Proefschrift Universiteit van Amsterdam. / Met samenvatting in het Nederlands.

Proefschrift Universiteit van Amsterdam. / Met lit.opg. en samenvatting in het Nederlands.

Proefschrift Universiteit van Amsterdam. / Met lit.opg. en een samenvatting in het Nederlands.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2013-11-04T12:15:31Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado Felipe Leprevost.pdf: 8130365 bytes, checksum: 2af7aa9ac89832c8e4c552a4d889c5e9 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-04T12:15:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado Felipe Leprevost.pdf: 8130365 bytes, checksum: 2af7aa9ac89832c8e4c552a4d889c5e9 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Atualmente novas abordagens e metodologias de pesquisa nos permitem iniciar projetos de caracterização de um conjunto de proteínas de um determinado organismo em escalas superiores aos realizados há algum tempo. Novas tecnologias para seqüenciamento, clonagem e expressão protéica permitem a geração de uma quantidade grande de novas informações numa fração de tempo relativamente curta. Organismos como o Trypanosoma cruzi, que possuem praticamente metade de seu genoma sem função conhecida, necessitam que estudos sejam realizados para que se consiga atribuir às proteínas de função desconhecida características funcionais. Em um esforço para se conhecer melhor os genes de função desconhecida deste parasita, um grupo de 10 genes foi selecionado com base na sua expressão diferencial durante a metaciclogênese, consistindo de genes anotados como ‘proteína hipotética’ em banco de dados públicos, com domínio identificado pelo banco de famílias protéicas PFAM e com ortólogos em outros organismos. Os 10 genes selecionados foram amplificados e clonados na plataforma de clonagem Gateway e as proteínas recombinantes foram expressas em Escherichia coli. Dos 10 genes destinados à expressão protéica, 8 expressaram proteínas insolúveis as quais foram utilizadas para obtenção de soro policlonal. Os soros obtidos foram utilizados em ensaios de Western Blot para averiguação da expressão protéica ao longo da metaciclogênese do parasita e ensaios de localização celular por microscopia ótica e eletrônica. Foram realizados também ensaios de transfecção em T. cruzi para a expressão das proteínas fusionadas com GFP, visando à determinação da localização celular, utilizando um vetor compatível com a plataforma Gateway, e foram realizados ensaios de imunoprecipitação para todas as 8 proteínas expressas. Os resultados obtidos no presente trabalho auxiliam na atribuição de informações experimentais a genes e proteínas anotados como ‘proteína hipotética de função desconhecida’ e avaliam a possibilidade de implementação de um estudo sistemático com este para uma aplicação em média/larga escala / Recent research approaches and methodologies allow us to develop projects for the characterization of proteins of a given organism in scales greater than possible some time ago. New technologies for sequencing, cloning and protein expression allow the generation of large amounts of new information in relatively short time. Organisms such as Trypanosoma cruzi, which have nearly half of its genome with no known function, require studies to assign functions to proteins of unknown function. In an effort to characterize the genes of unknown function of this parasite, a group of 10 genes was selected based on their differential expression during metacyclogenesis. The genes were annotated as 'hypothetical protein' in public databases, with domains identified in the PFAM database and with orthologs in other organisms. The 10 selected genes were amplified and cloned in Gateway cloning platform and the recombinant proteins were expressed in Escherichia coli. Eight of the 10 genes expressed insoluble proteins which were used to obtain polyclonal serum. The sera were used in Western Blot analysis to verify protein expression throughout the parasite metacyclogenesis as well as cellular localization by optical and electron microscopy. To determine cellular localization, transfection experiments were conducted in T. cruzi for the expression of proteins fused with GFP using a vector compatible with the Gateway platform. Immunoprecipitation assays were also performed for the 8 expressed proteins. The results obtained in this work uncover experimental information of genes annotated as 'hypothetical protein of unknown function' and assess the possibility of implementing a systematic approach with this methodology in medium to large scale

Orientador: Marcio Ajudarte Lopes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-15T17:55:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos-Silva_AlanRoger_D.pdf: 1071923 bytes, checksum: 996d56a5e4895653ebcd0b9e1636e7e2 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Predominantemente, o carcinoma espinocelular (CEC) de boca afeta pacientes idosos e com frequência se desenvolve em associação com o consumo de fumo e álcool. Todavia, evidências científicas têm sugerido o aumento da incidência desta malignidade em pacientes com menos de 40 anos de idade e não expostos aos tradicionais fatores de risco. Informações disponíveis referentes ao câncer de boca em pacientes jovens são escassas e controversas, dificultando a compreensão da patogênese, do comportamento biológico e do prognóstico destes tumores. Como consequência, seu tratamento tem sido baseado principalmente na experiência profissional de cada centro médico. Este trabalho teve como objetivos estudar as características demográficas, os fatores de risco e os aspectos clínicos no momento do diagnóstico, além do perfil biológico de CECs de língua em pacientes com até 40 anos. Foi realizada uma análise retrospectiva multiinstitucional a fim de se investigar gênero, cor da pele, consumo de tabaco e álcool, tamanho dos tumores, metástase regional e à distância, diferenciação histológica e ploidia do DNA dos tumores por meio de citometria por imagem. Os resultados mostraram que tumores em pacientes jovens foram frequentemente detectados em mulheres e pacientes não fumantes e não etilistas, enquanto em pacientes idosos foram detectados, predominantemente, em homens fumantes e etilistas. Além disso, constatou-se que CECs de língua em jovens não se distinguem quanto ao tamanho, a metástases regionais ou à distância e nem quanto ao grau de diferenciação histológica quando comparados com idosos. Ressalta-se, entretanto, que tumores em jovens apresentaram maiores incidências de aneuploidia, tetraploidia e de outros parâmetros de anormalidades da ploidia do DNA. Concluindo, pacientes jovens com CEC de língua apresentaram perfil clínico e biológico peculiares, favorecendo a hipótese de que pacientes jovens com CEC de boca possuem instabilidade genômica aumentada e indicando uma possível natureza genética diferente entre os CECs de língua de jovens e de idosos / Abstract: Oral squamous cell carcinoma (SCC) predominately affects elderly patients and frequently develops in association with tobacco and alcohol consumption. However, an increasing of this malignant disease has been observed in patients younger than 40 years of age, who are not exposed to the traditional risk factors. Data regarding oral cancer in young patients are scarce and controversial, making the determination of the pathogenesis, biological behaviour and prognosis of these tumours difficult. As a consequence, treatment has been mainly based on the professional experience of each medical centre. The aims of this work were to study demographic features, risk factors and clinical aspects at the moment of diagnosis as well as the biologic profile of patients of less than 40 years of age with tongue SCC. A multi-centre retrospective analysis was performed to investigate gender, race, tobacco consumption and alcohol intake, size of the tumour, regional and distant metastasis, histological differentiation and DNA ploidy of tumours through image cytometry. Tumours in young patients were frequently detected in females and nonsmoking and non-drinking patients while older patients were predominantly smoking and drinking males. In addition, tongue SCC in young patients did not differ in size, regional and distant metastasis or tumour grade of differentiation when compared to those in older patients. This study highlighted that tumours from young patients presented higher incidences of aneuploidy, tetraploidy and other parameters related to DNA ploidy abnormalities. In conclusion, young patients with tongue SCC presented a distinct clinical and biological profile, favouring the hypothesis that young patients with oral SCC may have an increased genomic instability and indicating the possibility of underlying genetic differences between TSCC in young and older patients / Doutorado / Patologia / Doutor em Estomatopatologia

Lo sviluppo delle tecnologie di sequenziamento ha portato alla nascita di strumenti in grado di produrre gigabasi di dati di sequenziamento in una singola corsa. Queste tecnologie, comunemente indicate come Next Generation Sequencing o NGS, producono grandi e complessi dataset la cui analisi comporta diversi problemi a livello bioinformatico. L'analisi di questo tipo di dati richiede la messa a punto di pipelines computazionali il cui sviluppo richiede un lavoro di scripting necessario per concatenare i softwares già esistenti. Questa tesi tratta l'aspetto metodologico dell'analisi di dati NGS ottenuti con tecnologia Illumina. In particolare in essa sono state sviluppate tre pipelines bioinformatiche applicate ai seguenti casi studio: 1) uno studio di espressione genica mediante RNA-seq in "Olea europaea" finalizzato all’indagine dei meccanismi molecolari alla base dell’acclimatazione al freddo in questa specie; 2) uno studio mediante RNA-seq finalizzato all’identificazione dei polimorfismi di sequenza nel trascrittoma di due razze bovine mirato a produrre un ampio catalogo di marcatori di tipo SNPs; 3) il sequenziamento, l’assemblaggio e l’annotazione del genoma di un ceppo di Lactobacillus plantarum che mostrava potenziali proprietà probiotiche. / The advance in sequencing technologies has led to the birth of sequencing platforms able to produce gigabases of sequencing data in a single run. These technologies commonly referred to as Next Generation Sequencing or NGS produce millions of short sequences called “reads” generating large and complex datasets that pose several challenges for Bioinformatics. The analysis of large omics dataset require the development of bioinformatics pipelines that are the organization of the bioinformatics tools in computational chains in which the output of one analysis is the input of the subsequent analysis. A work of scripting is needed to chain together a group of existing software tools.This thesis deals with the methodological aspect of the data analysis in NGS sequencing performed with the Illumina technology. In this thesis three bioinformatics pipelines were developed.to the following cases of study: 1) a global transcriptome profiling of “Oleaeuropeae” during cold acclimation, aimed to unravel the molecular mechanisms of cold acclimation in this species; 2) a SNPs profiling in the transcriptome of two cattle breeds aimed to produce an extensive catalogue of SNPs; 3) the genome sequencing, the assembly and annotation of the genome of a Lactobacillus plantarum strain showing probiotic properties.

El descubrimiento de las duplicaciones segmentarias (DS) o Low Copy Repeats (LCRs) ha permitido definir nuevos mecanismos evolutivos mediados, en gran parte, por duplicación génica. Las DS son responsables de reordenamientos que pueden ser submicróscopicos dando lugar a pequeñas pérdidas o ganancias de material genómico. La elucidación sobre su implicación y relación en enfermedades humanas ha generado la necesidad de crear nuevos instrumentos de medida que permitan rastrear el genoma humano a una mayor resolución que la conseguida mediante cariotipo normal. Una de estas nuevas técnicas se denomina matrices aCGH. En esta tesis doctoral se han desarrollado métodos que permiten la optimización de la técnica durante el proceso de fabricación e hibridación y que, a su vez, pueden ser aplicados sobre los métodos actuales de detección de CNVs incrementando su sensibilidad y especificidad. Además se ha realizado una comparación entre plataformas aCGH así como un análisis transcriptómico global de muestras alteradas, tomando como modelo de estudio el síndrome de Williams-Beuren que está caracterizado por una deleción parcial en la banda 7q11.23. A parte de ganancias y pérdidas de fragmentos de material génico, las DSs pueden generar copias de genes que pueden acumular cambios respecto el original (PSVs). Algunos de estas PSVs ya se han identificado como patogénicas por ello es de gran utilidad su estudio.

L'agricoltura moderna sta affrontando sfide come la perdita di fertilità del suolo, la variabilità climatica e gli attacchi di agenti patogeni in continuo aumento. Le pratiche agricole si stanno evolvendo verso sistemi sostenibili e rispettosi dell'ambiente. L'uso di biostimolanti (PBS, plant biostimulant) è una soluzione innovativa per affrontare le sfide di un’agricoltura sostenibile che garantisce un assorbimento ottimale dei nutrienti, una resa delle colture e tolleranza agli stress abiotici. In particolare, tra i diversi tipi di biostimolanti presenti sul mercato, i rizobatteri, classificati come Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR), offrono un nuovo approccio per promuovere la crescita delle piante, la mitigazione degli stress e l’aumento della resa colturale. Pertanto i PGPR sono considerati come una sorta di "probiotici" vegetali, poiché contribuiscono in modo efficiente alla nutrizione e all'immunità delle piante. L'obiettivo principale di questa tesi è isolare e identificare batteri presenti nella rizosfera di pomodoro (Solanum lycopersicum L.) che mostrano proprietà PBS, nonché valutare i meccanismi coinvolti nell'azione di promozione della crescita delle piante (Capitolo 2) e la genetica alla base di questi meccanismi (Capitolo 3 e 4). Infatti, una profonda comprensione dei meccanismi d’azione dei PGPR potrebbe colmare la mancanza di coerenza del dato di efficacia tra gli studi di laboratorio e gli studi in campo e stimolare la ricerca per la produzione e la commercializzazione di nuovi prodotti biostimolanti microbici. / Modern agriculture faces challenges such as loss of soil fertility, fluctuating climatic factors and increasing pathogen and pest attacks. Agricultural practices have been evolving towards organic, sustainable and environmentally friendly systems. The use of natural plant biostimulants (PBS) is an innovative solution to address the challenges in sustainable agriculture, to ensure optimal nutrient uptake, crop yield, quality and tolerance to abiotic stress. In particular, among different types of biostimulants present on the market, plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) offer a novel approach for promoting plant growth, mitigate stress and increase crop yield. Hence, PGPR inoculants are now considered as a kind of plant ‘probiotics’, since they efficiently contribute to plant nutrition and immunity. The main goal of this thesis was to isolate and identify bacteria symbionts of tomato (Solanum lycopersicum L.) rhizosphere, which showed PBS properties and evaluate mechanism involved in the action of PGPR (Chapter 2), underlying genetics and physiological pathways (Chapter 3 and 4). Indeed, a deeply understanding of the mechanisms of plant growth promotion, could fulfill the lack of consistency between lab, greenhouse and field studies, and support commercialization of novel plant biostimulant products.

[pt] A área de pesquisa em Montagem de Genomas tem evoluído rapidamente, adaptando-se às novas tecnologias de sequenciamento e modernos ambientes computacionais. Existem diversos softwares montadores que usam múltiplas abordagens, porém persiste o questionamento sobre a qualidade da montagem ao final do processo. Assim que uma montagem é finalizada, muitas medidas de qualidade podem ser geradas, a fim de que a montagem seja qualificada. Todavia, essas medidas apenas fornecem aos biólogos valores quantitativos acerca da montagem. Nós propomos nesta pesquisa um framework de domínio para o processo de análise de medidas pós montagem de genomas. Nosso objetivo é de prover a interpretação dos dados e avaliação da qualidade das montagens a partir do Framework. O Genome Assembly Analysis Framework (GAAF) foi projetado para trabalhar com espécies, montadores e medidas distintas. Para validar nossa proposta, foram realizados testes com o GAAF que permitem entender como o mesmo pode ser utilizado e de que maneira ele pode ser instanciado e/ou estendido. / [en] The Genome Assembly research area has quickly evolved, adapting to new sequencing technologies and modern computational environments. There exist many assembler software that consider multiple approaches. However, at the end of the process, one can always question the quality of assemblies. When an assembly is accomplished, some quality features may be generated, in order to qualify it. Nonetheless, the features do not directly tell one about assembly quality, but only bring to the biologists quantitative assembly descriptions. We propose a Domain Framework for the feature analysis process post-genome Assembly. Our goal is to enable data interpretation and assembly quality evaluation. The Genome Assembly Analysis Framework (GAAF) was designed to work with distinct species, assemblers and features. In order to validate our proposal, we have run a few practical experiments with GAAF, which make us understand the way it can be used, instantiated and extended.

I sistemi di valutazione genetica nel mondo sono in rapido sviluppo. Attualmente, i programmi di selezione “tradizionale” basati su fenotipi e rapporti di parentela tra gli animali vengono integrati, e nel futuro potrebbero essere sostituiti, dalle informazioni molecolari. In questo periodo di transizione, questa tesi riguarda ricerche su entrambi i tipi di valutazioni: dall’accertamento sull’accuratezza degli indici genetici internazionali (tradizionali), allo studio di metodi statistici utilizzati per integrare informazioni genomiche nella selezione (selezione genomica). Tre capitoli valutano gli approcci per stimare i valori genetici dai dati genomici riducendo il numero di variabili indipendenti. In modo particolare, la correzione di Bonferroni e il test di permutazioni con regressione a marcatori singoli (Capitolo III), analisi delle componenti principali con BLUP (Capitolo IV) e indice Fst tra razze con BayesA (Capitolo VI). Inoltre, il Capitolo V analizza l’accuratezza dei valori genomici con BLUP, BayesA e Bayesian LASSO includendo tutte le variabili disponibili. I risultati di questa tesi indicano che il progresso genetico atteso dall’analisi dei dati simulati può effettivamente essere ottenuto, anche se ulteriori ricerche sono necessarie per ottimizzare l’utilizzo delle informazioni molecolari in modo da ottimizzare i risultati per tutti i caratteri sotto selezione. / Genetic evaluation systems are in rapid development worldwide. In most countries, “traditional” breeding programs based on phenotypes and relationships between animals are currently being integrated and in the future might be replaced by the introduction of molecular information. This thesis stands in this transition period, therefore it covers research on both types of genetic evaluations: from the assessment of the accuracy of (traditional) international genetic evaluations to the study of statistical methods used to integrate genomic information into breeding (genomic selection). Three chapters investigate and evaluate approaches for the estimation of genetic values from genomic data reducing the number of independent variables. In particular, Bonferroni correction and Permutation test combined with single marker regression (Chapter III), principal component analysis combined with BLUP (Chapter IV) and Fst across breeds combined with BayesA (Chapter VI). In addition, Chapter V analyzes the accuracy of direct genomic values with BLUP, BayesA and Bayesian LASSO including all available variables. The results of this thesis indicate that the genetic gains expected from the analysis of simulated data can be obtained on real data. Still, further research is needed to optimize the use of genome-wide information and obtain the best possible estimates for all traits under selection.