Dans les écosystèmes forestiers, les communautés fongiques du sol sont extrêmement diverses et de nombreux facteurs environnementaux structurent et influencent les espèces qui les constituent. Les plantes sont des éléments structurant majeurs des espèces fongiques, car elles sont à l’origine de l’enrichissement des sols en carbone. L’écologie microbienne a fortement bénéficié des apports de la biologie moléculaire, mais l’analyse de la diversité des champignons forestiers à l’échelle du peuplement reste dépendante des outils de génotypage à haut débit. Ainsi, pour permettre l’investigation à large échelle de la diversité fongique et étudier les facteurs structurant de ces communautés, nous avons développé et validé deux générations de phyloarrays basé sur l’identification moléculaire des espèces à partir de l’ADN ribosomal nucléaire. La dernière génération a été mise au point pour identifier simultanément près de 10 000 espèces issues de différents phyla du règne fongique. Pour la première fois, nous avons utilisé ces phylochips pour décrire la richesse fongique des sols forestiers et évaluer l’impact de différents arbres hôtes sur les communautés ectomycorhiziennes et ses dynamiques temporelles. Parallèlement à ce développement technologique, nous avons exploité les très récentes techniques de séquençage massif (pyroséquençage) pour générer et analyser plus de 180 000 séquences, amplifiées à partir d’échantillons d’ADN de sols issus de 6 plantations d’essences forestières différentes. Ces deux nouvelles approches confirment, par des analyses profondes de la diversité fongique, un fort impact de l’essence forestière sur la communauté fongique et une préférence d’hôte chez les espèces mycorhiziennes, comme chez les saprotrophes. A un niveau taxonomique supérieur, nos travaux montrent une distribution relativement homogène des différentes familles du sous-règne Dykaria (ascomycètes et basidiomycètes), marquant également le caractère ubiquiste des ces microorganismes. / In forest ecosystems, fungal communities are highly diverse since several environmental factors influence their richness and structure. Host plant composition is one of the major factors, as the main input of carbohydrates into soil is plant-derived. Ecological research of fungal communities was hindered by the lack of high-throughput diagnostic tools. To ease the large-scale identification of fungi, we have constructed and validated two generations of ribosomal DNA phylochips. The last generation of developed phylochips carried species-specific probes for about 10,000 fungal species spread over the whole fungal kingdom. We applied the developed phylochips to describe the impact of host trees on ectomycorrhizal communities over the time scale of one year. Furthermore, we monitored the diversity of fungal communities under six different host trees by generating over 180,000 sequences using 454 pyrosequencing approach. Results of both techniques revealed a high influence of the different tree species on soil fungal community composition, richnesse and abundance. Furthermore, host preference was observed for most of the ectomycorrhizal and saprotrophic fungi. However, host preference appeared mainly on species level, but not on family level showing also the ubiquistic character of some of the microorganisms.

Les fréquences de fonctionnement des transistors des dernières technologies silicium supérieures à 200GHz favorisent les recherches de systèmes de communication travaillant à des fréquences de plus en plus élevées. Cette montée en fréquence permet le transfert de données multi-gigabits et la conception de systèmes compacts. Un système de communication puce à puce sans fil multi-gigabits à 140GHz a été conçu afin d’améliorer voire supplanter les interconnexions filaires inter-puces dont les débits de données sont limitées. Il peut également être utilisé pour améliorer la testabilité des puces sur wafer en rendant possible le test sans contact. Les architectures de communication à annulation de bruit de phase de type self-hétérodyne et self-homodyne, étudiées durant ces travaux de recherche, sont basées sur l’émission du signal porteur en plus du signal modulé, simplifiant ainsi la génération de fréquence des parties émettrice et réceptrice. En effet, en gamme de fréquences millimétriques, les topologies nécessitant un système de récupération de la fréquence porteuse ou de synchronisation de fréquence sont complexes et énergivores. Une modulation tout ou rien (OOK) a de ce fait été retenue pour la réalisation du démonstrateur. La chaîne d’émission/réception ainsi que les antennes a été implémenté en technologie BiCMOS SiGe:C 0.13µm. La surface totale du circuit avec les antennes est de 0.31mm². Un transfert de données jusqu’à 14Gbps a été réalisé à une distance de 0.6mm avec une efficacité énergétique de 5.7pJ/bit. A partir du circuit réalisé, une démonstration à 140GHz en modulation QPSK self-hétérodyne a également été effectuée. L’EVM est de 27% à 10Gbps. / The transistors operating frequencies are well above 200GHz in the last silicon technology nodes. These performances have encouraged the research of the communication systems operating at millimeter wave frequencies. Such performances allow higher and higher multi-gigabit data rate and also more compact communication systems with on Silicon integrated antennas.The objective of this research work was to design a multi-gigabit wireless chip to chip communication system at 140GHz. Such a short-range communication system could be designed to improve or replace the inter-chip interconnects where data rates are limited. Secondly this communication system could also be used to improve the testability of on wafer dies by performing contactless test. The communication system with phase noise cancelation topology specifically self-heterodyne and self-homodyne, studied during the research work, are based on the carrier signal emission in addition to the modulated signal simplifies the frequency synthesis of the emitter and receiver parts. Millimeter wave frequency communication systems are conventionally based on carrier frequency recovering system that is complex and consumes a lot of energy. An On-Off Keying (OOK) modulation has been selected and all the parts of the transceiver have been designed in 0.13μm SiGe:C BiCMOS technology. The silicon area of the circuit is 0.31mm² including the antennas. This transceiver achieves a data rate up to 14Gbps at a distance of 0.6mm with an energy efficiency of 5.7pJ/bit. Moreover a self-heterodyne QPSK demonstration at 140GHz was performed with an EVM of 27% to 10Gbps.

Les Dystrophies des Ceintures sont des maladies génétiques affectant les différents muscles du corps à des degrés de sévérité variables. Les facteurs à l’origine de ces différences d’atteinte musculaire ne sont pas identifiés.Les travaux de cette thèse visent à identifier des différences moléculaires existant dans des conditions normales entre des muscles présentant une différence d’atteinte dans des conditions de déficience génétique associée à un phénotype de Dystrophie des Ceintures. Nous basant sur l’hypothèse que les différences d’atteinte entre muscles seraient causées par des mécanismes de modification de l’expression de gènes protecteurs du muscle ou le sensibilisant à la dystrophie, nous avons exploré ces mécanismes par une approche globale en comparant la signature de différents muscles. Des analyses par séquençage haut-débit chez le Primate ont permis de mettre en évidence plusieurs gènes et éléments régulateurs dont l’expression est différente entre les muscles sensibles et les muscles résistants à la pathologie. Certaines de ces différences sont conservées dans le modèle murin. Nous avons ensuite exploré par quels mécanismes les éléments régulateurs identifiés pourraient intervenir dans la sélectivité d’atteinte. Les résultats de cette thèse permettent d’approfondir la compréhension des mécanismes physiopathologiques des Dystrophies des Ceintures. Ils pourront également servir de base à la mise en place de nouveaux traitements pour ce groupe de maladies. / Limb Girdle Muscular Dystrophies are a group of genetic diseases affecting the muscles of the body with different degrees of severity. The factors behind these differences of impairment have not been identified.The objective of this thesis work is to identify the molecular differences existing in normal condition between muscles known to show a difference of impairment in case of genetic deficiencies asssociated with Limb Girdle Muscular Dystrophy. We based our work on the assumption that the differences of impairment between muscles would be caused by mechanisms leading to modifications of the expression of protective or sensitizer genes in the muscle. Therefore, we explored these mechanisms through a global approach. Analyses by high-throughput sequencing in Primate muscles allowed the identification of several genes and regulatory elements whose expression differs between the sensitive and the resistant muscles. These genes interact in a common network of interactions, which could be targeted for therapeutic purpose. Some of these differences were shown to be conserved in the mouse. We then explored the mechanisms by which the identified regulatory elements may be involved in selectivity of impairment. The results of this thesis provide a deeper understanding of the pathophysiological mechanisms of Limb Girdle Muscular Dystrophies. They will also pave the way for the development of new treatments for this group of diseases.

Les viroïdes sont des agents pathogènes responsables de maladies affectant les plantes telles que l'avocatier, le pêcher, la tomate, la pomme dé terre, etc. Parce qu'ils dégradent la qualité des fruits et des légumes qu'ils infectent, les viroïdes sont la cause de la perte d'environ 50 % de la production mondiale des cultures touchées. La compréhension des mécanismes couvrant l'infection aux viroïdes constitue un enjeu économique majeur visant l'amélioration de la productivité, dans l'exploitation de ces plantes. Cette étude aborde l'analyse des processus liés à l'infection aux viroïdes par la découverte de nouveaux aspects caractérisant la variabilité génétique du viroïde de la mosaïque latente du pêcher (PLMVd). Elle décrit la dynamique des populations de PLMVd. La grande variabilité de PLMVd, expliquée par un fort taux de mutations, implique la génération de séquences diverses et variées, prenant la forme de nuages. Notre approche pour comprendre cette variabilité génétique de PLMVd consiste à infecter un pêcher à partir d'une seule séquence de PLMVd, puis à en extraire les séquences et analyser leurs caractéristiques intrinsèques par une nouvelle méthode bio-informatique. À notre connaissance, notre étude, à ce jour, est la première à utiliser les récentes techniques de séquençage à haut débit, à des fins d'analyses des viroïdes. La structure relativement simple des viroïdes, brin d'ARN circulaire d'environ 240 à 400 nucléotides, leur confère l'avantage de pouvoir être séquencé dans leur longueur totale par le séquençage à haut débit. Ce dernier couvre de grands volumes de données biologiques, ce qui convient pour séquencer les nuages de séquences qu'on peut retrouver au sein de la population de PLMVd. En bio-informatique, il existe de nombreux algorithmes permettant de comparer des séquences pour en extraire de l'information. L'un des défis majeurs de ces algorithmes est la prise en charge efficace et rapide de quantité de données en constante croissance. Dans le cadre de notre étude, le volume de séquences généré par PLMVd rend impraticable l'application des algorithmes d'alignement pour comparer les séquences et en estimer leurs similarités. D'autres algorithmes tels que ceux basés sur les N-grammes impliquent une perte partielle de l'information contenue dans les séquences. Nous avons donc utilisé une mesure de similarité basée sur le modèle de probabilité conditionnelle (CPD) qui nous permet d'une part, de conserver l'information sous forme de patrons (sous-séquences) contenus dans les séquences, et d'autre part, d'éviter l'alignement de séquences tout en comparant directement chaque séquence avec un ensemble de séquences. Le modèle CPD est intégré dans un nouvel algorithme de segmentation pour les séquences catégoriques, appelé DHCS. Cette étude révèle de nouveaux aspects dans la variabilité génétique de PLMVd. En effet, elle nous a permis d'une part d'extraire des familles de séquences caractérisées par des mutations spécifiques, puis d'autre part, de représenter la distribution de ces mutations dans une arborescence. Par la suite, elle a favorisé l'observation de mutations localisées dans le noyau d'un motif particulier, nommé le ribozyme en tête de marteau des séquences, servant à l'amélioration de l'adaptation de PLMVd. Celui-ci est effectivement sujet à mutations parce que la séquence inoculée au pêcher après 6 mois d'infections n'a pas été retrouvée et que le nombre de mutations enregistrées varie de 2 à 51. Des deux librairies obtenues, nous avons répertorié 1125 et 1061 séquences pour un total de 2186 nouvelles séquences de PLMVd. Seules 300 séquences étaient connues à ce jour. Nous avons observé que les séquences possèdent, selon la librairie, en moyenne 4.6 et 6.3 mutations par rapport à la séquence inoculée. Certaines d'entre elles ont jusqu'à 20 % de dissimilarité par rapport à la séquence inoculée, ce qui est considérable. Grâce à DHCS, les différentes séquences ont pu être groupées en familles, au nombre de 7 et 8 selon la librairie.

Le screening de catalyseurs de Fischer-Tropsch destinés à une application en colonne à bulle, est souvent un processus long, réalisé en autoclaves. Le passage à un screening haut débit en réacteur milli-lit fixe permet de fournir des données sur l’activité et la sélectivité d’un plus grand nombre de catalyseurs en un minimum de temps. Les travaux de cette thèse s’attachent à répondre aux multiples questions que posent la comparaison d’essais réalisés en autoclaves versus milli-lit fixe. / Nowadays, catalyst screening for a Fischer-Tropsch application in slurry bubble column reactors is often a slow process, performed in small autoclave reactors. High throughput experimentation in micro packed bed reactors could accelerate it and provide activity and selectivity for a large number of catalysts, in a short time. This research thesis work aimed at addressing the numerous issues related to the comparison of results obtained in these two different reactors.

Depuis le développement rapide des méthodes de séquençage à haut débit (SHD) en écologie moléculaire, les moisissures ont eu moins d’attention que les bactéries et les virus, en particulier dans les études de bioaérosols. Les études d'exposition aux moisissures dans différents environnements sont limitées par les méthodes de culture traditionnelles qui sousestiment le large spectre de moisissures pouvant être présentes dans l'air. Bien que certains problèmes de santé soient déjà associés à une exposition fongique, le risque peut être sousestimé en raison des méthodes utilisées. L’application du séquençage à haut débit dans des échantillons de sol par exemple a permis de mieux comprendre le rôle des moisissures dans les écosystèmes. Cependant, la littérature n'est pas clair quant à la région génomique à utiliser comme cible pour l'enrichissement et le séquençage des moisissures. Cette thèse vise à déterminer laquelle des deux régions universellement utilisées, ITS1 et ITS2, convient le mieux pour étudier les moisissures dans l’air. Durant le développement de la méthode moléculaire, un autre défi, touchant la perte de cellules fongiques lors de la centrifugation d'échantillons d'air liquide à des fins de concentration, s’est rajouté. Ainsi, cette thèse décrit une nouvelle méthode de filtration pour remédier à la perte due à la centrifugation. Ces deux objectifs représentent la première partie de la thèse qui se concentre sur le développement de méthodes: le traitement des échantillons d’air avant extraction de l’ADN et la meilleure région à cibler avec la méthode SHD. La deuxième partie consiste à appliquer la méthodologie développée pour caractériser l'exposition aux moisissures dans trois environnements de travail différents: le compost, la biométhanisation et les fermes laitières. Les résultats montrent que la région d’ITS1 a surpasser ITS2 en couvrant davantage de diversité dans les bioaérosols. En raison de profils taxonomiques complémentaires, l'auteur de la thèse suggère d'utiliser les deux régions pour couvrir la plupart des taxons lorsque la taxonomie constitue le principal intérêt de l'étude. Cependant, ITS1 devrait être le premier choix dans les autres études, principalement en raison de la grande diversité et de la similarité des profils taxonomiques obtenus par l’approche métagénomique et l’approche ciblant ITS1. De plus, la nouvelle approche de filtration proposée constitue une meilleure alternative pour compenser la perte fongique due à la centrifugation. Ensemble, ces méthodes ont permis une meilleure description de l’exposition aux moisissures en milieu professionnel / Since the rapid development of high-throughput sequencing methods in molecular ecology, fungi have been the underdogs of the microbial world, especially in bioaerosol studies. Particularly, studies describing fungal exposure in different occupational environments have been limited by traditional culture methods that underestimate the broad spectrum of fungi present in the air. There are potential risks in the human inhalation of fungal spores in an occupational scenario where the quantity and diversity of fungi is high. Although some health problems are already known to be associated with fungal exposure in certain work environments, the risk may be underestimated due to the methods used. Applying high-throughput sequencing in soil samples has helped the explanation of the fungal role in ecosystems. However, the literature is not decisive in terms of the genomic region to use as target for the enrichment and sequencing of fungi. The present thesis deals with the challenge of determining which region from the two universally used regions, ITS1 and ITS2, is best suited for study of fungal aerosols. In tandem with this challenge came another of addressing the loss of fungal cells during the centrifugation of liquid impaction air samples for purposes of concentration. This thesis describes a new filtration-based method to circumvent such losses during centrifugation. These two challenges represent the first part of the thesis, which focuses on methodology development. In synopsis, the treatment of air samples prior to DNA extraction is considered, along with the identification of the best region to target in amplicon-based high throughput sequencing. In the second part of the thesis, the focus turns to the application of the developed methodology to characterize fungal exposure in three different work environments: compost, biomethanization, and dairy farms. All three are of special interest due to potentially high fungal exposure. Results show that ITS1 outperformed ITS2 in disclosing higher levels of fungal diversity in aerosol samples. Due to complementarity in the taxonomic profiles disclosed by the two regions, the author suggests the use of both regions to cover the greatest possible number of taxa when taxonomy is the main interest of the study. However, ITS1 should be the first choice in other studies, mainly because of the high diversity it reveals and its concordance with results obtained via shotgun metagenomic profiling. In addition, the new filtration-based approach proposed in this work might be the best alternative available for compensating the loss of propagules in centrifugation done prior to DNA extraction. Taken together, these methods allowed a profound characterization of fungal exposure in occupational environments.

L’infection broncho-pulmonaire représente le problème majeur des malades atteints de la mucoviscidose. Plusieurs bactéries sont connues depuis des dizaines années comme les principaux agents responsables de ces infections (par exemple Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia, Achromobacter xylosoxidans…). Récemment, certains genres fongiques notamment les champignons filamenteux (comme Aspergillus, Scedosporium…) ont été identifiés comme des pathogènes émergeants ou ré-émergeants pouvant être responsables d’infection invasive. Ainsi, la détection des microorganismes impliqués dans ces colonisations et/ou infections respiratoires demeure importante sur le plan physiopathologique et clinique.Si la culture microbiologique reste la méthode la plus utilisée à ce jour pour le diagnostic des infections microbiennes, elle ne permet pas d’identifier les microbes non-cultivables ou difficiles à cultiver. Depuis quelques années, grâce au développement de la technique moléculaire de séquençage à haut-débit (next generation sequencing ou NGS), plusieurs études ont montré que l’écologie microbienne du poumon des patients atteints de la mucoviscidose est très complexe et correspond à une flore poly-microbienne, appelée le microbiote pulmonaire, comprenant non seulement des bactéries mais également des micromycètes (levures et/ou champignons filamenteux) et des virus et phages. Une dysbiose (modification en abondance et diversité) de cette flore pourrait influencer la fonction respiratoire et l’état clinique du patient.Alors que le microbiome bactérien et son rôle en pathogenèse sont largement étudiés, peu d’études ont porté sur la composante fongique (mycobiote/mycobiome) du microbiote pulmonaire. Notre travail de thèse s’inscrit dans les différents projets développés au sein de l’axe de recherche « Microbiote pro- et eucaryote pulmonaire » coordonné par le Pr Laurence Delhaes dans l’équipe Biologie et Diversité des Pathogènes Eucaryotes Emergeants (BDPEE) dirigée par le Dr Eric Viscogliosi. Il se focalise sur l’analyse NGS du microbiote pro- et eucaryotique respiratoire chez les patients atteints de la mucoviscidose et notamment la comparaison de différentes approches méthodologiques en vue d’une optimisation et standardisation de la méthode.Dans un premier temps, nous présenterons une synthèse des connaissances actuelles d’une part des phénomènes de colonisations/infections fongiques chez les patients atteints de mucoviscidose et d’autre part dans le domaine du microbiote pulmonaire et surtout du mycobiote pulmonaire autour duquel notre équipe se focalise.2Dans un deuxième temps, nous avons travaillé à mieux adapter l’approche NGS aux études du microbiote pulmonaire dans la mucoviscidose. En effet, le séquençage à haut-débit est une technique puissante mais pour laquelle des biais peuvent être introduits à de nombreuses étapes méthodologiques. Un des biais les plus importants est que l’approche NGS ne permet pas de différencier les microorganismes vivants, des cellules mortes ou endommagées, ni de l’ADN extracellulaire. Dans le contexte de notre travail –celui du microbiote pulmonaire chez des patients atteints de mucoviscidose et souvent exposés aux antibiotiques par voie intraveineuse à forte dose, l’analyse NGS pourrait évaluer incorrectement l’abondance et la diversité de ce microbiote pulmonaire. Un prétraitement des échantillons par propidium monoazide (PMA), qui permet de cibler sélectivement l’ADN des cellules vivantes, pourrait être une solution pour palier à cette limite. Notre étude avait donc comme objectif de déterminer si un prétraitement par PMA des expectorations modifiait le microbiote pro- et eucaryote pulmonaire analysé par NGS. Nous discutons l’intérêt et la relevance clinique de cette approche « PMA - NGS » permettant une quantification isolée des microorganismes vivants dans le contexte de la mucoviscidose. / Chronic pulmonary infection results in an irreversible decline in lung function in patients with cystic fibrosis (CF). While several bacteria are known as main causes for these infections (for example: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia, Achromobacter xylosoxidans...), more recently some fungal genera including filamentous fungi (such as Aspergillus, Scedosporium...) have also been identified as emerging or re-emerging pathogens able to cause invasive mycosis. Thus, the identification of the microorganisms involved in the respiratory colonizations and/or infections has become essential.Still now culture methods remain the gold standard for diagnostic of microbial infections. However, it could not identify non-culturable or difficult-to-cultivate microorganisms. Thanks to the development of high-throughput sequencing (next generation sequencing or NGS), recent studies have shown that the lung of patients with CF is a complex poly-microbial flora, also called the CF lung microbiota, which includes not only bacteria but also fungi (yeast and/or filamentous fungi), and viruses and phages. Dysbiosis (loss of abundance and/or diversity) of the lung microbiota has been associated with the patient's decreased lung function and poor clinical status.While lung bacteriota and its role in pathogenesis have widely been studied, few research studies focus on the fungal component (mycobiota/ mycobiome) of the lungs. Our thesis (PhD work) focuses on NGS analysis of pro- and eukaryotic lung microbiota in CF patients, in particular on the comparison of different methodological approaches to optimize and standardize the NGS protocol. This project has been developed under the supervision of Pr. Laurence Delhaes in the “Biology and Diversity of Eukaryotic Emerging Pathogens” team directed by Dr. Eric Viscogliosi.Firstly, we present a state of art on the current knowledge on the fungal colonization/infections risk in CF as well as the development of new concepts of lung microbiota and lung mycobiota on which our team focuses.Secondly, we applied the NGS approach to study the pro- and eukaryotic microbiota in the sputum samples of CF patient lung. Indeed, NGS is a powerful technique that may introduce biases on numerous methodological steps. One of the most important biases is that this technique could not differentiate among the living microorganisms, the dead or damaged cells, and the extracellular DNA. In the context of the CF lung microbiota which is often exposed to high-dose intravenous antibiotics, the analysis by NGS might evaluate4inaccurately the abundance and the diversity of the lung microbiota. Pretreatment of samples by propidium monoazide (PMA), which can target selectively the DNA of viable cells, could be a solution to overcome this limitation. Our study aimed to determine whether a sample pretreatment with PMA modified the lung pro- and eukaryotic microbiota analyzed by NGS. We discuss the clinical relevance of this approach "PMA - NGS" in the context of CF patients to a better quantification of living microorganisms.

Le travail présenté dans ce manuscrit porte sur la recherche de nouveaux membres de la famille des dioxygénases α-cétoglutarate et fer dépendantes (α-KAO) et leur application en synthèse organique. Dans un premier, ce travail a consisté à chercher de nouvelles enzymes selon une approche génomique basée sur l’homologie de séquence et le partage d’un motif InterPro. Deux criblages haut débit avec 79 et 127 enzymes candidates ont ensuite été effectués sur des panels constitués respectivement de 23 et 36 substrats, structurellement plus ou moins proches des substrats métaboliques. Huit nouvelles α-KAO ont ainsi pu être découvertes. Parmi ces huit nouvelles α-KAO, quatre ont été étudiées plus en détail. Après optimisation des conditions de réaction pour chaque enzyme, des montées en échelle ont été réalisées pour caractériser les produits formés. A partir de ces quatre enzymes, la (3S)-3-hydroxy-L-lysine, un dérivé cyclisé de la (4R)-4-hydroxy-L-lysine, (3S)-3-hydroxy-L-ornithine et un dérivé de la (3S)-3-hydroxy-L-arginine ont pu être produits. Nous avons proposé une synthèse biocatalytique de mono et dihydroxydiamines en couplant une ou deux α-KAO avec une décarboxylase. Les (2S)-1,5-diamino-2-pentanol, 1,5-diamino-3-pentanol, (2S)-1,4-diamino-2-butanol et (2S,3S)-1,5-diamino-2,3-pentanediol ont ainsi été obtenus avec de bonnes conversions. / The work described in this manuscript deals with the search of new members of the α-ketoglutarate and Iron-dependent dioxygenases family (α-KAO) and their applications in organic synthesis. The first part of this work presents the search of new enzymes through a genomic approach based on sequence homology and InterPro motif sharing. Two high-throughput screenings with 79 and 127 candidate enzymes have been performed on 23 and 36 substrates more or less structurally close to known metabolic substrates. 8 new α-KAOs have been discovered. Among these new enzymes, four were studied in more details. After optimization of the enzymatic reaction conditions for each enzyme, scale-up allowed to obtain compounds for isolation and characterization. With these four enzymes, (3S)-3-hydroxy-L-lysine, (4R)-4-hydroxy-L-lysine as its cyclic derivative, (3S)-3-hydroxy-L-ornithine and a derivative of (3S)-3-hydroxy-L-arginine were produced. Two of the new α-KAO were combined in a cascade process to afford the (3R,4R)-3,4-dihydroxy-L-lysine as its cyclic derivative. We proposed a biocatalytic synthesis of mono and hydroxydiamines by coupling one or two α-KAO with a decarboxylase enzyme. (2S)-1,5-diamino-2-pentanol, 1,5-diamino-3-pentanol, (2S)-1,4-diamino-2-butanol and (2S,3S)-1,5-diamino-2,3-pentanediol were obtained with good overall conversions.

Dans ce mémoire, nous abordons le problème de la correction d'erreurs systématiques et de la recherche des composés prometteurs (i.e. «hits») dans les procédures de criblage à haut débit (HTS). Nous introduisons une nouvelle approche pour la correction des erreurs systématiques dans les procédures HTS et la comparons à quelques méthodes couramment utilisées. La nouvelle méthode, appelée «well correction» ou correction par puits, procède par une analyse des erreurs systématiques localisées au niveau des puits, à travers toute la procédure de criblage. Cette méthode permet une amélioration des résultats obtenus lors de la sélection des «hits», par des méthodes utilisant un seuil prédéfini. La correction par puits à montré des résultats supérieurs aux méthodes suggérées dans la littérature telles que: correction par soustraction de l'arrière-plan («background correction» : Kevorkov et Makarenkov, 2005a, 2005b); «median-polish» et «B score» (Brideau et al., 2003; Malo et al., 2006). Nous avons également comparé trois méthodes de recherche des «hits» utilisant des approches de groupement (i.e. «clustering»): k-mean; somme des distances inter-cluster moyennes (SASD) et distance moyenne entre clusters (AICD). Ces méthodes proposent des algorithmes différents pour mesurer la distance entre les données provenant du criblage. Les méthodes de groupement utilisant k-means et SASD ont montré des résultats intéressants, mais aucune des méthodes étudiées n'a montré des performances pouvant justifier son utilisation dans tous les cas de figure. Un logiciel, «HTS Corrector», a été développé dans le cadre de ce travail. Il intègre toutes les méthodes étudiées dans ce mémoire. D'autres fonctionnalités auxiliaires, pouvant aider le praticien dans l'analyse des résultats provenant d'une procédure HTS, ont aussi été intégrées. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Criblage à haut débit, High-throughput Screening, Erreurs systématiques, Correction de données, Méthodes de groupement, Recherche de hits, Normalisation de données.

Le cancer est une maladie du génome. La transformation tumorale résulte de l’acquisition de mutations somatiques via divers processus mutagènes opérant tout au long de la vie du patient. Les mécanismes à l’origine des mutations incluent les erreurs de réplication, les défauts de réparation de l’ADN, les modifications de base spontanées ou catalysées par des enzymes cellulaires, et l’exposition à des agents mutagènes endogènes (ROS) ou exogènes (tabac, UV…). Au cours de ma thèse, j’ai analysé des données de séquençage exome et génome complet de tumeurs hépatiques pour décortiquer les mécanismes à l’origine des mutations dans ces tumeurs, leur interaction avec les facteurs de risque, les processus cellulaires, les gènes drivers, et leur évolution au cours de la maladie. J’ai utilisé des méthodes statistiques existantes et dévoloppé des outils bioinformatiques innovants pour:- extraire les signatures de mutations et de réarrangements structuraux à l’aide de données de séquençage à haut débit- identifier les facteurs de risque et/ou les altérations génétiques à l’origine de chacune- prédire les mécanismes mutagènes à l’origine de chaque mutation somatique- explorer les corrélations entre la densité des mutations et les processus cellulaires comme la réplication et la transcription- reconstruire l’histoire clonale des tumeurs et dater l’apparition des signatures mutationnelles et des aberrations chromosomiques.Ces approches innovantes m’ont permis d’identifier 10 signatures mutationnelles: 5 signatures ubiquitaires à l’œuvre dans toutes les tumeurs hépatiques mais modulées par les facteurs de risque (sexe, alcool, tabac), et 5 signatures sporadiques opérant dans moins de 5% des tumeurs et associées à des étiologies connues (aflatoxine B1, acide aristolochique) ou restant à identifier. J’ai aussi mis en évidence 6 signatures de réarrangements structuraux, notamment des phénotypes duplicateurs et déléteurs, spécifiques de petits groupes de tumeurs. Chaque processus mutagène est modulé différemment par la réplication et la transcription. Les signatures liées à des molécules formant des adducts sur l’ADN (hydrocarbures polycycliques aromatiques, aflatoxine B1, acide aristolochique) sont nettement moins actives dans les gènes fortement exprimés suite à l’action du transcription-coupled repair, alors que la signature 16, liée à l’alcool, présente un motif unique de transcription-coupled damage. Une corrélation étonnante entre la densité des petites insertions et délétions (indels) et l’expression des gènes a été identifiée, conduisant à une accumulation considérable d’indels dans les gènes très forterment exprimés dans les cellules hépatiques. Enfin, l’histoire clonale des tumeurs hépatiques montre l’évolution des signatures mutationnelles au cours du temps et identifie l’accumulation de gains chromosomiques multiples comme un évènement tardif entraînant probablement une croissance de la tumeur jusqu’à une taille détactable en clinique. Ces résultats nous éclairent sur les mécanismes à l’origine des altérations génomiques dans l’histoire naturelle des cancers du foie. / Cancer is a disease of the genome. A normal cell goes rogue and is transformed into a cancerous cell due to acquired somatic mutations in its genome. The catalogue of these somatic mutations observed in the cancer genome is the outcome of multiple mutational processes that have been operative over the lifetime of a patient. These mutational processes that have occurred throughout the development of cancer may be infidelity of the DNA replication machinery, impaired DNA repair system, enzymatic modifications of DNA, or exposures to exogenous or endogenous mutagens. Each mutational process leaves a characteristic pattern – a “mutational signature” on the cancer genome. Various genomic features related to genome architecture, including DNA replication and transcription, modulate these mutational processes. During my PhD, I analyzed whole exome and whole genome sequencing data from liver tumors to understand the mutational processes remodeling these tumor genomes, their interaction with risk factors, cellular processes, and driver genes, and their evolution along the tumor histories. For that aim, I used existing statistical methods and I developed innovative computational tools to:- extract mutational and structural variant signatures from next-generation sequencing data- identify risk factors or genetic alterations underlying each process- predict the mutational process at the origin of each somatic mutation- explore correlations between mutation rates and cellular processes like replication and transcription- reconstruct the clonal history of a tumor and the timing of mutational processes and copy-number changes These innovative analytical strategies allowed me to identify 10 mutational signatures: 5 ubiquitous signatures operative in every liver cancer but modulated by risk factors (gender, alcohol, tobacco), and 5 sporadic signatures operative in <5% of HCC and associated with specific known (aflatoxin B1, aristolochic acid) or unknown mutational processes. I also identified 6 structural variant signatures, including striking duplicator or deletor phenotypes in rare tumors. Each mutational process showed a different relationship with replication and transcription. Signatures of bulky DNA adducts (polycyclic aromatic hydrocarbons, aflatoxin B1, aristolochic acid) strongly decreased in highly expressed genes due to transcription-coupled repair, whereas the alcohol-related signature 16 displayed a unique feature of transcription-coupled damage. A striking positive correlation between indel rate and gene expression was observed, leading to recurrent mutations in very highly expressed tissue-specific genes. Finally, reconstructing the clonal history of HCC revealed the evolution of mutational processes along tumor development and identified synchronous chromosome duplications as late events probably leading to fast tumor growth and clinical detection of the tumor. Together, these findings shed new light on the mechanisms generating DNA alterations along the natural history of liver cancers.