A leucemia mieloide aguda (LMA) compreende um grupo heterogêneo de doenças hematológicas caracterizadas pela expansão clonal de células mieloides imaturas que apresentam diferentes tipos de alterações genéticas e epigenéticas. O diagnóstico requer a identificação de infiltração da medula óssea e/ou sangue por blastos mieloides leucêmicos em frequência igual ou superior a 20% das células nucleadas. Os tratamentos mais frequentemente empregados para a LMA englobam o uso de quimioterapia convencional com uso de citarabina e antraciclinas, bem como agentes imunoterápicos. Embora a pesquisa da biologia da LMA tenha levado ao desenvolvimento de novos agentes direcionados a alvos específicos como as mutações em FLT3, faltam avanços para os pacientes com outras leucemias que não a leucemia promielocítica aguda (LPA). A halofuginona (HF) é um derivado halogenado de febrifugina, que possui propriedades antifibróticas, anticancerígenas, antiinflamatórias e pró-apoptóticas. No presente estudo, avaliamos a indução de apoptose pela HF nas linhagens de LMA Kasumi-1,THP-1, MV4-11, U937 e OCI-AML3, verificando a sensibilidade ao tratamento. Verificamos que a linhagem Kasumi-1 foi sensível à atividade pró-apoptótica da HF exibindo dose efetiva 50 DE50 de 125,58 ng/ml, e que as células THP-1 foram resistentes exibindo DE50 de 786,15 ng/ml. As células Kasumi-1 sofreram diminuição significativa da percentagem de células na fase S do ciclo celular, enquanto que as percentagens de células THP-1 em qualquer das fases analisadas não se alterou em comparação às amostras controles tratadas com veículo. Usando a metodologia de Western Blot, foi detectada a ativação da via das caspases com aumento da clivagem de caspase 3 após 3 horas de incubação com HF nas amostras de células Kasumi-1 e após 12 horas para as células THP-1. Bandas correspondentes a forma clivada de PARP foram identificadas em amostras de células Kasumi-1 após 12 horas de tratamento e nas amostras de células THP-1 após 3 horas de tratamento. Usando a metodologia de Proteome Profiler TM Array - HumanPhospho-Kinase Array para rastreio de proteinas fosforiladas pelo tratamento com HF, detectamos que houve modulação de 3 proteínas diferencialmente para as duas linhagens, 9 proteínas moduladas exclusivamente nas células Kasumi-1 e 6 exclusivamente nas células THP-1 . Entre as alterações mais relevantes, destacamos a diminuição da fosforilação de Stat3 e Stat5 nas células Kasumi-1 e a diminuição das formas fosforiladas de p53 nas células THP-1. Nossos achados confirmam o efeito pró-apoptótico da HF, sobretudo nas células Kasumi-1, e sugerem que este efeito envolva a diminuição das fosforilações de Stat3 e de Stat5. / Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous hematological disorder characterized by the clonal expansion of immature myeloid cells exhibiting different types of genetic and epigenetic alterations. A diagnosis is established when a patient presents >= 20% of blast in the bone marrow or in the peripheral blood. The WHO classifies AML in seven subtypes depending on the morphology, immunophenotype, genetics and clinical presentation of the cells. The most common treatment until nowadays is chemotherapy in combination with cytarabine and anthracycline and furthermore also the application of immunotherapeutic agents. Although researchers have attempted to develop new agents targeting directly specific mutations such as FLT3, further studies are necessary to find new therapeutic approaches for other leukemic subtypes aside from acute promyelocytic leukemia (APL). Halofuginone (HF) is a halogenated derivate of Febrifugine, which is a molecule isolated from the plant Dichroa febrifuga. It has been demonstrated that Halofuginone exhibits antifibrotic, anti-cancerogenic, anti-inflammatory and pro-apoptotic properties. We evaluated the induction of apoptosis of HF in the AML cell lines Kasumi-1,THP-1, MV4-11, U937 e OCIAML3, we verified the sensitivity and resistance of these cell lines after treatment, performed a cell cycle analysis, analyzed the activation of proteins associated with apoptosis and the proteins associated with cell proliferation and survival. We established that the Kasumi-1 cell line was sensitive to the treatment of HF displaying a dose IC50 of 125, 58 ng/ml, while the THP-1 cell lines presented resistance displaying a dose IC50 of 786,15 ng/ml . When treated with HF, the Kasumi-1 cell line stopped in the S phase of the cell cycle displaying significant decrease of proliferation, while HF showed no significant on THP-1. Furthermore we performed a western blot and It was demonstrated that the cleavage of caspase 3 appeared after 3 hours of treatment in Kasumi-1 and after 12 hours of treatment in THP-1, while cleavage of caspase 9 appeared after 12 hours in both cell lines. PARP was cleaved in Kasumi-1 after 12 hours of HF treatment, whereas the cleavage of PARP in THP-1 remained the same after 3 hours of treatment. Performing the methodology of Proteome Profiler TM Array - HumanPhospho-Kinase Array we detected 3 proteins modulated in both cell lines, 9 proteins were modulated only in Kasumi-1 cells and 6 in THP-1 cells. Amongst the different tyrosine kinases and signaling pathways that were modulated, we observed that the phosphorylation of Stat3 and Stat5 was diminished in Kasumi-1, while THP-1 presented iii decreased phosphorylation of p53. Our findings confirm that HF exhibits pro-apoptotic effect on Kasumi-1 and is capable of modulating the various proteins important for cell survival.

A leucemia mieloide aguda (LMA) compreende um grupo heterogêneo de doenças hematológicas caracterizadas pela expansão clonal de células mieloides imaturas que apresentam diferentes tipos de alterações genéticas e epigenéticas. O diagnóstico requer a identificação de infiltração da medula óssea e/ou sangue por blastos mieloides leucêmicos em frequência igual ou superior a 20% das células nucleadas. Os tratamentos mais frequentemente empregados para a LMA englobam o uso de quimioterapia convencional com uso de citarabina e antraciclinas, bem como agentes imunoterápicos. Embora a pesquisa da biologia da LMA tenha levado ao desenvolvimento de novos agentes direcionados a alvos específicos como as mutações em FLT3, faltam avanços para os pacientes com outras leucemias que não a leucemia promielocítica aguda (LPA). A halofuginona (HF) é um derivado halogenado de febrifugina, que possui propriedades antifibróticas, anticancerígenas, antiinflamatórias e pró-apoptóticas. No presente estudo, avaliamos a indução de apoptose pela HF nas linhagens de LMA Kasumi-1,THP-1, MV4-11, U937 e OCI-AML3, verificando a sensibilidade ao tratamento. Verificamos que a linhagem Kasumi-1 foi sensível à atividade pró-apoptótica da HF exibindo dose efetiva 50 DE50 de 125,58 ng/ml, e que as células THP-1 foram resistentes exibindo DE50 de 786,15 ng/ml. As células Kasumi-1 sofreram diminuição significativa da percentagem de células na fase S do ciclo celular, enquanto que as percentagens de células THP-1 em qualquer das fases analisadas não se alterou em comparação às amostras controles tratadas com veículo. Usando a metodologia de Western Blot, foi detectada a ativação da via das caspases com aumento da clivagem de caspase 3 após 3 horas de incubação com HF nas amostras de células Kasumi-1 e após 12 horas para as células THP-1. Bandas correspondentes a forma clivada de PARP foram identificadas em amostras de células Kasumi-1 após 12 horas de tratamento e nas amostras de células THP-1 após 3 horas de tratamento. Usando a metodologia de Proteome Profiler TM Array - HumanPhospho-Kinase Array para rastreio de proteinas fosforiladas pelo tratamento com HF, detectamos que houve modulação de 3 proteínas diferencialmente para as duas linhagens, 9 proteínas moduladas exclusivamente nas células Kasumi-1 e 6 exclusivamente nas células THP-1 . Entre as alterações mais relevantes, destacamos a diminuição da fosforilação de Stat3 e Stat5 nas células Kasumi-1 e a diminuição das formas fosforiladas de p53 nas células THP-1. Nossos achados confirmam o efeito pró-apoptótico da HF, sobretudo nas células Kasumi-1, e sugerem que este efeito envolva a diminuição das fosforilações de Stat3 e de Stat5. / Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous hematological disorder characterized by the clonal expansion of immature myeloid cells exhibiting different types of genetic and epigenetic alterations. A diagnosis is established when a patient presents >= 20% of blast in the bone marrow or in the peripheral blood. The WHO classifies AML in seven subtypes depending on the morphology, immunophenotype, genetics and clinical presentation of the cells. The most common treatment until nowadays is chemotherapy in combination with cytarabine and anthracycline and furthermore also the application of immunotherapeutic agents. Although researchers have attempted to develop new agents targeting directly specific mutations such as FLT3, further studies are necessary to find new therapeutic approaches for other leukemic subtypes aside from acute promyelocytic leukemia (APL). Halofuginone (HF) is a halogenated derivate of Febrifugine, which is a molecule isolated from the plant Dichroa febrifuga. It has been demonstrated that Halofuginone exhibits antifibrotic, anti-cancerogenic, anti-inflammatory and pro-apoptotic properties. We evaluated the induction of apoptosis of HF in the AML cell lines Kasumi-1,THP-1, MV4-11, U937 e OCIAML3, we verified the sensitivity and resistance of these cell lines after treatment, performed a cell cycle analysis, analyzed the activation of proteins associated with apoptosis and the proteins associated with cell proliferation and survival. We established that the Kasumi-1 cell line was sensitive to the treatment of HF displaying a dose IC50 of 125, 58 ng/ml, while the THP-1 cell lines presented resistance displaying a dose IC50 of 786,15 ng/ml . When treated with HF, the Kasumi-1 cell line stopped in the S phase of the cell cycle displaying significant decrease of proliferation, while HF showed no significant on THP-1. Furthermore we performed a western blot and It was demonstrated that the cleavage of caspase 3 appeared after 3 hours of treatment in Kasumi-1 and after 12 hours of treatment in THP-1, while cleavage of caspase 9 appeared after 12 hours in both cell lines. PARP was cleaved in Kasumi-1 after 12 hours of HF treatment, whereas the cleavage of PARP in THP-1 remained the same after 3 hours of treatment. Performing the methodology of Proteome Profiler TM Array - HumanPhospho-Kinase Array we detected 3 proteins modulated in both cell lines, 9 proteins were modulated only in Kasumi-1 cells and 6 in THP-1 cells. Amongst the different tyrosine kinases and signaling pathways that were modulated, we observed that the phosphorylation of Stat3 and Stat5 was diminished in Kasumi-1, while THP-1 presented iii decreased phosphorylation of p53. Our findings confirm that HF exhibits pro-apoptotic effect on Kasumi-1 and is capable of modulating the various proteins important for cell survival.

Angiogênese é o termo utilizado para descrever o crescimento de novos vasos sanguíneos a partir dos já existentes. Vários estudos demonstraram a densidade microvascular (DMV) como um fator prognóstico nas leucemias, em particular, leucemia promielocítica aguda (LPA). Este subtipo de leucemia corresponde a cerca de 20 a 25% das leucemias mielóides agudas nos países latino-americanos e apresenta características clínicas, morfológicas e biológicas peculiares. A halofuginona (HF), originalmente descrita como um agente antifúngico apresenta capacidade de inibir o crescimento tumoral e formação de vasos em modelos animais de tumores sólidos. Estudos realizados por nosso grupo demonstraram que a HF inibiu a secreção do VEGF e a proliferação de linhagens celulares de LPA. Desta forma, o presente trabalho teve por objetivo determinar o potencial antiproliferativo e antiangiogênico da HF em um modelo experimental in vivo da LPA e avaliar os mecanismos subjacentes a sua ação. Primeiramente, a análise do ciclo celular em células NB4 tratadas com HF apresentou significativa diminuição da proliferação celular (2,093 ± 0,304 vs. 41,21 ± 3,25), juntamente com um aumento significativo da apoptose (12,53 ± 1,53 vs. 21,95 ± 0,79; p=0,0007). Por meio da técnica de Real Time Array foi possível identificar dois grupos de genes associados a apoptose celular diferencialmente expressos em células tratadas com HF: TNF, TNFRSF9, TNFTSF10B, CD40, FAS, CASP10, CASP8 e CASP3, sugerindo que a HF induz a via extrínseca de apoptose. A análise in vivo da HF foi realizada em camundongos NOD/SCID previamente irradiados e transplantados com células leucêmicas PML-RAR murinas. Camundongos tratados com HF, por 21 dias após o transplante não apresentaram remissão molecular, determinada pela amplificação do gene PML-RARA por PCR, porém foi observada menor infiltração leucêmica em relação aos camundongos não tratados (Leucócitos: 4,2 ± 3,89 vs. 20,6 ± 21,9; p<0.0001); Hemoglobina: 12,0 ± 1,40 vs. 9,6 ± 1,67; p<0.0001; e Plaquetas: 932,0 ± 122,5 vs. 552,0 ± 83,2; p<0.001 respectivamente) e um menor peso relativo do baço (0,006 vs. 0,012, p=0,0415). Ademais, a contagem diferencial e imunofenotipagem da medula óssea evidenciaram menor porcentagem de células mielóides imaturas (16,88 ± 6,27 vs. 44,06 ± 27,06). A HF também foi capaz de inibir a fosforilação de SMAD2 e consequentemente bloquear a via do TGF- em células NB4. No entanto, animais leucêmicos apresentaram menor nível sérico de TGF- em relação aos saudáveis e tratados (475,58 vs. 1.378,45/1.146,82 pg/mL; p<0,0001), sugerindo que o blasto leucêmico produz esta citocina e a diminuição de células leucêmicas resultou em diminuição dos níveis séricos de TGF-. A HF não aumentou a sobrevida dos animais leucêmicos e a elevação das enzimas hepáticas sugeriu que o tratamento foi hepatotóxico. Por fim, com relação à angiogênese, a análise da expressão gênica mostrou que o tratamento com HF inibiu a expressão de VEGF e EGF e o estudo por imunohistoquímica de seções da medula óssea evidenciou menor expressão VEGF (30 vs. 80%, p=0,0227), porém não houve diminuição da DMV. O conjunto desses resultados mostrou que a angiogênese é um importante alvo terapêutico na LPA, e que apesar da toxicidade, a HF apresenta potencial antileucêmico, tanto por conta de seus efeitos antiproliferativos e próapoptóticos, quanto por sua capacidade de inibir a produção de fatores próangiogênicos. / Angiogenesis is the term used to describe the growth of new blood vessels from the existing ones. Several studies have demonstrated the microvascular density (MVD) as a prognostic factor in leukemia, particularly acute promyelocytic leukemia (APL). This subtype of leukemia corresponds to 20-25% of acute myeloid leukemia in Latin America and presents clinical, morphological and biological peculiar characteristics. The halofuginone (HF) originally described as an antifungal agent has ability to inhibit tumor growth and vessel formation in animal models of solid tumors. Our group demonstrated that HF inhibits the VEGF secretion and cell proliferation in APL cell lineages. Thus, this study aimed to determine the antiproliferative and antiangiogenic potential of HF in an experimental model of APL in vivo and evaluate the mechanisms underlying its action. First, the cell cycle analysis in NB4 cells treated with HF showed a significant decrease in cell proliferation (2.093 ± 0.304 vs. 41.21 ± 3.25), along with a significant increase in apoptosis (12.53 ± 1.53 vs . 21.95 ± 0.79, p = 0.0007). Through Real Time Array it was possible to identify two groups of apoptosis associated genes differentially expressed in HF treated cells: TNF, TNFRSF9, TNFTSF10B, CD40, FAS, CASP10, CASP8 and CASP3, suggesting that HF induces apoptosis by extrinsic pathway. In vivo analysis of HF was performed in irradiated NOD/SCID mice transplanted with murine PML-RAR leukemic cells. Mice treated with HF for 21 days after transplantation showed no molecular remission as determined by amplification of PML-RARA gene by PCR, however minor leukemic infiltration was observed compared to untreated mice (leukocytes: 4.2 ± 3.89 vs . 20.6 ± 21.9, p <0.0001), hemoglobin: 12.0 ± 1.40 vs. 9.6 ± 1.67, p <0.0001, and Platelets: 932.0 ± 122.5 vs. 552.0 ± 83.2, p <0.001 respectively) and a lower relative weight of spleen (0.006 vs. 0.012, p = 0.0415). Furthermore, the differential count and immunophenotyping of bone marrow showed a lower percentage of immature myeloid cells (16.88 ± 6.27 vs. 44.06 ± 27.06). The HF was also able to inhibit the SMAD2 phosphorylation and consequently block the TGF- pathway in NB4 cells. However, leukemic animals presented lower serum TGF- compared to the healthy and treated (475.58 vs. 1378.45/1146.82 pg / mL, p <0.0001), suggesting that the leukemic blasts produces this cytokines and the decrease in leukemic cells resulted in decreased serum levels of TGF-. The HF did not increase the survival of leukemic animals and elevated liver enzymes suggested that the treatment was hepatotoxic. Finally, regarding angiogenesis, gene expression analysis showed that the HF treatment inhibited the expression of VEGF and EGF and the study by immunohistochemistry of sections of bone marrow showed less VEGF expression (30 vs. 80%, p = 0 0227), but there was no decrease in the MVD. Taken together, these results showed that angiogenesis is an important therapeutic target in APL, and despite the toxicity, HF has antileukemic potential, for both the antiproliferative and proapoptotic effects, and also for its ability to inhibit the production of proangiogenic factors.

Malaria is a treatable communicable disease yet remains a common cause of death and disease especially among pregnant women and children. Most of malaria's worldwide burden disproportionately lies in Southeast Asia and Sub-Saharan Africa. Western medicine's 100+ year history of combating Plasmodium falciparum has taught us that the global population of malaria parasites has a unique and dangerous ability to rapidly evolve and spread drug resistance. Recently it was documented that resistance to the first-line antimalarial artemisinin may be developing in Southeast Asia.

Angiogênese é o termo utilizado para descrever o crescimento de novos vasos sanguíneos a partir dos já existentes. Vários estudos demonstraram a densidade microvascular (DMV) como um fator prognóstico nas leucemias, em particular, leucemia promielocítica aguda (LPA). Este subtipo de leucemia corresponde a cerca de 20 a 25% das leucemias mielóides agudas nos países latino-americanos e apresenta características clínicas, morfológicas e biológicas peculiares. A halofuginona (HF), originalmente descrita como um agente antifúngico apresenta capacidade de inibir o crescimento tumoral e formação de vasos em modelos animais de tumores sólidos. Estudos realizados por nosso grupo demonstraram que a HF inibiu a secreção do VEGF e a proliferação de linhagens celulares de LPA. Desta forma, o presente trabalho teve por objetivo determinar o potencial antiproliferativo e antiangiogênico da HF em um modelo experimental in vivo da LPA e avaliar os mecanismos subjacentes a sua ação. Primeiramente, a análise do ciclo celular em células NB4 tratadas com HF apresentou significativa diminuição da proliferação celular (2,093 ± 0,304 vs. 41,21 ± 3,25), juntamente com um aumento significativo da apoptose (12,53 ± 1,53 vs. 21,95 ± 0,79; p=0,0007). Por meio da técnica de Real Time Array foi possível identificar dois grupos de genes associados a apoptose celular diferencialmente expressos em células tratadas com HF: TNF, TNFRSF9, TNFTSF10B, CD40, FAS, CASP10, CASP8 e CASP3, sugerindo que a HF induz a via extrínseca de apoptose. A análise in vivo da HF foi realizada em camundongos NOD/SCID previamente irradiados e transplantados com células leucêmicas PML-RAR murinas. Camundongos tratados com HF, por 21 dias após o transplante não apresentaram remissão molecular, determinada pela amplificação do gene PML-RARA por PCR, porém foi observada menor infiltração leucêmica em relação aos camundongos não tratados (Leucócitos: 4,2 ± 3,89 vs. 20,6 ± 21,9; p<0.0001); Hemoglobina: 12,0 ± 1,40 vs. 9,6 ± 1,67; p<0.0001; e Plaquetas: 932,0 ± 122,5 vs. 552,0 ± 83,2; p<0.001 respectivamente) e um menor peso relativo do baço (0,006 vs. 0,012, p=0,0415). Ademais, a contagem diferencial e imunofenotipagem da medula óssea evidenciaram menor porcentagem de células mielóides imaturas (16,88 ± 6,27 vs. 44,06 ± 27,06). A HF também foi capaz de inibir a fosforilação de SMAD2 e consequentemente bloquear a via do TGF- em células NB4. No entanto, animais leucêmicos apresentaram menor nível sérico de TGF- em relação aos saudáveis e tratados (475,58 vs. 1.378,45/1.146,82 pg/mL; p<0,0001), sugerindo que o blasto leucêmico produz esta citocina e a diminuição de células leucêmicas resultou em diminuição dos níveis séricos de TGF-. A HF não aumentou a sobrevida dos animais leucêmicos e a elevação das enzimas hepáticas sugeriu que o tratamento foi hepatotóxico. Por fim, com relação à angiogênese, a análise da expressão gênica mostrou que o tratamento com HF inibiu a expressão de VEGF e EGF e o estudo por imunohistoquímica de seções da medula óssea evidenciou menor expressão VEGF (30 vs. 80%, p=0,0227), porém não houve diminuição da DMV. O conjunto desses resultados mostrou que a angiogênese é um importante alvo terapêutico na LPA, e que apesar da toxicidade, a HF apresenta potencial antileucêmico, tanto por conta de seus efeitos antiproliferativos e próapoptóticos, quanto por sua capacidade de inibir a produção de fatores próangiogênicos. / Angiogenesis is the term used to describe the growth of new blood vessels from the existing ones. Several studies have demonstrated the microvascular density (MVD) as a prognostic factor in leukemia, particularly acute promyelocytic leukemia (APL). This subtype of leukemia corresponds to 20-25% of acute myeloid leukemia in Latin America and presents clinical, morphological and biological peculiar characteristics. The halofuginone (HF) originally described as an antifungal agent has ability to inhibit tumor growth and vessel formation in animal models of solid tumors. Our group demonstrated that HF inhibits the VEGF secretion and cell proliferation in APL cell lineages. Thus, this study aimed to determine the antiproliferative and antiangiogenic potential of HF in an experimental model of APL in vivo and evaluate the mechanisms underlying its action. First, the cell cycle analysis in NB4 cells treated with HF showed a significant decrease in cell proliferation (2.093 ± 0.304 vs. 41.21 ± 3.25), along with a significant increase in apoptosis (12.53 ± 1.53 vs . 21.95 ± 0.79, p = 0.0007). Through Real Time Array it was possible to identify two groups of apoptosis associated genes differentially expressed in HF treated cells: TNF, TNFRSF9, TNFTSF10B, CD40, FAS, CASP10, CASP8 and CASP3, suggesting that HF induces apoptosis by extrinsic pathway. In vivo analysis of HF was performed in irradiated NOD/SCID mice transplanted with murine PML-RAR leukemic cells. Mice treated with HF for 21 days after transplantation showed no molecular remission as determined by amplification of PML-RARA gene by PCR, however minor leukemic infiltration was observed compared to untreated mice (leukocytes: 4.2 ± 3.89 vs . 20.6 ± 21.9, p <0.0001), hemoglobin: 12.0 ± 1.40 vs. 9.6 ± 1.67, p <0.0001, and Platelets: 932.0 ± 122.5 vs. 552.0 ± 83.2, p <0.001 respectively) and a lower relative weight of spleen (0.006 vs. 0.012, p = 0.0415). Furthermore, the differential count and immunophenotyping of bone marrow showed a lower percentage of immature myeloid cells (16.88 ± 6.27 vs. 44.06 ± 27.06). The HF was also able to inhibit the SMAD2 phosphorylation and consequently block the TGF- pathway in NB4 cells. However, leukemic animals presented lower serum TGF- compared to the healthy and treated (475.58 vs. 1378.45/1146.82 pg / mL, p <0.0001), suggesting that the leukemic blasts produces this cytokines and the decrease in leukemic cells resulted in decreased serum levels of TGF-. The HF did not increase the survival of leukemic animals and elevated liver enzymes suggested that the treatment was hepatotoxic. Finally, regarding angiogenesis, gene expression analysis showed that the HF treatment inhibited the expression of VEGF and EGF and the study by immunohistochemistry of sections of bone marrow showed less VEGF expression (30 vs. 80%, p = 0 0227), but there was no decrease in the MVD. Taken together, these results showed that angiogenesis is an important therapeutic target in APL, and despite the toxicity, HF has antileukemic potential, for both the antiproliferative and proapoptotic effects, and also for its ability to inhibit the production of proangiogenic factors.

M. S.