Ribulose-1,5-Bifsfosfato (RuBP) carboxilase/oxigenase (RuBisCO) é a enzima chave para a fixação do carbono atmosférico e para a produtividade das plantas. Não há, até o momento, uma metodologia estabelecida para otimizar o processo de fixação do CO2 nas diferentes espécies de plantas. Entretanto, a disponibilidade de um protocolo de transformação genética de cloroplasto de tabaco permite tentativas de manipulação da enzima RuBisCO visando aumento da eficiência fotossintética. Nas plantas, esta proteína é formada por 8 subunidades menores codificadas pelo gene rbcS localizado no genoma nuclear e por 8 subunidades maiores codificadas pelo gene rbcL localizado no genoma de cloroplastos. Neste trabalho, dois genes rbcL-sintéticos, um com a substituição da alanina (A) 378 por uma valina (V) (A378V) e outro sem a substituição foram utilizados para a construção dos vetores pTT629, pTT630, pTT632 e pTT633. Estes vetores foram usados para transformar o cloroplasto de folhas de tabaco, pelo método de biolística. Um total de 35 plantas transplastômicas se desenvolveram sob seleção dos antibióticos espectinomicina (500 mg/L) e estreptomicina (500 mg/L) e a análise molecular dos sítios de restrição AccI, EcoRI, NdeI e NsiI, de fragmentos amplificados da sequência codante atpB::rbcL:: aadA:: accD demonstrou a integração dos genes rbcL-sintéticos em 11 linhagens transplastômicas. Sementes F1 destas plantas demonstraram ser homoplásmicas pela germinação na presença do antibiótico espectinomicina (500 mg/L). Análises fisiológicas das taxas de fotossíntese (A), condutância estomática (gs) e de transpiração (E) das plantas transplastômicas (A378V) mantidas em casa-de-vegetação produziram valores maiores e significativos, quando comparados com as plantas sem a mutação e controle não transgênicos. O aumento da taxa de fotossíntese das linhagens transplastômicas indicam a possibilidade de aumento da atividade catalítica da RuBisCO. A compreensão da interação fotossintética com a atividade fotorrespiratória poderá permitir explorar e estender possíveis benefícios, como o aumento da produtividade em cultivares de interesse agronômico. / Ribulose-1,5-Bifsfosfato (RuBP) carboxylase/ oxygenase (RuBisCO) is the key enzyme for the fixation of atmospheric carbon and productivity of plants. At moment, no single solution to optimize the CO2 fixing process by the different species of plants. The availability of a few efficient chloroplast transformation protocols for all cultivars also directs attempts to manipulate the larger and small subunit of RuBisCO. In plants, this protein consists of coding form eight smaller subunits encoding the rbcS gene and 8 larger subunits of the rbcL gene respectively located in the nucleus and chloroplasts. Using two rbcL-synthetic genes, with an alanine (Ala) 378 substituting a valine (Val) (A378V) and another one without the replacement were used in the construction of pTT629, pTT630, pTT632 and pTT633 vectors, which were used in the method of biolistic to driving these transgenes into the chloroplast genome of tobacco. A total of 35 transplastomic plants were grown under selection of antibiotics spectinomycin (500mg/ L) and streptomycin (500mg/ L) and the molecular analysis using restriction sites AccI, EcoRI, NdeI and NsiI from the amplified fragments of atpB::rbcL:: aadA:: accD sequence displayed the rbcL-synthetic genes integrated into the plastome of the 11 transplastomic lines. The F1 seeds of these plants were shown to be homoplasmic from germinating in the presence of the antibiotic spectinomycin (500mg / L). The physiology analyzes of photosynthesis (A), stomatal conductance (gs) and transpiration (E) rates of these transplastomic lines (A378V) plants kept in green-house produced the highest and significant values when when compared to the control plants without the mutation and non-transgenic control. The increase of the photosynthesis rate form transplastomic lines indicates the possibility of increasing the catalytic activity of RuBisCO. The understanding of the photosynthetic interaction with photorespiration activity may allow explore more the potential benefits, such as increased productivity in crops of agronomic interest.

SOUSA, Rachel Hellen Vieira de. Silenciamento de peroxidase do ascorbato peroxissomal induz mudanças antioxidantes capazes de atenuar estresse oxidativo induzido por excesso de H2O2 na deficiência de catalase. 2014. 93 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2014. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-06-29T12:54:56Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_rhvsousa.pdf: 1853718 bytes, checksum: da11921f6237d61d7d067fa8e43834c7 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:13:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_rhvsousa.pdf: 1853718 bytes, checksum: da11921f6237d61d7d067fa8e43834c7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:13:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_rhvsousa.pdf: 1853718 bytes, checksum: da11921f6237d61d7d067fa8e43834c7 (MD5) Previous issue date: 2014 / The ascorbate peroxidase (APX) and catalase (CAT) are the most important enzymes in removing H2O2 of plant cells. Both are present in peroxisomes. In high photorespiration, the amount of H2O2 in peroxisomes is increased, due to greater activity of glycolate oxidase (GO), enzyme producer of H2O2. Catalase has greater involvement in the removal of H2O2 presenting a high Km and the ability to scavenge higher concentrations of H2O2 than APX. The importance of the peroxisomal isoform of APX in antioxidant metabolism of plant cells is still unknown. There are few papers in literature reporting the role of pAPX. Thus, we performed this work with the objective of evaluating the effect of catalase inhibition in rice plants (APX4) silenced in APX’s peroxisomal isoform. Initially, it was performed a characterization work of three lines of APX4 (Lg, Lh and Lj), aiming to select one line for future studies. It was observed lower GO activity and a slight increase in net photosynthesis in the three mutant lines. Based on biochemical, physiological and photosynthetic parameters, APX4-Lg line was chosen. The APX4 silencing resulted in suppression of expression of the other peroxisomal isoform, APX3. Subsequently, experiments were conducted with catalase inhibition by aminotriazole (AT) in plants NT and APX4. Mutant plants had less electrolyte leakage than NT plants when catalase was inhibited. The synthesis of GSH in the absence of CAT was higher in NT plants. After CAT inhibition, GPX activity increase was higher in APX4 than in NT plants. In order to induce a greater effect of the CAT absence, an experiment was performed combining CAT inhibition with light (1000 μmol photons m -2 s -1), in leaf segments. Similar to the results found in plants, APX4 suffered less than NT plants, with catalase inhibition. APX4 plants also showed higher Fv/Fm, lower electrolyte leakage and lower accumulation of H2O2, in AT+light treatment. Experiments with inhibition of GO were also conducted in order to reduce photorespiration. These results show that plants silenced in APX4 exhibited greater tolerance to inhibition of catalase by a new redox homeostasis able to cope with the catalase inhibition. Further studies are needed to elucidate the mechanisms that APX4 plants have developed to provide better acclimation to catalase inhibition. / As enzimas Peroxidase do ascorbato (APX) e catalase (CAT) são as mais importantes na remoção de H2O2 nas células vegetais. Ambas estão presentes nos peroxissomos. Em elevada fotorrespiração a quantidade de H2O2 nos peroxissomos é aumentada, em função de uma maior atividade de glicolato oxidase (GO), enzima produtora de H2O2. A catalase se destaca na remoção de H2O2 por possuir um Km elevado e ser capaz de eliminar maiores concentrações de H2O2 do que a APX. A importância da isoforma peroxissomal da APX no metabolismo antioxidante das células vegetais ainda é desconhecida. Há poucos trabalhos na literatura que estudam a papel da APXp. Para tanto, realizamos esse trabalho com o objetivo de avaliar o efeito da inibição da catalase em plantas de arroz (APX4) silenciadas em uma isoforma peroxissomal de APX. Inicialmente foi realizada uma caracterização de três linhagens de APX4 (Lg, Lh e Lj), com o objetivo de selecionar uma para estudos futuros. Foi observado uma menor atividade de GO e um leve aumento na fotossíntese liquida nas três linhagens mutantes. Com base em parâmetros bioquímicos, fisiológicos e fotossintéticos, foi escolhida a linhagem APX4-Lg. O silenciamento da APX4 resultou em supressão da expressão da outra isoforma peroxissomal, APX3. Posteriormente, foram realizados experimentos inibindo a catalase com aminotriazol (AT) em plantas NT (não transformadas) e APX4. As plantas mutantes tiveram um menor vazamento de eletrólitos do que as NT, com a inibição da catalase. A síntese de GSH (glutationa reduzida), na ausência de CAT, foi maior nas plantas NT. Com a inibição da CAT a atividade de GPX (peroxidade da glutationa) aumentou mais nas plantas APX4. Com o objetivo de induzir uma maior efeito da ausência de CAT, foi realizado um experimento combinando inibição CAT com luz (1000 μmol fótons m-2s-1), em segmentos. Semelhante ao resultados encontrados em plantas, as plantas APX4 sofreram menos com a inibição da catalase. Visto que no tratamento de AT+luz as plantas mutantes, comparadas com as NT, apresentaram maior Fv/Fm, menor vazamento de eletrólitos e menor acumulação de H2O2. Experimentos com inibição de GO também foram conduzidos, com o intuito de reduzir a fotorrespiração. Estes resultados mostram que as plantas silenciadas em APX4 apresentam uma maior tolerância a inibição da catalase através de uma nova homeostase redox capaz de lidar melhor com ausência de catalase. Estudos posteriores são necessários para elucidar quais mecanismos as plantas APX4 desenvolveram para conferir a elas uma melhor aclimatação a ausência de catalase.