A galectina-3, um membro da família das proteínas de ligação a glicanas, tem sido objeto de intensa pesquisa nos últimos anos devido ao seu importante papel na biologia tumoral, como a proliferação, transformação, apoptose, angiogênese, adesão, invasão e metástase tumoral. As diferentes funções de galectina-3 nas células tumorais resultam das suas diversas localizações inter- e subcelulares que lhe permite interagir com diferentes proteínas. Esta tese teve como objetivo identificar um papel específico de galectina-3 na regulação da via de sinalização Notch, que cada vez mais tem sido associada com a progressão tumoral e angiogênese. Inicialmente, demonstramos que galectina-3 interage com o receptor Notch-1 e modula diferencialmente a ativação da via pelos ligantes DLL4 e Jagged1. A galectin-3 regulou a expressão dos ligantes de Notch assim como o receptor Notch-1 e extracelularmente recuperou a ativação de Notch na ausência de galectina-3 endógena. Em câncer gástrico humano, a galectina-3 encontrou-se positivamente correlacionada com a expressão de Jagged1, enquanto que a galectina-1, um outro membro da família das galectinas, foi positivamente correlacionado com DLL4. De seguida estudou-se o papel biológico da regulação da via Notch pela galectina-3 na angiogênese. Demonstramos que nas células endoteliais, galectina-3 liga e aumenta a meia vida de Jagged1 promovendo a ativação preferencial da Jagged1/Notch em vez de DLL4/Notch de uma forma independente de VEGF. Verificamos que condições de hipóxia alteraram a expressão de galectina-3 assim como o status de glicosilação das células endoteliais de forma a promover a ativação de Jagged1/Notch e o aumento de angiogênese. A superexpressão de Jagged1 num modelo de carcinoma de pulmão de Lewis, acelerou o crescimento tumoral in vivo que foi inibido em camundongos Lgals3-/-. Por fim, avaliou-se o papel de galectina-3 na resistência das células tumorais a quimioterápicos. Observamos que a expressão de sialil-Tn, um produto biossintético da ST6GalNAc-I, diminuiu in vitro como in vivo a presença e os sítios de ligação de galectina-3 na superfície da células levando à sua acumulação no meio intracelular. Extracelularmente, galectina-3 não levou à indução de morte celular, no entanto contribuiu para a morte induzida por quimioterápicos. As células expressando sialil-Tn encontraram-se protegidas. Em amostras de tumor gástrico, os sítios de ligação de galectina-3 encontraram-se negativamente correlacionados com a expressão de sialil-Tn. Este conhecimento possui implicações diretas no desenvolvimento de estratégias visando o controle do crescimento tumoral e angiogênese e abre novas perspectivas no combate à resistência tumoral à terapia / Galectin-3, a member of a family of glycan binding proteins has been the subject of an intense research over the past few years due to its important role in cancer biology, such as cancer cell growth, transformation, apoptosis, angiogenesis, adhesion, invasion and metastasis. The different roles of galectin-3 on cancer cells behavior appears to have originated from its diverse inter- and subcellular localizations where it interacts with several different binding partners. The aim of this thesis was to pinpoint a specific role for galectin-3 in regulating Notch signaling pathway in cancer. Notch signaling has emerged as an important pathway in carcinogenesis, and activated Notch-1 signaling has being associated with cancer progression and angiogenesis. Initially, we found that galectin-3 was able to interact with Notch-1 receptor and to differentially modulate Notch signaling activation by DLL4 and Jagged1 ligands. Galectin-3 was found to regulate the expression of the Notch ligands and Notch-1 receptor and its extracellular form was able to rescue Notch activation in the absence of endogenous galectin-3. In human gastric cancer, galectin-3 was positively correlated with the expression of Jagged1 whereas galectin1, another member of the galectin family, was positively correlated with DLL4. Furthermore, we studied the biological role of Notch regulation by galectin-3 in angiogenesis. We showed that, in endothelial cells, galectin-3 binds to and increases Jagged1 protein half-life promoting Jagged1/Notch over DLL4/Notch signaling in a VEGF independent way. Hypoxic conditions changed galectin-3 expression and the glycosylation status of endothelial cells, acting in concert to promote Jagged1/Notch activation and sprouting angiogenesis. Jagged1 overexpression in Lewis lung carcinoma accelerated tumor growth in vivo that was prevented in Lgals3-/- mice. Finally, we evaluated the role of galectin-3 in cancer cell resistance to therapy. We found that the expression of sialyl-Tn, a biosynthetic product of ST6GalNAc-I, was able to decrease cell surface galectin-3 and galectin-3-binding sites both in vitro and in vivo leading to an intracellular accumulation of this protein. Exogenously added galectin-3 was found to have no effect on cancer cell death but contributed to chemotherapy-induced apoptosis. Sialyl-Tn expressing cells were protected. In human gastric cancer samples, galectin-3 binding sites were negatively correlated with the expression of sialyl-Tn. This knowledge has direct implications for the development of strategies aimed at controlling tumor growth and angiogenesis and open novel perspectives to overcome tumor resistance to therapy

A galectina-3, um membro da família das proteínas de ligação a glicanas, tem sido objeto de intensa pesquisa nos últimos anos devido ao seu importante papel na biologia tumoral, como a proliferação, transformação, apoptose, angiogênese, adesão, invasão e metástase tumoral. As diferentes funções de galectina-3 nas células tumorais resultam das suas diversas localizações inter- e subcelulares que lhe permite interagir com diferentes proteínas. Esta tese teve como objetivo identificar um papel específico de galectina-3 na regulação da via de sinalização Notch, que cada vez mais tem sido associada com a progressão tumoral e angiogênese. Inicialmente, demonstramos que galectina-3 interage com o receptor Notch-1 e modula diferencialmente a ativação da via pelos ligantes DLL4 e Jagged1. A galectin-3 regulou a expressão dos ligantes de Notch assim como o receptor Notch-1 e extracelularmente recuperou a ativação de Notch na ausência de galectina-3 endógena. Em câncer gástrico humano, a galectina-3 encontrou-se positivamente correlacionada com a expressão de Jagged1, enquanto que a galectina-1, um outro membro da família das galectinas, foi positivamente correlacionado com DLL4. De seguida estudou-se o papel biológico da regulação da via Notch pela galectina-3 na angiogênese. Demonstramos que nas células endoteliais, galectina-3 liga e aumenta a meia vida de Jagged1 promovendo a ativação preferencial da Jagged1/Notch em vez de DLL4/Notch de uma forma independente de VEGF. Verificamos que condições de hipóxia alteraram a expressão de galectina-3 assim como o status de glicosilação das células endoteliais de forma a promover a ativação de Jagged1/Notch e o aumento de angiogênese. A superexpressão de Jagged1 num modelo de carcinoma de pulmão de Lewis, acelerou o crescimento tumoral in vivo que foi inibido em camundongos Lgals3-/-. Por fim, avaliou-se o papel de galectina-3 na resistência das células tumorais a quimioterápicos. Observamos que a expressão de sialil-Tn, um produto biossintético da ST6GalNAc-I, diminuiu in vitro como in vivo a presença e os sítios de ligação de galectina-3 na superfície da células levando à sua acumulação no meio intracelular. Extracelularmente, galectina-3 não levou à indução de morte celular, no entanto contribuiu para a morte induzida por quimioterápicos. As células expressando sialil-Tn encontraram-se protegidas. Em amostras de tumor gástrico, os sítios de ligação de galectina-3 encontraram-se negativamente correlacionados com a expressão de sialil-Tn. Este conhecimento possui implicações diretas no desenvolvimento de estratégias visando o controle do crescimento tumoral e angiogênese e abre novas perspectivas no combate à resistência tumoral à terapia / Galectin-3, a member of a family of glycan binding proteins has been the subject of an intense research over the past few years due to its important role in cancer biology, such as cancer cell growth, transformation, apoptosis, angiogenesis, adhesion, invasion and metastasis. The different roles of galectin-3 on cancer cells behavior appears to have originated from its diverse inter- and subcellular localizations where it interacts with several different binding partners. The aim of this thesis was to pinpoint a specific role for galectin-3 in regulating Notch signaling pathway in cancer. Notch signaling has emerged as an important pathway in carcinogenesis, and activated Notch-1 signaling has being associated with cancer progression and angiogenesis. Initially, we found that galectin-3 was able to interact with Notch-1 receptor and to differentially modulate Notch signaling activation by DLL4 and Jagged1 ligands. Galectin-3 was found to regulate the expression of the Notch ligands and Notch-1 receptor and its extracellular form was able to rescue Notch activation in the absence of endogenous galectin-3. In human gastric cancer, galectin-3 was positively correlated with the expression of Jagged1 whereas galectin1, another member of the galectin family, was positively correlated with DLL4. Furthermore, we studied the biological role of Notch regulation by galectin-3 in angiogenesis. We showed that, in endothelial cells, galectin-3 binds to and increases Jagged1 protein half-life promoting Jagged1/Notch over DLL4/Notch signaling in a VEGF independent way. Hypoxic conditions changed galectin-3 expression and the glycosylation status of endothelial cells, acting in concert to promote Jagged1/Notch activation and sprouting angiogenesis. Jagged1 overexpression in Lewis lung carcinoma accelerated tumor growth in vivo that was prevented in Lgals3-/- mice. Finally, we evaluated the role of galectin-3 in cancer cell resistance to therapy. We found that the expression of sialyl-Tn, a biosynthetic product of ST6GalNAc-I, was able to decrease cell surface galectin-3 and galectin-3-binding sites both in vitro and in vivo leading to an intracellular accumulation of this protein. Exogenously added galectin-3 was found to have no effect on cancer cell death but contributed to chemotherapy-induced apoptosis. Sialyl-Tn expressing cells were protected. In human gastric cancer samples, galectin-3 binding sites were negatively correlated with the expression of sialyl-Tn. This knowledge has direct implications for the development of strategies aimed at controlling tumor growth and angiogenesis and open novel perspectives to overcome tumor resistance to therapy

Piptadenia stipulacea belongs to the Fabaceae family,and is widely distributed in the caatinga. This species is commonly known in the Brazilian Northeast as jurema-branca , carcará and rasga-beiço , and is used in folk medicine in inflammation.In this study, we attempted to identify the possible antinociceptive and anti-inflammatory activities of the aqueous phase, the ethyl acetate phase and one flavonoid obtained from aerial parts of Piptadenia stipulacea. Aerial parts of Piptadenia stipulaceawere used and after fractionation, the flavonoid Galetin 3,6-dimethyl ether(FGAL) was obtained of the chloroformic phase of this plant. Experiments were conducted on Swiss mice using the acetic acid-induced writhing test, the hot plate test, the formalin test and zymosan A-induced peritonitis test. To characterize the mechanism(s) responsible for these antinociceptive and anti-inflammatory actions of FGAL, COX inhibitor screening assay kit and test of DPPH was used. The aqueous and ethyl acetate phases (100 mg/kg, p.o.); and the flavonoid FGAL (100 μmol/kg, p.o. or i.p.), reduced the nociception produced by acetic acid, by 49,9 ± 11,2, 54,6 ± 5,3, 39,0 ± 6,8 and64,8% ± 8,1, respectively. As FGAL have greater antinociceptive activity when administered intraperitoneally compared to oral route, we chose this route you follow up the study with FGAL. The ethyl acetate phase (100 mg/kg, p.o.) reduced nociception in the hot plate, indicating that this fraction exhibited central activity. The ethyl acetate phase (100 mg/kg, p.o.) reduced the formalin effects in both phases by 40,2± 10,3 and59,9% ± 6,5, respectively. Treatment with the aqueous phase (100 mg/kg, p.o.) and FGAL (100_mol/kg, i.p.) only protected the second phase by 78,5± 5,5 and 64,0% ± 8,0, respectively. In addition, it was observed in the zymosan A-induced peritonitis test that the aqueous phase, the ethyl acetate phase and FGAL exhibited anti-inflammatory activity, reducing significantly the number of recruit cells by 35,8 ± 4,9, 37,7 ± 6,2 and 31,3% ± 13,3, respectively. Moreover, FGAL at 0,2μM was able to inhibit COX-1 (79,5% ± 0,6) and COX-2 (56,0% ± 3,8), with an inhibition profile similar to indomethacin in the same concentration (93.0 ±2.6and79.0±1.5%, respectively), showinginhibitionofCOX-1 in greaterproportionthanCOX-2. Furthermore, indomethacin was more effective, both COX-1 andCOX-2 when compared to FGAL. In the test of DPPH, FGAL showed high radical scavenging activity. These results infer that the aqueous phase, the ethyl acetate phase and FGAL obtained from aerial parts of Piptadeniastipulacea are able to modulate the peripheral nociception and acute inflammatory response. TheflavonoidFGALinhibitCOX-1 andCOX-2, probably for its ability to scavenge free radicals, this being one of its mechanism of action in nociception and inflammation. Moreover, the results corroborate the popular use of Piptadenia stipulacea by their anti-inflammatory property. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Piptadenia stipulacea,pertence à família Fabaceae, é amplamente distribuída na caatinga. Esta espécie é conhecida no Nordeste brasileiro como jurema-branca, carcará e rasga-beiço, sendo utilizada na medicina popular para tratar inflamação. Neste trabalho, buscou-se investigar a atividade antinociceptiva e anti-inflamatória da fase aquosa, fase acetato de etila e de um flavonoide isolado das partes aéreas de Piptadenia stipulacea. As partes aéreas de Piptadenia stipulacea foram usadas para o fracionamento e, posteriormente o flavonóide galetina 3,6-dimetil éter(FGAL)foi obtido da fase clorofórmica da planta. Experimentos foram realizados em camundongos Swiss usando o modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético, ensaio da placa quente, teste de formalina e peritonite induzida por zymosan A. Para caracterizar o mecanismo de ação de FGAL responsável por sua ação antinociceptiva, o ensaio de inibição de cicloxigenase (COX) in vitro e a análise da atividade sequestrante radicalar através do método fotocolorimétrico de consumo de 2,2-difenil-1-picrihidrazila(DPPH) foram utilizados. As fases aquosa e acetato de etila(100 mg/kg, v.o.); e o flavonoide FGAL (100 μmol/kg, v.o. ou i.p.) reduziram a nocicepção produzida por ácido acético, na proporção de 49,9 ± 11,2, 54,6 ± 5,3, 39,0 ± 6,8 e 64,8% ± 8,1, respectivamente.Por FGAL apresentar maior atividade antinociceptiva ao ser administrado pela via intraperitoneal quando comparado com a via oral, escolheu-se essa via para dar sequência ao estudo com FGAL. Posteriormente, verificou-se também a inibição da nocicepção no ensaio de placa quente através do tratamento com a fase acetato de etila (v.o., 100 mg/kg), indicando que esta fase apresenta atividade central. A fase acetato de etila (v.o., 100 mg/kg) reduziu a nocicepção gerada pela aplicação de formalina em ambas as fases do teste, apresentando porcentagem de inibição de 40,2 ± 10,3e 59,9% ± 6,5, respectivamente. O tratamento com a fase aquosa (100 mg/kg, v.o.) e FGAL (100 μmol/kg, i.p.) apenas se mostraram ativos na segunda fase do teste de formalina na proporção de 72,6± 5,5 e 66,0% ± 8,0, respectivamente. Além disso, as fases aquosa (100 mg/kg, v.o.), acetato deetila (100 mg/kg, v.o.) e FGAL (100 μmol/kg, i.p.) tambémapresentaram efeito anti-inflamatório significante quando comparadas ao grupo controle, apresentando porcentagem de inibição de recrutamento celular na peritonite induzida por zymosan A de 35,8 ± 4,9, 37,7 ± 6,2 e 31,3% ± 13,3, respectivamente.FGAL, na concentração de 0,2 μM inibiu COX-1 (79,5% ± 0,6) e COX-2 (56,0% ± 3,8), com um perfil de inibição similar ao observado para indometacina na mesma concentração (93,0 ± 2,6 e 79,0% ± 1,5, respectivamente), apresentando inibição de COX-1 em maior proporção do que COX-2. Além disso, indometacina inibiu de forma mais eficaz, tanto COX-1 como COX-2 quando comparado a FGAL. No teste de2,2-difenil-1-picriidrazila(DPPH), FGAL, na concentração de 0,3 mM, mostrou alta atividade sequestrante radicalar. Estes resultados inferem que a fase aquosa, a fase acetato e FGAL obtidos das partes aéreas de Piptadenia stipulacea são capazes de modular a antinocicepção e a resposta inflamatória aguda.O flavonoide FGAL inibe COX-1 e COX-2, provavelmente por sua capacidade de sequestrar radicais livres, sendo este um dos seus mecanismos de ação na nocicepção e inflamação. Além disso, os resultados encontrados corroboram com o uso popular de Piptadenia stipulacea por suas propriedade anti-inflamatória.