Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Il est maintenant bien établi que les GHRPs constituent une classe de peptides synthétiques stimulant la sécrétion de l'hormone de croissance par interaction avec leur récepteur spécifique au niveau hypophysaire. Ce récepteur constitué de 364 acides aminés appartient à la famille des récepteurs à sept passages transmembranaires couplé aux protéines G. Il est exprimé non seulement au niveau de l'hypophyse mais également au niveau de l'hypothalamus, des noyaux arqués et paraventriculaires. Récemment, il a été découvert par étude de photomarquage covalent que l'hexarelin, un hexapeptide de la famille des GHRPs se lie de façon spécifique à une glycoprotéine membranaire de poids moléculaire de 84 kDa exprimée dans les membranes de coeur de rat. La liaison de l'hexarelin à ce récepteur au niveau cardiaque induit une forte vasoconstriction coronarienne de façon dose­dépendante dans le modèle de coeur de rat perfusé. Les buts de la présente étude sont premièrement de déterminer si la liaison est spécifique seulement à l'hexarelin ou à d'autres analogues peptidiques de la famille des GHRPs, notamment le dérivé EP 70905. Dans un deuxième temps nous déterminerons si les analogues se liant au récepteur cardiaque des GHRPs exercent un effet vasoconstricteur sur les coronaires utilisant le modèle de cœur de rat perfusé. Troisièmement nous caractériserons les voies de signalisation impliquées dans la vasoconstriction induite par les GHRPs. Les études de compétition entre le radioligand photoactivable [125] I-Tyr-Ala-Bpa­hexarelin et le EP 70905 effectuées sur les membranes de cœur de rat démontrent une affinité de liaison comparable du EP 70905 et de l'hexarelin au récepteur cardiaque des GHRPs. Cependant, le EP 70905 induit une augmentation de la pression coronarienne significativement plus élevée que celle induite par l'hexarelin. Les études des voies de signalisation démontrent que les tyrosine kinases ne semblent pas être impliquées dans la vasoconstriction induite par le EP 70905, puisque la perfusion simultanée avec la génistéine n'affecte pas la vasoconstriction induite par ce peptide. Le rôle de l'endothéline endogène dont la libération est stimulée par le EP 70905 semble être mineur dans la vasoconstriction observée considérant les taux femtomolaires d'endothéline libérés dans le perfusat. De plus, la perfusion simultanée d'un antagoniste des récepteurs d'endothéline, le LU 302872 affecte que faiblement la vasoconstriction induite par le EP 70905. Par contre, la vasoconstriction coronarienne induite par le EP 70905 est inhibée de façon majeure suite à la perfusion de la nifédipine, un bloqueur des canaux calciques de type L. La perfusion simultanée d'un inhibiteur de la protéine kinase C, la chélérythrine affecte de façon significative la vasoconstriction induite par le EP 70905.

Le CD36 est un récepteur de type éboueur de classe B exprimé à la surface de nombreux types cellulaires dont les macrophages, les cellules endothéliales de la microvasculature et les plaquettes. Ce récepteur multiligand est impliqué dans plusieurs processus pathologiques notamment l’athérosclérose, l’angiogénèse et la malaria via la liaison spécifique de ligands comme les lipoprotéines oxydées de basse densité, la thrombospondine-1 et la protéine PfEMP-1, respectivement. Les peptides de la relâche de l’hormone de croissance (GHRP) ont été identifiés comme les premiers ligands synthétiques du CD36. Afin de développer de nouveaux ligands synthétiques du CD36, l’établissement d’une méthode de criblage est essentiel pour découvrir des composés avec une liaison de haute affinité pour ce récepteur. Pour y parvenir, nous avons surexprimé le domaine extracellulaire du CD36 humain dans les cellules d’insectes Sf9. La protéine soluble purifiée par chromatographie d’affinité fut immobilisée à la surface d’une plaque de résonance de plasmons de surface (SPR) pour les études de liaison. La méthodologie développée a permis de caractériser les ligands du CD36 en déterminant leurs constantes de dissociation (KD), et d’établir une relation structure-activité des ligands de la famille des azapeptides, des composés dérivés du GHRP-6. Afin de valider la méthode par spectroscopie SPR, une corrélation a été établie entre les valeurs de KD obtenues en SPR et les valeurs d’CI50 de courbes d’inhibition de la phosphorylation des MAP kinases JNK1/2 induite par un phospholipide oxydé, le POVPC, en présence de concentrations croissantes de ligands du CD36 dans les macrophages RAW 264.7. / CD36 is a class B scavenger receptor expressed at the cell surface of macrophages, endothelial cells and platelets, among others. This multiligand receptor is implicated in various diseases such as atherosclerosis, angiogenesis and malaria through the specific binding of ligands, such as oxidized low-density lipoproteins, thrombospondin-1 and the PfEMP-1 protein, respectively. Growth hormone-releasing peptides (GHRP) were identified as the first CD36 synthetic ligands. In order to identify new CD36 synthetic ligands, the development of a high-throughput method is essential to unveil compounds of high binding affinity. We have expressed a recombinant CD36 ectodomain protein in Sf9 insect cells. The soluble and affinity purified protein was immobilized on a surface plasmon resonance (SPR) sensor for binding studies. Synthetic ligands were analyzed by SPR spectroscopy for determination of their respective dissociation constant (KD). A structure-activity relationship of CD36 ligands was established. To validate the SPR binding signal, a good correlation was observed between KD and the IC50 values obtained from the inhibition curves of the MAPK kinase JNK1/2 phosphorylation induced by an oxidized phospholipid, the POVPC, in the presence of increasing concentrations of CD36 ligands in RAW 264.7 macrophage cells.

Le CD36 est un récepteur de type éboueur de classe B exprimé à la surface de nombreux types cellulaires dont les macrophages, les cellules endothéliales de la microvasculature et les plaquettes. Ce récepteur multiligand est impliqué dans plusieurs processus pathologiques notamment l’athérosclérose, l’angiogénèse et la malaria via la liaison spécifique de ligands comme les lipoprotéines oxydées de basse densité, la thrombospondine-1 et la protéine PfEMP-1, respectivement. Les peptides de la relâche de l’hormone de croissance (GHRP) ont été identifiés comme les premiers ligands synthétiques du CD36. Afin de développer de nouveaux ligands synthétiques du CD36, l’établissement d’une méthode de criblage est essentiel pour découvrir des composés avec une liaison de haute affinité pour ce récepteur. Pour y parvenir, nous avons surexprimé le domaine extracellulaire du CD36 humain dans les cellules d’insectes Sf9. La protéine soluble purifiée par chromatographie d’affinité fut immobilisée à la surface d’une plaque de résonance de plasmons de surface (SPR) pour les études de liaison. La méthodologie développée a permis de caractériser les ligands du CD36 en déterminant leurs constantes de dissociation (KD), et d’établir une relation structure-activité des ligands de la famille des azapeptides, des composés dérivés du GHRP-6. Afin de valider la méthode par spectroscopie SPR, une corrélation a été établie entre les valeurs de KD obtenues en SPR et les valeurs d’CI50 de courbes d’inhibition de la phosphorylation des MAP kinases JNK1/2 induite par un phospholipide oxydé, le POVPC, en présence de concentrations croissantes de ligands du CD36 dans les macrophages RAW 264.7. / CD36 is a class B scavenger receptor expressed at the cell surface of macrophages, endothelial cells and platelets, among others. This multiligand receptor is implicated in various diseases such as atherosclerosis, angiogenesis and malaria through the specific binding of ligands, such as oxidized low-density lipoproteins, thrombospondin-1 and the PfEMP-1 protein, respectively. Growth hormone-releasing peptides (GHRP) were identified as the first CD36 synthetic ligands. In order to identify new CD36 synthetic ligands, the development of a high-throughput method is essential to unveil compounds of high binding affinity. We have expressed a recombinant CD36 ectodomain protein in Sf9 insect cells. The soluble and affinity purified protein was immobilized on a surface plasmon resonance (SPR) sensor for binding studies. Synthetic ligands were analyzed by SPR spectroscopy for determination of their respective dissociation constant (KD). A structure-activity relationship of CD36 ligands was established. To validate the SPR binding signal, a good correlation was observed between KD and the IC50 values obtained from the inhibition curves of the MAPK kinase JNK1/2 phosphorylation induced by an oxidized phospholipid, the POVPC, in the presence of increasing concentrations of CD36 ligands in RAW 264.7 macrophage cells.

Le CD36 est un récepteur éboueur de classe B exprimé par plusieurs types cellulaires dont les macrophages et les cellules endothéliales de la microvasculature. Le CD36 présente une haute affinité de liaison pour les ligands lipidiques tels que les lipoprotéines oxydées de basse densité (LDLox). De part sa capacité à internaliser les LDLox au niveau des macrophages et de son implication dans la formation des cellules spumeuses, le CD36 joue un rôle critique dans le développement des lésions athérosclérotiques. Nous avons testé l'hypothèse selon laquelle le EP 80317, un ligand synthétique sélectif du CD36, exerce des effets anti-athérosclérotiques chez les souris déficientes en apolipoprotéine E. Un traitement prolongé (12 semaines) avec le EP 80317 réduit fortement (de 51%) la surface des lésions athérosclérotiques par comparaison aux souris témoins. L'effet anti-athérosclérotique est associé à une diminution des taux de cholestérol plasmatique, à une réduction de l’internalisation des LDLox au niveau des macrophages et à une augmentation de l’expression des protéines impliquées dans le transport inverse du cholestérol. De plus, un traitement par le EP 80317 est également associé une diminution de l’expression aortique et plasmatique de protéines pro-inflammatoires. Nos études ont aussi montré un rôle pour le CD36 dans le recrutement des phagocytes mononucléés au niveau des lésions athérosclérotiques, tel que démontré par une réduction de l’accumulation des phagocytes mononucléés radiomarqués CD36–/– par rapport aux cellules CD36+/+. À l’échelle moléculaire, nous avons montré que les phospholipides oxydés induisent la phosphorylation de la kinase Pyk2 des podosomes des monocytes/macrophages de manière dépendante de l’expression du CD36 et de Src. Cette phosphorylation est atténuée par un traitement par le EP80317. Nos résultats appuient le rôle important du CD36 dans l’athérosclérose et suggèrent que les ligands synthétiques qui modulent la fonction du CD36 représentent potentiellement une nouvelle classe d'agents anti-athérosclérotiques. Le CD36 exprimé par les cellules endothéliales de la microvasculature est un récepteur de l’hétérodimère protéique S100A8/A9. Ces protéines s’associent à l’acide arachidonique intracellulaire (AA) des neutrophiles polymorphonucléaires (PMN) et le complexe S100A8/A9/AA peut être sécrété par les PMN activés au contact de l’endothélium. Nous avons vérifié l’hypothèse selon laquelle le CD36 exprimé par la microvasculature est impliqué dans le métabolisme transcellulaire de l’AA par la liaison du complexe S100A8/A9/AA et la réponse inflammatoire. Chez deux modèles murins d'inflammation aiguë (ischémie/reperfusion des membres inférieurs et poche d’air dorsale), nous avons observé que la réponse inflammatoire, notamment l’accumulation des PMN au niveau des sites inflammatoires, est diminuée en moyenne de 63% chez les souris CD36-/-. De même, un traitement par le EP 80317 ou par les anticorps anti-S100A8/A9 diminue chacun de 60% en moyenne l’extravasation des PMN vers les tissus inflammatoires. L’administration simultanée des deux traitements n’a aucun effet supplémentaire, et ces traitements n’exercent aucun effet chez les souris CD36-/-. Nos résultats appuient le rôle du récepteur CD36 de la microvasculature dans la régulation de la réponse inflammatoire. L’utilisation des ligands synthétiques du CD36 pourrait représenter une nouvelle avenue thérapeutique dans le traitement des réponses inflammatoires aiguës. / CD36 is a class B scavenger receptor expressed by multiple cell types such as macrophages and microvascular endothelial cells. CD36 shows a high affinity binding towards lipid-based ligands such as oxidized low-density lipoproteins (oxLDL). Macrophage CD36 has been shown to play a critical role in the development of atherosclerotic lesions by its ability to internalize oxLDL and to lead to foam cell formation. We tested the hypothesis that EP 80317, a selective CD36 ligand, exerts anti-atherosclerotic effects in apolipoprotein E-deficient (apoE–/–) mice fed on atherogenic diet. Long term treatment (12 weeks) with EP 80317 results in a striking reduction (51%) of lesion areas in EP 80317-treated apoE–/– mice. This effect was associated with a decrease in plasma cholesterol, a reduced oxLDL internalization within macrophages and an up-regulation of proteins involved in cholesterol efflux. Additionally, treatment with EP 80317 was associated with a reduced expression of vascular and plasma pro-inflammatory proteins. Our studies also showed a role of CD36 in modulating the recruitment of mononuclear phagocytes to the arterial wall, as shown by a reduced migration of radiolabeled CD36-/- macrophages into atherosclerotic lesions compared to CD36+/+ cells. At the molecular level, our studies showed that oxidized phospholipids induced the phosphorylation of the adhesion kinase Pyk2 in monocytes/macrophages, in a CD36- and Src-dependent manner. The Pyk2 phosphorylation is attenuated by treatment with EP80317. Our results strongly support the role of CD36 in atherosclerosis development and suggest that synthetic ligands featuring modulatory effect on CD36 function may represent a novel class of anti-atherosclerotic agents. CD36 expressed by microvascular endothelial cells is a receptor for the heterodimer S100A8/A9. These proteins bind intracellular arachidonic acid (AA) within polymorphonuclear neutrophils (PMN) and the complex S100A8/A9-AA may be secreted at sites of inflammation where it exerts chemotactic activities. We aimed to delineate the role of microvascular CD36, as a receptor for the S100A8/A9, in the AA transcellular metabolism and the regulation of the associated PMN trafficking to inflammatory sites. In two mouse models of acute inflammation (hind limb ischemia/reperfusion and dorsal air pouch), CD36 regulated trafficking of PMN to inflammatory sites, as shown by a mean of 63% reduction of PMN accumulation in CD36-/- mice. Treatment with EP 80317 or with S100A8/A9 antibodies reduced, each by ~ 60%, the recruitment of PMN to inflammatory sites. The combined administration of anti-S100A8/A9 and EP 80317 did not exert any additional inhibitory effect and neither treatment featured a modulatory effect in CD36-/- mice. Our results strongly support a role for microvascular CD36 in regulating PMN trafficking to inflammatory sites. Targeting CD36 might represent a novel therapeutic avenue for the treatment of acute inflammatory responses.