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Impactos das biotécnicas reprodutivas no controle epigenético de genes imprinted / Impact of reproductive biotechniques on the epigenetic regulation of imprinted genesMartucci, Mariane Ferracin 14 August 2015 (has links)
Técnicas de reprodução assistida (TRAs) são utilizadas tanto na medicina humana quanto na medicina veterinária com o objetivo principal de corrigir infertilidades adquiridas ou herdadas. A transferência nuclear de célula somática (TNCS) ocupa um lugar de destaque na veterinária pela possibilidade de geração de indivíduos geneticamente idênticos, permitindo a produção de rebanhos homogêneos de alto mérito genético e servindo como modelo de estudo para técnicas de reprogramação. Porém, a utilização de TRAs, e em especial da TNCS, é considerada responsável pelo aumento na geração de conceptos portadores de alterações durante e após o desenvolvimento embrionário e fetal. A provável causa principal é a alteração na regulação da reprogramação epigenética devido à manipulação de gametas e embriões no período inicial do desenvolvimento, levando a alterações na regulação epigenética de genes imprinted. O presente estudo teve como objetivo principal avaliar marcas epigenéticas e expressão de genes imprinted no desenvolvimento de conceptos bovinos produzidos por TNCS ou inseminação artificial (IA). Para tal, foram coletadas amostras de tecido muscular e membranas corioalantoideana e amniótica de animais na fase pré natal (fetal) e tecidos muscular, nervoso e hepático na fase pós natal (animais nascidos saudáveis adultos ou não) de animais derivados de IA ou TNCS. Foi analisada a expressão dos genes imprinted H19, IGF2, IGF2R e Airn quando possível, assim como a metilação do DNA no locus H19/IGF2 na fase pós natal. Foi observado que na fase pré natal não foi detectada expressão do IGF2, enquanto que a expressão de H19 é aumentada em relação ao IGF2R, porém, sem diferenças entre os grupos nos tecidos estudados. Na fase pós natal, o padrão de expressão dos genes IGF2, H19 e IGF2R indica diminuição da expressão gênica relativa no fígado de animais TNCS e no aumento da expressão gênica do H19 na musculatura de animais adultos (saudáveis) bovinos produzidos por TNCS, apesar de o padrão de metilação dos genes imprinted IGF2/H19 não ser diferente entre organismos considerados saudáveis e não saudáveis. Os resultados deste projeto contribuem para o entendimento dos mecanismos epigenéticos relacionados ao desenvolvimento embrionário e fetal, em especial aqueles relacionados à dinâmica das alterações epigenéticas envolvidas no imprinting genômico / Assisted reproductive technologies (ARTs) are usually used in both human and veterinary medicine aiming the correction of heritable or acquired infertilities. The somatic cell nuclear transfer technique (SCNT) is of particular importance in veterinary as it enables the generation of genetically identical organisms, allowing the production of homogeneous genetically improved herds, and also serving as a model for reprogramming studies. However, the use of TRAs, SCNT in special, may be responsible for the increase of developmental-related abnormalities in the conceptuses. Such phenotypes are probably caused by a disruption during the epigenetic reprogramming due to the manipulation of gametes and embryos during the early development period, and therefore leading to disturbances in the epigenetic regulation of imprinted genes. The present study aimed to evaluate epigenetic marks and expression of imprinted genes in different developmental periods of cattle generated by SCNT or artificial insemination (AI). For that, corionic/alantoic and amniotic membranes from fetuses and muscular, nervous and hepatic tissues from born animals, healthy (adult) or not, produced by SCNT or AI were collected. The expression of the imprinted genes H19, IGF2, IGF2R and Airn was analyzed as well as the DNA methylation at locus H19/IGF2 in post-natal period. It was observed that IGF2 was not detected during pre-natal period, whereas H19 expression is increased when compared to IGF2R in the groups studied herein. At post-natal period the IGF2, H19 and IGF2R expression patterns infers the decrease of relative gene expression in the liver and the increase of H19 expression in the muscle of SCNT adult animals. The methylation pattern of IGF2/H19 locus, however, did not differ between healthy or not animals. The results described herein may contribute to the understanding of the epigenetic mechanisms related to embryonic and fetal development, and in special, to those related to the epigenetic dynamics during genomic imprinting
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Impactos das biotécnicas reprodutivas no controle epigenético de genes imprinted / Impact of reproductive biotechniques on the epigenetic regulation of imprinted genesMariane Ferracin Martucci 14 August 2015 (has links)
Técnicas de reprodução assistida (TRAs) são utilizadas tanto na medicina humana quanto na medicina veterinária com o objetivo principal de corrigir infertilidades adquiridas ou herdadas. A transferência nuclear de célula somática (TNCS) ocupa um lugar de destaque na veterinária pela possibilidade de geração de indivíduos geneticamente idênticos, permitindo a produção de rebanhos homogêneos de alto mérito genético e servindo como modelo de estudo para técnicas de reprogramação. Porém, a utilização de TRAs, e em especial da TNCS, é considerada responsável pelo aumento na geração de conceptos portadores de alterações durante e após o desenvolvimento embrionário e fetal. A provável causa principal é a alteração na regulação da reprogramação epigenética devido à manipulação de gametas e embriões no período inicial do desenvolvimento, levando a alterações na regulação epigenética de genes imprinted. O presente estudo teve como objetivo principal avaliar marcas epigenéticas e expressão de genes imprinted no desenvolvimento de conceptos bovinos produzidos por TNCS ou inseminação artificial (IA). Para tal, foram coletadas amostras de tecido muscular e membranas corioalantoideana e amniótica de animais na fase pré natal (fetal) e tecidos muscular, nervoso e hepático na fase pós natal (animais nascidos saudáveis adultos ou não) de animais derivados de IA ou TNCS. Foi analisada a expressão dos genes imprinted H19, IGF2, IGF2R e Airn quando possível, assim como a metilação do DNA no locus H19/IGF2 na fase pós natal. Foi observado que na fase pré natal não foi detectada expressão do IGF2, enquanto que a expressão de H19 é aumentada em relação ao IGF2R, porém, sem diferenças entre os grupos nos tecidos estudados. Na fase pós natal, o padrão de expressão dos genes IGF2, H19 e IGF2R indica diminuição da expressão gênica relativa no fígado de animais TNCS e no aumento da expressão gênica do H19 na musculatura de animais adultos (saudáveis) bovinos produzidos por TNCS, apesar de o padrão de metilação dos genes imprinted IGF2/H19 não ser diferente entre organismos considerados saudáveis e não saudáveis. Os resultados deste projeto contribuem para o entendimento dos mecanismos epigenéticos relacionados ao desenvolvimento embrionário e fetal, em especial aqueles relacionados à dinâmica das alterações epigenéticas envolvidas no imprinting genômico / Assisted reproductive technologies (ARTs) are usually used in both human and veterinary medicine aiming the correction of heritable or acquired infertilities. The somatic cell nuclear transfer technique (SCNT) is of particular importance in veterinary as it enables the generation of genetically identical organisms, allowing the production of homogeneous genetically improved herds, and also serving as a model for reprogramming studies. However, the use of TRAs, SCNT in special, may be responsible for the increase of developmental-related abnormalities in the conceptuses. Such phenotypes are probably caused by a disruption during the epigenetic reprogramming due to the manipulation of gametes and embryos during the early development period, and therefore leading to disturbances in the epigenetic regulation of imprinted genes. The present study aimed to evaluate epigenetic marks and expression of imprinted genes in different developmental periods of cattle generated by SCNT or artificial insemination (AI). For that, corionic/alantoic and amniotic membranes from fetuses and muscular, nervous and hepatic tissues from born animals, healthy (adult) or not, produced by SCNT or AI were collected. The expression of the imprinted genes H19, IGF2, IGF2R and Airn was analyzed as well as the DNA methylation at locus H19/IGF2 in post-natal period. It was observed that IGF2 was not detected during pre-natal period, whereas H19 expression is increased when compared to IGF2R in the groups studied herein. At post-natal period the IGF2, H19 and IGF2R expression patterns infers the decrease of relative gene expression in the liver and the increase of H19 expression in the muscle of SCNT adult animals. The methylation pattern of IGF2/H19 locus, however, did not differ between healthy or not animals. The results described herein may contribute to the understanding of the epigenetic mechanisms related to embryonic and fetal development, and in special, to those related to the epigenetic dynamics during genomic imprinting
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Identificação in-silico de genes humanos submetidos à expressão alélica diferencial / In-silico identification of human genes submitted to allelic differential expressionSouza, Jorge Estefano Santana de 02 December 2008 (has links)
Estudos recentes demonstraram que a variação de expressão alelo-específica é mais comum do que se imaginou, podendo chegar, em humanos, a 50% dos genes. Identificar os genes submetidos ao controle de expressão alelo-específica é muito importante para o entendimento de várias doenças, incluindo o câncer. A identificação dos alvos desse tipo de regulação diferencial é difícil, principalmente devido à dificuldade de se avaliar a expressão de cada alelo individualmente. Neste trabalho, abordamos este problema com uma estratégia de análise in-silico, fundamentada na integração de dados públicos do genoma humano, dados de expressão (como cDNAs, SAGE e MPSS) e dados sobre polimorfismos (SNPs). Desenvolvemos um banco de dados de polimorfismos de base única (Single-Nucleotide Polymorphism - SNPs) associados a etiquetas alternativas de SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) e MPSS (massively parallel signature sequencing). SAGE e MPSS são técnicas desenvolvidas para análise da expressão de genes em larga escala. Ambas as técnicas têm como princípio a produção de pequenas seqüências marcadoras (etiquetas), adjacentes aos sítios de enzimas de restrição que estiverem mais próximo da cauda poli-A do RNA mensageiro. Tais etiquetas são seqüenciadas em grande escala e a quantidade de etiquetas é usada para medir a abundância relativa dos RNAs mensageiros correspondentes. A presença de SNPs nos sítios de restrição ou nas seqüências das etiquetas pode gerar etiquetas distintas para alelos do mesmo gene, que denominamos etiquetas alternativas. Neste trabalho, empregamos o banco de dados de etiquetas alternativas associadas a SNPs para identificar genes com expressão alélica diferencial. Usando esta estratégia, identificamos 812 genes com expressão monoalélica, Estudos anteriores comprovaram que, dentre os 812 genes identificados, cinco estão sujeitos ao fenômeno de imprinting genômico. Durante o decorrer deste estudo, trabalhos realizados por outros grupos apontaram outros 73 genes do nosso repertório como genes que apresentam variação no nível de expressão dos alelos em heterozigotos. Com objetivo de confirmar a expressão alélica diferencial dos nossos candidatos, selecionamos 29 genes para validação experimental. Para 12 destes genes não achamos indivíduos heterozigotos, impossibilitando a análise da expressão dos alelos. Dentre os outros 17 genes, três apresentaram expressão bialélica e 14 apresentaram expressão alélica diferencial nos indivíduos heterozigotos, sendo que 3 deles apresentaram expressão monoalélica. Estes resultados sugerem que nossa estratégia pode contribuir significativamente na identificação de genes com expressão alélica diferencial. / Recent studies have shown that variation of allelic-specific gene expression is more common than previously thought, reaching up to 50% of human genes. To identify genes displaying differential expression among alleles it is important for the understanding of several diseases, including the cancer. Identification of genes submitted to allelic-specific differential expression is hard, mostly due to the difficulty in evaluating the expression levels of each allele independently. In this work, we developed an in-silico approach, based on the integration of public data about the human genome, gene expression data (such as cDNAs, SNPs, SAGE and MPSS) and data on polymorphisms (SNPs). We developed a database of Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) associated to alternative SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) and MPSS (Massively Parallel Signature Sequencing) tags. SAGE and MPSS are genome-wide techniques developed for analysis of gene expression. Both techniques rely on the production of short marker sequences (known as tags), adjacent to restriction sites closer to the poly-A tail of messenger RNAs. Such tags are sequenced in a large scale and tag counts are used to measure the relative abundance of their corresponding transcripts. The presence of SNPs in the restriction sites or in the tag sequences might generate allelic-specific tags for the same gene, which we call alternative tags. In this work, we used the database of SNPs and associated alternative tags to identify genes submitted to allelic-specific differential gene expression. Using this approach, we identified 812 genes showing allelic-specific differential gene expression. Previous studies have shown that, among the 812 candidates, five genes are targets for genomic imprinting. While this study was being performed, work done by other groups suggested other 73 genes in our candidates list to have different expression levels for alleles in heterozygous. Aiming to verify whether variations in the expression levels of alleles existed among our candidate genes, we submitted 29 genes for experimental validation. For 12 genes, we couldnt find heterozygous individuals, thus rendering it impossible to ascertain whether the supposed expression variation was true. Among the other 17 genes analyzed, three genes presented bi-allelic expression and 14 genes have shown clear differential expression among alleles, three of the last ones displaying strict mono-allelic expression. These results suggest that our approach may contribute significantly to the identification of genes with allelic-specific differential expression.
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Identificação in-silico de genes humanos submetidos à expressão alélica diferencial / In-silico identification of human genes submitted to allelic differential expressionJorge Estefano Santana de Souza 02 December 2008 (has links)
Estudos recentes demonstraram que a variação de expressão alelo-específica é mais comum do que se imaginou, podendo chegar, em humanos, a 50% dos genes. Identificar os genes submetidos ao controle de expressão alelo-específica é muito importante para o entendimento de várias doenças, incluindo o câncer. A identificação dos alvos desse tipo de regulação diferencial é difícil, principalmente devido à dificuldade de se avaliar a expressão de cada alelo individualmente. Neste trabalho, abordamos este problema com uma estratégia de análise in-silico, fundamentada na integração de dados públicos do genoma humano, dados de expressão (como cDNAs, SAGE e MPSS) e dados sobre polimorfismos (SNPs). Desenvolvemos um banco de dados de polimorfismos de base única (Single-Nucleotide Polymorphism - SNPs) associados a etiquetas alternativas de SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) e MPSS (massively parallel signature sequencing). SAGE e MPSS são técnicas desenvolvidas para análise da expressão de genes em larga escala. Ambas as técnicas têm como princípio a produção de pequenas seqüências marcadoras (etiquetas), adjacentes aos sítios de enzimas de restrição que estiverem mais próximo da cauda poli-A do RNA mensageiro. Tais etiquetas são seqüenciadas em grande escala e a quantidade de etiquetas é usada para medir a abundância relativa dos RNAs mensageiros correspondentes. A presença de SNPs nos sítios de restrição ou nas seqüências das etiquetas pode gerar etiquetas distintas para alelos do mesmo gene, que denominamos etiquetas alternativas. Neste trabalho, empregamos o banco de dados de etiquetas alternativas associadas a SNPs para identificar genes com expressão alélica diferencial. Usando esta estratégia, identificamos 812 genes com expressão monoalélica, Estudos anteriores comprovaram que, dentre os 812 genes identificados, cinco estão sujeitos ao fenômeno de imprinting genômico. Durante o decorrer deste estudo, trabalhos realizados por outros grupos apontaram outros 73 genes do nosso repertório como genes que apresentam variação no nível de expressão dos alelos em heterozigotos. Com objetivo de confirmar a expressão alélica diferencial dos nossos candidatos, selecionamos 29 genes para validação experimental. Para 12 destes genes não achamos indivíduos heterozigotos, impossibilitando a análise da expressão dos alelos. Dentre os outros 17 genes, três apresentaram expressão bialélica e 14 apresentaram expressão alélica diferencial nos indivíduos heterozigotos, sendo que 3 deles apresentaram expressão monoalélica. Estes resultados sugerem que nossa estratégia pode contribuir significativamente na identificação de genes com expressão alélica diferencial. / Recent studies have shown that variation of allelic-specific gene expression is more common than previously thought, reaching up to 50% of human genes. To identify genes displaying differential expression among alleles it is important for the understanding of several diseases, including the cancer. Identification of genes submitted to allelic-specific differential expression is hard, mostly due to the difficulty in evaluating the expression levels of each allele independently. In this work, we developed an in-silico approach, based on the integration of public data about the human genome, gene expression data (such as cDNAs, SNPs, SAGE and MPSS) and data on polymorphisms (SNPs). We developed a database of Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) associated to alternative SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) and MPSS (Massively Parallel Signature Sequencing) tags. SAGE and MPSS are genome-wide techniques developed for analysis of gene expression. Both techniques rely on the production of short marker sequences (known as tags), adjacent to restriction sites closer to the poly-A tail of messenger RNAs. Such tags are sequenced in a large scale and tag counts are used to measure the relative abundance of their corresponding transcripts. The presence of SNPs in the restriction sites or in the tag sequences might generate allelic-specific tags for the same gene, which we call alternative tags. In this work, we used the database of SNPs and associated alternative tags to identify genes submitted to allelic-specific differential gene expression. Using this approach, we identified 812 genes showing allelic-specific differential gene expression. Previous studies have shown that, among the 812 candidates, five genes are targets for genomic imprinting. While this study was being performed, work done by other groups suggested other 73 genes in our candidates list to have different expression levels for alleles in heterozygous. Aiming to verify whether variations in the expression levels of alleles existed among our candidate genes, we submitted 29 genes for experimental validation. For 12 genes, we couldnt find heterozygous individuals, thus rendering it impossible to ascertain whether the supposed expression variation was true. Among the other 17 genes analyzed, three genes presented bi-allelic expression and 14 genes have shown clear differential expression among alleles, three of the last ones displaying strict mono-allelic expression. These results suggest that our approach may contribute significantly to the identification of genes with allelic-specific differential expression.
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