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Brominated Skeletal Components of the Marine Demosponges, Aplysina cavernicola and Ianthella basta: Analytical and Biochemical Investigations

Kunze, Kurt, Niemann, Hendrik, Ueberlein, Susanne, Schulze, Renate, Ehrlich, Hermann, Brunner, Eike, Proksch, Peter, Pée, Karl-Heinz van 28 November 2013 (has links)
Demosponges possess a skeleton made of a composite material with various organic constituents and/or siliceous spicules. Chitin is an integral part of the skeleton of different sponges of the order Verongida. Moreover, sponges of the order Verongida, such as Aplysina cavernicola or Ianthella basta, are well-known for the biosynthesis of brominated tyrosine derivates, characteristic bioactive natural products. It has been unknown so far whether these compounds are exclusively present in the cellular matrix or whether they may also be incorporated into the chitin-based skeletons. In the present study, we therefore examined the skeletons of A. cavernicola and I. basta with respect to the presence of bromotyrosine metabolites. The chitin-based-skeletons isolated from these sponges indeed contain significant amounts of brominated compounds, which are not easily extractable from the skeletons by common solvents, such as MeOH, as shown by HPLC analyses in combination with NMR and IR spectroscopic measurements. Quantitative potentiometric analyses confirm that the skeleton-associated bromine mainly withstands the MeOH-based extraction. This observation suggests that the respective, but yet unidentified, brominated compounds are strongly bound to the sponge skeletons, possibly by covalent bonding. Moreover, gene fragments of halogenases suggested to be responsible for the incorporation of bromine into organic molecules could be amplified from DNA isolated from sponge samples enriched for sponge-associated bacteria.
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Transformation von Arabidopsis thaliana mit bakteriellen Halogenasen zur Erzeugung neuer halogenierter Metabolite

Walter, Antje 11 September 2018 (has links)
Halogenierte Verbindungen treten in der Natur in einer großen Vielzahl auf. Ihre Funktionen können sehr vielfältig sein und reichen von antimikrobiellen Aktivitäten bis hin zu pflanzlichen Wachstumsregulatoren. Vor allem in Pilzen und Bakterien gibt es eine Reihe halogenierter Substanzen. Die Synthesewege und beteiligten Enzyme dieser Verbindungen sind weitestgehend aufgeklärt. Bei einer Klasse von halogenierenden Enzymen handelt es sich um Flavin-abhängige Tryptophan-Halogenasen, welche die Aminosäure Tryptophan regioselektiv und substratspezifisch an bestimmten Positionen des Indolrings halogenieren können. Tryptophan ist eine essenzielle Aminosäure, welche sehr vielfältige Funktionen innerhalb der Zellen besitzt. So wird diese in Polypeptidketten von Enzymen und Proteinen eingebaut und dient als Vorstufe für viele verschiedene Stoffwechselprodukte. Das Pflanzenhormon Indol-3-Essigsäure (IAA) leitet sich z. B. aus ebendieser Aminosäure ab. Pflanzenhormone haben sehr vielfältige Funktionen innerhalb der Pflanzen und spielen z. B. bei der Entwicklung, Differenzierung und Abwehr eine wichtige Rolle. In einigen Pflanzen konnte eine halogenierte Form von IAA, die 4-Chlorindol-3-Essigsäure, nachgewiesen werden. In verschiedenen Versuchen konnte gezeigt werden, dass diese Verbindung eine erhöhte Reaktivität gegenüber der nicht halogenierten Form aufweist. Die Wirkung dieser Substanz wurde in den letzten Jahrzehnten gut untersucht, über die an der Synthese beteiligten Enzyme dieses Pflanzenhormons ist jedoch kaum etwas bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Gene von drei bakteriellen Tryptophan-Halogenasen (pyrH, thiH und prnA) in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana exprimiert und die Bildung von chlorierten Substanzen genauer untersucht. Hauptaugenmerk wurde dabei auf mögliche chlorierte Metabolite gelegt, welche sich von der Aminosäure Tryptophan ableiten. Neben der Expression der bakteriellen Halogenasegene wurden diese zusätzlich für die Modellpflanze optimiert und unter der Kontrolle des 2× 35S-Promotors in Arabidopsis thaliana transformiert. Die heterologe Expression von AtpyrH, AtthiH, AtprnA, sowie der optimierten Gene AtpyrHopt, AtthiHopt und AtprnAopt konnte in verschiedenen transgenen Linien in den Pflanzen nachgewiesen werden. Die Expression der Halogenasegene variiert dabei in den untersuchten Linien. Durch die Optimierung konnte keine erhöhte Expression der Gene erzielt werden. Lediglich bei der Expression von AtpyrHopt zeigte sich ein erhöhtes Niveau der Genregulation im Vergleich zu AtpyrH. Der Nachweis, dass die transgenen Arabidopsis thaliana-Pflanzen, welche eines der Halogenasegene exprimieren, in der Lage sind die Aminosäure an der entsprechenden Position (5, 6 oder 7) zu halogenieren konnte für alle stabil transformierten Gene erbracht werden. Zusätzlich gelang es, die Halogenase-Enzyme aus transgenen Pflanzen von AtpyrH und AtpyrHopt anzureichern und deren Funktionsfähigkeit in einem Enzym-Test nachzuweisen. Es konnten ebenfalls weitere chlorierte Intermediate detektiert werden, welche u. a. Vorläufermoleküle des Hormons IAA aber auch weiterer Substanzen wie z. B. Camalexin sind. Für Arabidopsis thaliana-Wildtyp konnte die Möglichkeit zur Bildung von Cl-IAA durch die Zugabe von chloriertem Tryptophan gezeigt werden. Die an der Biosynthese beteiligten Enzyme können das chlorierte Substrat verwenden und dem Stoffwechsel zuführen. Die Bildung der chlorierten Verbindungen erfolgte in den transgenen Arabidopsis thaliana-Pflanzen ohne eine zusätzliche Expression einer Flavin-Reduktase. Das für die Halogenierungsreaktion notwendige FADH2 kann durch die Pflanzen selbst zur Verfügung gestellt werden. Die unterschiedliche Regulation der Gene führte bei den transgenen Linien nicht zu phänotypischen Unterschieden. Sowohl die Entwicklung der Pflanzen, als auch die Anzahl und Größe der Rosettenblätter entspricht dem Wildtyp und ist durch die Bildung chlorierter Verbindungen nicht beeinflusst. In verschiedenen Tests wurde die erhöhte Bioaktivität sowohl von chloriertem Tryptophan als auch chlorierter IAA in in vitro Experimenten mit verschiedenen Pflanzen bestätigt. Chlorierte IAA hemmte zusätzlich dazu das Wachstum des Bakteriums Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. In phytopathologischen Untersuchungen mit verschiedenen transgenen Pflanzen zeigte sich, dass Linien von AtthiHopt, AtprnA und AtprnAopt mitunter eine verbesserte Resistenz gegen bestimmte Pathogene aufweisen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Bildung von chloriertem Tryptophan und chloriertem Indol-3-Acetonitril durch die heterologe Expression von Flavin-abhängigen Tryptophan-Halogenasen in Arabidopsis thaliana sowohl durch die ursprünglichen bakteriellen, als auch die optimierten Gene möglich ist.

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