor with high specificity. One form of to study this problem is investigating the effect in the metabolism, due to force the glucose flux through the pentose phosphate pathway. Under glucose growth conditions, NADPH overproduction would generate a significant reduction in growth rate of E. coli. The hypothesis of this work is that the specificity change in vivo of the 6-phosphogluconate dehydrogenase from E. coli, from NADP to NAD, allows to restore partially the growth rate in a Δpgi ΔudhA strain, unable to grow in minimal media with glucose as sole carbon source, due to modifications in the topology of the central metabolism pathways. To change the cofactor specificity of the 6-phosphogluconate dehydrogenase, in this work, rational design and directed evolution methodologies were implemented to obtain the NAD-specific form. To identify determinants positions of the NAD(P) specificity, evolutionary trace analysis to the 6-phosphogluconate dehydrogenase family was performed, finding 3 loops that could be relevant for NAD(P) specificity, including the β2-α2 loop containing the NRX3K motif of the dinucleotide binding pocket of the E. coli enzyme. From this analysis, the variant N33D-R34V-S35K-K38N was generated by site-directed mutagenesis. Due the presence of these substitutions, the NAD KM decreased 5-times and no activity was observed with NADP. A E. coli Δpgi Δ(edd-eda) ΔudhA Δgnd strain was generated by deleting phosphoglucose isomerase gen, Entner-Doudoroff operon, 6-phosphogluconate dehydrogenase and UdhA transhydrogenase, which reoxidize NADPH. This strain shows a remarkable decreased growth rate due to NADPH production increment by forcing glucose flux through pentose phosphate pathway. This strain was transformed with a plasmid bearing a 6-phosphogluconate dehydrogenase gen variant NAD-dependent, finding that the presence of the NADH-producing 6-phosphogluconate dehydrogenase allows the bacteria to restore the capacity to grow in minimal media with glucose as sole carbon source. In order to increase the NAD specificity, a clone library by site-saturation mutagenesis of 4 residues within the 3 loops was performed. In addition, a selection strategy based on the designed strain was developed. Since the growth rates differences, a selection system based on enrichment culture, isolating NAD-producing 6-phosphogluconates bearing strains. However, with the proposed protocol, enzymes variants expression levels vary between before and after strain culturing in minimal media, so the protocol must be optimized in order to use the strain as a selection system for a 6-phosphogluconate dehydrogenase library. We conclude from this work that the usage in vivo of a 6-phopshogluconate dehydrogenase variant with a specific change from NADP to NAD, allows partially restore the growth rate of an unviable strains in glucose as sole carbon source, probably by modifications in the NAD(P)H/NAD(P) cofactors balance. Finally, the relation between growth rate and central metabolism dehydrogenase specificity can be used for biotechnological purposes, like a selection system for directed evolution / FONDECYT 1121170 y 1140754 ; CONICYT PCHA/Beca Magíster