Orientador: José Luiz Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-17T10:58:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martins_IsabelaMateus_M.pdf: 18364444 bytes, checksum: 31989d921c63b7a58bff34af51349106 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Staphylococcus são micro-organismos amplamente distribuídos na natureza, sendo o homem e os animais suas principais fontes. A contaminação cruzada após a pasteurização do leite, especialmente por manipulação inadequada, é apontada como a mais importante forma de contaminação dos derivados do leite por estes patógenos, que são importantes em alimentos devido à sua habilidade de produzir uma grande quantidade de proteínas extracelulares (enterotoxinas) que, se pré-formadas no alimento e ingeridas, causam a intoxicação estafilocócica. Apesar da legislação brasileira (RDC 12/2001, Anvisa) preconizar apenas a contagem de Staphylococcus coagulase positiva, relacionando a produção da coagulase com o risco de produção de enterotoxinas, já foi comprovado que espécies coagulase negativas também são capazes de produzir enterotoxinas nos alimentos. Desta forma, os objetivos deste trabalho foram: i) quantificar e analisar a presença de Staphylococcus coagulase positiva e negativa em 104 amostras de derivados lácteos, sendo 24 de sorvete artesanal, 20 de creme de leite pasteurizado, 20 de patê à base de queijo, 20 de queijo Minas frescal e 20 de queijo Minas meia cura; ii) identificar fenotipicamente as espécies isoladas; iii) avaliar a produção de enterotoxinas clássicas (SEA, SEB, SEC1,2,3, SED e SEE) in vitro pelo sistema VIDAS e relacionar os resultados obtidos com a presença de possíveis genes codificadores destas enterotoxinas, pela aplicação da técnica de PCR. Os valores médios de contagens preliminares nos diferentes grupos de alimentos analisados foram: 5 x 103 UFC/g em sorvete, 2,9 x 105 UFC/g em creme de leite, 6,2 x 103 UFC/g em patê, 6,6 x 105 UFC/g em queijo Minas frescal e 6,4 x 105 UFC/g em queijo Minas meia cura. Do total de isolados, 83,6% (148/177) foram classificados como sendo do gênero Staphylococcus e 16,4% (29/177) como Micrococcus. Staphylococcus foram isolados de 43,3% (45/104) das amostras, sendo detectados em 25 amostras de queijos, em 16 sorvetes, em 3 patês e em apenas 1 amostra de creme de leite. Entre os isolados de Staphylococcus, 74,3% (110/148) eram coagulase negativa e 25,7% (38/148) eram coagulase positiva recuperados apenas nas amostras de queijos. Dos 111 isolados selecionados (27 coagulase positiva e 84 coagulase negativa), foram identificadas 13 espécies através do sistema API-Staph (bioMérieux-SA): S. aureus, S. auricularis, S. caprae, S. chromogenes, S. cohnii ssp cohnii, S. epidermidis, S. hominis, S. hyicus, S. lentus, S. saprophyticus, S. sciuri, S. warneri, S. xylosus. Para a detecção de enterotoxinas estafilocócicas clássicas, foi utilizado o kit (bioMérieux-SA). Dos?imunoenzimático ViDAS SET ¿Staph enterotoxin¿ 111 isolados, apenas um (0,9%) produziu enterotoxina, sendo este identificado como S. aureus, coagulase positiva, isolado a partir de queijo Minas meia cura, cuja contagem foi de 1,9 x 106 UFC/g. Ao contrário do esperado, não foram detectados genes codificadores das 5 enterotoxinas em nunhum dos isolados analisados. Discrepâncias entre resultados de testes fenotípicos e genotípicos para detecção de enterotoxinas são comuns, sendo necessária a realização de outros testes imunológicos e moleculares para confirmação destes resultados. Possíveis justificativas seriam a existência de variações nas sequências dos genes do isolado ou a presença de uma toxina que possui reação imunológica cruzada com as enterotoxinas clássicas. Neste estudo, apesar da quase totalidade dos isolados não terem produzido enterotoxinas clássicas, havia um número bem elevado de Staphylococcus em diversos produtos analisados, não excluindo um possível risco de produção das demais enterotoxinas já descritas e demonstrando a falta de cuidados higiênico-sanitários e de boas práticas durante a produção e comercialização destes alimentos / Abstract: Staphylococcus are microorganisms widespread in nature and humans and animals are their main sources. Cross-contamination after milk pasteurization, caused especially by improper handling, is considered the most recurrent source of dairy products contamination by these pathogens. Staphylococus deserves our close attention due their ability to produce a large amount of extracellular proteins (enterotoxins), that if preformed in food and ingested, cause staphylococcal food poisoning. Although the Brazilian legislation (RDC 12/2001, Anvisa) only recommends coagulase-positive staphylococci count monitoring (relating coagulase production to the risk of enterotoxins production), previous researches showed that coagulase-negative species are also capable of producing enterotoxins in foods. Thus, this research aimed: i) to quantify and analyze the presence of coagulase-positive and coagulase-negative staphylococci from 104 dairy products samples, being: 24 homemade ice cream, 20 pasteurized dairy cream, 20 cheese pate, 20 Minas fresh cheese, and 20 Minas half cured cheese; ii) to identify phenotypically the species; iii) to evaluate the production of classic enterotoxins (SEA, SEB, Sec1, 2.3, SED and SEE) in vitro by using VIDAS system and correlate the results to the presence of possible coding genes of these enterotoxins, applying the PCR technique. The average staphylococcal preliminary count values in different food groups analyzed were: 5 x 103 CFU/g in ice cream, 2,9 x 105 CFU/g in dairy cream, 6,2 x 103 CFU/g in pate, 6,6 x 105 CFU/g in Minas fresh cheese and 6,4 x 105 CFU/g in Minas half cured cheese. From isolated strains, 83,6% (148/177) were classified as genus Staphylococcus and 16,4% (29/177) as Micrococcus. Staphylococcus were isolated from 43,3% (45/104) of samples, being found in 25 cheese samples, in 16 ice creams, in 3 pates and in just one dairy cream sample. Among staphylococcal strains, 74,3% (110/148) were coagulase-negative Staphylococcus and 25,7% (38/148) were coagulase-positive Staphylococcus, being these recovered only from cheeses samples. On 111 selected isolates (27 coagulase-positive and 84 coagulase-negative), were identified 13 staphylococcal species by using API-Staph system (bioMérieux-SA): S. aureus, S. auricularis, S. caprae, S. chromogenes, S. cohnii ssp cohnii, S. epidermidis, S. hominis, S. hyicus, S. lentus, S. saprophyticus, S. sciuri, S. warneri, S. xylosus. For classical staphylococcal enterotoxins detection was used VIDAS SET Staph- Enterotoxin immunoassay kit (bioMérieux-SA). From 111 isolates, just one (0,9%) produced enterotoxin, which was identified as S. aureus, coagulasepositive, isolated from Minas half cured cheese, whose count was 1,9 x 106 CFU/g. Contrary to expectations, no coding genes were present in isolates analyzed. Discrepancies between phenotypic and genotypic results of enterotoxin detection tests are common, requiring the application of other immunological and molecular tests for the confirmation of the results. Possible explanations would be that there are genes sequences variations or another enterotoxin that has immunological cross-reaction with classic enterotoxins. For this research, although the higher number of the isolates did not produce classical enterotoxins, the analyzed samples showed high staphylococcal concentration, that do not exclude a newly described enterotoxins risk production. It also demonstrates the lack of hygiene, health care and good practices during the production and commercialization of dairy products / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-09-20T13:24:05Z No. of bitstreams: 1 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-09-20T13:24:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-09-20T13:24:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-20T13:24:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Previous issue date: 2011-02-24 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / This study aims to evaluate genotypic responses during somatic embryogenesis from zygotic embryos of oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) as well as to evaluate the ontogeny and identify proteins differentially expressed during different stages of embryogenesis. Zygotic embryos were used in nine genotypes: C2001, C2328, C2301, C3701, CM1115, C7201, C2528, C2501 and CN1637. Initially, the zygotic embryos were inoculated in culture medium for callus induction (450 μM Picloram), with subcultures every 30 days. After 150 days, callus were transferred to two culture media in orderto differentiation and maturation of somatic embryos: MTD -1 (0.6μM NAA and 12.3 μM 2-iP) and MTD-2 (40 μM Picloram). After 90 days, the callus with somatic embryos were transferred to regeneration medium devoid of growth regulators. At all stages the explants were kept in growth room with temperature 25 ± 2° C and dark conditions. The analysis was performed anatomical mold during the embryogenic process. Since the proteomic samplewere collected from zygotic embryos (E1), with swollen explants 14 days (E2) in induction medium, primary callus (E3) and callus pro-embryogenic (E4). It was found that the genotypes have different morphogenic responses in vitro. In the induction phase, genotypes C2501, C2001, C7201, C2528, C2328 and C3701 showed better results in the formation of embryogenic callus, with values between 90 and 100%. After 90 days of regeneration, the genotypes that showed the best results in the formation and regeneration of somatic embryos were C2328 and CM1115. The anatomical analysis allowed notice to 14 days in induction medium the formation of the first divisions procambium cells and perivasculary. This region has progressed to the formation of meristematic masses after 21 days, indicating their procambial and perivasculary. Primary callus appeared after 45 days of culture, followed by progression to embryogenic callus at 90 days. The formation of proembrions from meristematic cells, occurred after 135 of cultivation. The proembrions presented them selves isolated from the tissue of origin, by thickening the cell wall, indicating their unicellular origin. When transferred to the maturation phase in culture MTD -1 (0.6 μM NAA and 12.3 μM 2-iP) and MTD-2 (40 μM picloram), we observed the regeneration of somatic embryos at different stages development (globular-torpedo). The embryos were differentiated protoderm, strands of procambium and plumule. They were then transferred to culture medium free of growth regulators (regeneration phase plants), which was observed in the conversion of embryos into plants. The accumulation of starch during the process of somatic embryogenesis was concentrated near the centers of intense cell division, and the cortex of primary and embryogenic callus. However, in different stages of somatic embryos was not observed the accumulation of starch. Already proteomic analysis has identified proteins involved in the acquisition of embryogenic competence. Proteins were categorized into seven groups according to their biological function as well as by participating in different metabolic pathways: 1) proteins expressed in stress conditions, 2) proteins involved in cell cycle, 3) proteins involved in the accumulation of starch, 4) energy metabolism proteins, 5) protein of nitrogen metabolism, 6) processing of proteins and 7) proteins of zygotic embryo. Knowledge of the in vitro reconstitution of the events, physiological, genotypic ontogenetic and biochemical factors involved in somatic embryogenesis in E. guineensis enable a greater understanding of the kind of cloning, whether for the production of seedlings in scale, is to accelerate breeding programs of culture. / Este trabalho tem como objetivo avaliar respostas genotípicas durante a embriogênese somática a partir de embriões zigóticos de dendezeiros (Elaeis guineensis Jacq.), bem como avaliar a ontogênese e identificar proteínas diferencialmente expressas durante as diferentes etapas do processo embriogênico. Foram utilizados embriões zigóticos de nove genótipos: C2001, C2328, C2301, C3701, CM1115, C7201, C2528, C2501 e CN1637. Inicialmente, os embriões zigóticos foram inoculados em meio de cultura para a indução de calos (450 μM de Picloram), com subcultivos a cada 30 dias. Após 150 dias, os calos foram transferidos para dois meios de cultura visando à diferenciação e maturação de embriões somáticos: MTD -1 (0,6μM de ANA e 12,3 μM de 2-iP) e MTD-2 (40 μM de Picloram). Após 90 dias, os calos com embriões somáticos foram transferidos para o meio de regeneração, desprovido de reguladores de crescimento. Em todas as etapas os explantes foram mantidos em sala de crescimento com temperatura de 25±2ºC e sob condições de escuro. A análise mofo-anatômica foi realizada durante todo o processo embriogênico. Já a análise proteômica foi coletada amostras dos embriões zigóticos (E1), explantes intumescidos com 14 dias (E2) em meio de indução, calo primário (E3) e calo pró-embriogênico (E4). Verificou-se que os genótipos testados apresentam diferentes respostas morfogênicas in vitro. Na fase de indução, os genótipos C2501, C2001, C7201, C2528, C2328 e C3701 apresentaram os melhores resultados na formação de calos embriogênicos, com valores entre 90 e 100%. Após 90 dias de regeneração, os genótipos que apresentaram os melhores resultados para formação e regeneração de embriões somáticos foram o C2328 e CM1115. As analises anatômicas permitiram observar aos 14 dias em meio de indução a formação das primeiras divisões nas células procâmbiais e perivasculares. Essa região progrediu para a formação de massas meristemáticas, após 21 dias, indicando sua origem procambial e perivascular. Calos primários surgiram após 45 dias de cultura, seguido da progressão para calos embriogênicos aos 90 dias. A formação de proembriões, a partir das células meristemáticas, ocorreu após 135 de cultivo. Os proembriões apresentavam-se isolados do tecido de origem, pelo leve espessamento da parede celular, indicando sua origem unicelular. Quando transferidos para fase de maturação, nos meios de cultura MTD -1 (0,6μM de ANA e 12,3 μM 2-iP) e MTD-2 (40 μM picloran), observou-se a regeneração de embriões somáticos em diferentes estágios de desenvolvimento (globular-torpedo). Os embriões diferenciados apresentaram protoderme, cordões de procâmbio e plúmula. Em seguida foram transferidos para o meio de cultura isento de reguladores de crescimento (fase de regeneração de plantas), no qual foi observada a conversão dos embriões somáticos em plantas. O acúmulo de amido durante o processo de embriogênese somática concentrou-se próximos aos centros de intensa divisão celular, e no córtex dos calos primários e embriogênicos. No entanto, nos diferentes estágios de embriões somáticos não foi observado o acúmulo de amido. Já a análise proteômica identificou proteínas envolvidas no processo de aquisição da competência embriogênica. As proteínas foram categorizadas em sete grupos de acordo com sua função biológica, bem como pela participação em vias metabólicas distintas: 1) proteínas expressas em condições de estresse; 2) proteínas envolvidas no ciclo celular; 3) proteínas envolvidas no acúmulo de amido; 4) proteínas do metabolismo energético; 5) proteína do metabolismo do nitrogênio; 6) processamento das proteínas; e 7) proteínas do embrião zigótico. O conhecimento da reconstituição in vitro dos eventos, fisiológicos, genotípicos, ontogênicos e bioquímicos, que envolvem o processo de embriogênese somática em E. guineenses, permiti um maior entendimento da clonagem da espécie, seja para a produção de mudas em escala, seja para acelerar programas de melhoramento genético da cultura.