Orientador: Sisi Marcondes Paschoal / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T18:31:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bonfitto_PedroHenriqueLeite_M.pdf: 791921 bytes, checksum: 967c29bbcdf8e6df7bd3a2d919b84111 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: As plaquetas são importantes células na inflamação, entretanto, os trabalhos que estudam as citocinas na reatividade plaquetária são raros. O objetivo do presente trabalho foi estudar os efeitos do fator de necrose tumoral-alfa (TNF-?) em plaquetas. Ensaios de agregação foram realizados incubando-se plaquetas com crescentes concentrações de TNF-? (1 - 3000 pg/ml) por diferentes intervalos de tempo (5 - 60 min), na ausência ou presença do antagonista não seletivo dos receptores TNFR1 e TNFR2, o R7050. Também foi estudado o efeito do TNF-? na viabilidade plaquetária utilizando-se o MTT. O efeito do TNF-? na mobilização de Ca2+ em plaquetas foi investigado através de ensaios de fluorescência utilizando-se o fluo-3-AM; os ensaios de western blotting foram realizados para o estudo da ativação da enzima c-Src e do receptor de fibrinogênio. Finalmente, foram determinados os níveis intraplaquetários de AMPc e GMPc por ELISA. O TNF-? inibiu a agregação plaquetária induzida por ADP ou trombina de forma dependente da concentração da citocina e do tempo de incubação. O efeito inibitório máximo do TNF-? na agregação induzida por ADP (5 ?M) foi obtido com a concentração de 300 pg/ml por um tempo de incubação de 30 min (90 ± 7% de inibição), o qual foi significativamente prevenido pela pré-incubação das plaquetas com o R7050. A viabilidade plaquetária não foi modificada pela incubação por 60 min com o TNF-? (30 e 3000 pg/ml). A incubação de plaquetas com TNF-? (300 pg/ml, 30 min) reduziu em 53% o aumento da concentração de Ca2+ total causado pela adição de trombina (200 mU/ml). A queda da concentração de Ca2+ citosólica plaquetária causada pelo TNF-? foi em decorrência da diminuição em 1,8 e 3,4 vezes da mobilização interna do íon e do influxo do mesmo, respectivamente. O TNF-? reduziu em 60% os níveis de AMPc em plaquetas ativadas com ADP. Por outro lado, o TNF-? aumentou significativamente os níveis de GMPc em plaquetas ativadas por ADP (aumento de 51%). A pré-incubação de plaquetas com o inibidor da guanilil ciclase ODQ não reduziu o efeito inibitório do TNF-? na agregação induzida por ADP. Os ensaios de western blotting mostraram que o TNF-? reduziu significativamente a fosforilação do resíduo de Tyr416 da c-Src em plaquetas ativadas. Da mesma forma, o TNF-? reduziu em 37% a fosforilação do resíduo de Tyr773 da subunidade ?3 da integrina ?IIb?3 (receptor de fibrinogênio) em plaquetas ativadas por ADP. Portanto concluímos que o TNF-? inibe a agregação plaquetária via receptores TNFR1 e/ou TNFR2, sem reduzir a viabilidade das plaquetas. O efeito inibitório do TNF-? na agregação é acompanhado pela redução de Ca2+ citosólico e inibição de c-Src e do receptor de fibrinogênio em plaquetas, sendo estes independentes de AMPc ou GMPc / Abstract: Platelets have been described as important cells in inflammation; however, the effects of cytokines on platelet reactivity are rarely studied. The objective of the present work was to investigate the effects of the tumor necrosis factor-alpha (TNF-?) in platelets. Aggregation assays were carried out incubating platelets with increasing TNF-? concentrations (1 - 3000 pg/ml) for different intervals of times (5 - 60 min), in the absence or in presence of the non-selective antagonist of TNFR1 and TNFR2, R7050. Effect of TNF-? on platelet viability was determined using MTT. The effect of TNF-? on the Ca2+ mobilization in platelets was investigated through fluorescence assays using fluo-3AM and Western blotting assays were carried out to determine the activation of c-Src and the fibrinogen receptor. Finally, the cAMP and cGMP levels in platelets were determined by ELISA. TNF-? dose- and time-dependently inhibited ADP or thrombin-induced platelet aggregation. The inhibitory effect of TNF-? on ADP(5 ?M)-induced platelet aggregation was maximum in a concentration of 300 pg/ml incubated with platelets for 30 min (90 ± 7% of inhibition), which was significantly prevented by the incubation of platelets with R7050. Platelet viability was not modified by TNF-? (30 and 3000 pg/ml) incubated for 5 to 60 min. Incubation of platelets with TNF-? (300 pg/ml, 30 min) reduced the increased total Ca2+ concentration induced by thrombin (200 mU/ml) by 53%. Decreasing Ca2+ internal mobilization (1,8 fold) and decreasing in external Ca2+ influx (3,4 fold) led to a reduction of total cytosolic Ca2+ in TNF-? activated platelets. TNF-? reduced the cAMP levels in ADP-activated platelets by 60%. On the other hand, TNF-? significantly increased cGMP levels in ADP-activated platelets (51% increase). Pre-incubation of platelets with the guanylyl cyclase inhibitor ODQ did not modify the inhibitory effect of TNF-? on ADP-induced platelet aggregation. Western blotting analysis showed that TNF-? significantly reduced phosphorylation on Tyr416 of c-Src in activated platelets. Similarly, TNF-? reduced by 37% the Tyr773 phosphorylation of ?3 subunit of ?IIb?3 integrin (fibrinogen receptor) in ADP-activated platelets. Therefore, our results show that TNF-? inhibits platelet aggregation via TNFR1 and/or TNFR2 receptors, without affecting platelet viability. The inhibitory effect of TNF-? on aggregation is accompanied by a reduction in cytosolic Ca2+ and the inhibition of c-Src and fibrinogen receptor activation, which are cAMP and cGMP-independent effects / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Farmacologia