Orientador: Marcio Francisco Colombo / Banca: Marcelo Matos Santoro / Banca: Flávio Augusto Vicente Seixas / Resumo: A ligação do O2 à Hemoglobina (Hb) é um processo regulado por interações alostéricas. Os íons Inositol hexafosfato (IHP) e cloreto, e prótons, são efetores alostéricos que estabilizam a Hb na estrutura quaternária T, diminuindo a afinidade da proteina pelo O2 em meio alcalino. A ligação de IHP também altera a cooperatividade de algumas hemoglobinas como, por exemplo a hemoglobina desArg, uma variante da HbAo da qual o resíduo arginina 141 das cadeia alfas foram retirados enzimaticamente. Estas argininas são prováveis sitios de interação com ions cloreto. Neste trabalho investigou-se a influência que a ligação de ânions Cl - e/ou IHP à Hb nas propriedades funcionais e conformacionais da proteína. Foi determinado o efeito destas interações na afinidade e cooperatividade de ligação de oxigênio à proteína, na liberação de prótons com a oxigenação ( efeito Bohr ), e na conformação da proteína. O papel de resíduos específicos nestes efeitos foi investigado comparando resultados obtidos com HbAo, Hb-desArg, e Hb Chesapeake (R92L), um mutante natural na qual a arginina 92 esta substituída por leucina. Os resultados mostraram que a retirada do resíduo C-terminal da cadeia alfa, arginina 141, suprimiu a cooperatividade da hemoglobina, diminui o número de prótons liberados durante a oxigenação, e que esta liberação de prótons foi a mesma na presença ou ausência de íons cloreto. Ainda, a retirada deste resíduo não interferiu no efeito Bohr dependente de IHP. Os resultados mostraram que a saturação de oxigênio ligados à HbA0 na presença de IHP não induziu a mudança na estrutura quaternária observada na ausência deste ânion, e na sua presença em meio com NaCl. Apesar disto, a cooperatividade da ligação é mantida. A arg-141α tem papel fundamental na estabilização pelo IHP da estrutura quaternária... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The hemoglobin (Hb) oxygenation is a molecular process regulated by allosteric interactions. Inositol hexaphosphate (IHP), chloride and protons are heterotropic effectors that stabilizes the deoxy state, the quaternary structure T, decreasing O2 affinity in alkaline solution. IHP binding also modifies cooperativity of several Hbs, such as desArg Hemoglobin, a variant form of HbA which is obtained by enzymatic cleavage of the two Arg-141alfa residues. This residue has been identified to be a Cl - binding site on Hb. This work follows up previous studies of the structure- function regulation of Hb oxygenation by anions Cl - and/or IHP. We measured the effect of these interactions on cooperativity and oxygen affinity, protons release upon oxygenation (Bohr Effect), and protein conformation. The role of specific residues on this effect was investigated trough results obtained with HbA, desArg Hemglobin and Hemoglobin Chesapeake (R92L), a natural mutant in which Arg- 92α is changed to Leu. The results showed that the suppression of C-terminal Arg-141 implies in non- cooperative O2-binding to Hemoglobin, lowering the protons released during oxygenation, and the protons release remains the same on chloride absence and presence. The removal of this residue didn't affect the Bohr Effect on IHP presence. The results showed that O2 binding in the presence of IHP don't induce quaternary structure transition observed in the absence of anions. Nevetheless, the cooperativity was maintained. The arg-141 have a main role on IHP stabilization of oxy and deoxy protein quaternary structure T. This conclusion is supported by results desArg Hemoglobin oxygenation determined in IHP presence, with and without NaCl. Calorimeters assays of IHP interaction with three Hemoglobin species, carried through Isothermal Titration Calorimetry confirm the Arg-141 importance on oxygenated... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Marcio Francisco Colombo / Banca: Flávio Augusto Vicente Seixas / Banca: Richard John Ward / Banca: Gustavo Orlando Bonilla-Rodriguez / Banca: Marinômio Cornélio Lopes / Resumo: A hemoglobina (Hb) e uma proteina tetramerica cuja principal funcao e o transporte de oxigenio. As moleculas de O2 se ligam cooperativamente a proteina, com afinidade crescente com a saturacao. O favorecimento a energia de ligacao se deve a mudanca da estrutura quaternaria da proteina, ou seja, da conformacao T de baixa afinidade para a conformacao R de alta afinidade, induzida pela ligacao do ligante. Decorrente desta mudanca conformacional ha um aumento da area de superficie proteica acessivel ao solvente (ASA), na transicao do estado totalmente desoxigenado (T) para o estado totalmente oxigenado (R). Esta variacao de ASA pode ser medida, em solucao, utilizando-se o metodo de estresse osmotico (COLOMBO et al., 1992). Neste trabalho, determinamos o numero de moleculas de agua ( nw) que se liga a diferentes especies de Hb na transicao desoxiHboxiHb. Este valor varia de especie para especie, e dentro de cada especie e maior na presenca de NaCl do que na ausencia deste sal. A ligacao preferencial do anion cloreto a conformacao T da Hb altera sua estrutura terciaria, o que reflete em mudancas no valor de nw de oxigenacao medidos na ausencia e na presenca deste anion. Como referenciado, os valores de nw de oxigenacao foram determinados em solucao pelo metodo de estresse osmotico, isto e, a partir da determinacao da dependencia de P50 com a atividade de agua (aw). Mostramos que diferentes especies de Hb, em diferentes condicoes de solucao, alem de terem valores de nw de oxigenacao distintos, apresentam valores diferentes de H de oxigenacao ( Hobservado). Os valores de nw e de Hobservado, determinados para as especies de Hb Equina adulta (HbEq), Bovina adulta (HbBovad) e fetal (HbBovfet) em diferentes condicoes experimentais, em conjunto com valores de nw e Hobservado para as hemoglobinas das especies Humana (HbA0) e do molusco Scapharca inaequivalvis (HbI)...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Hemoglobin (Hb) is a tetrameric protein whose main function is oxygen transport. Four O2 molecules bind cooperatively to the protein. The cooperative stepwise increasing in O2-affinity with protein saturation is bound to the change in the protein's quaternary structure from the low O2- affinity conformation (T-state) to the high O2-affinity conformation (R-state) induced by ligand binding. Upon the T'R transition, the water accessible surface area (ASA) of the protein increase, with a consequent binding of extra water molecules to the protein. The change in hydration associated with the ASA can be determined in solution using the osmotic stress method (COLOMBO et al., 1992). In this work, we determined the number of water molecules ( nw) that bind to different Hb specie in the T'R transition. This value changes from specie to specie, and is larger in presence of NaCl than in absence for all specie. In this work we had also determined the enthalpy change of Hb oxygenation ( Hobs) for the different specie and at varied conditions where the value of nw of oxygenation were observed to vary. nw and Hobs values determined for the Equine adult (HbEq), Bovine adult (HbBovad) and fetal (HbBovfet) Hb in different experimental conditions, and nw and Hobs values previously determined for Human (HbA0) and for the mollusk Scapharca inaequivalvis (HbI) hemoglobins, we correlated and analyzed in order to determine the enthalpy and entropy changes associated with the binding of extra water molecules to the newly exposed protein surface upon oxygenation. We have found that 'ÂHsol, the heat change of protein hydration, is approximately -0,57Kcal/mol.H2O. This parameter represents the enthalpic cost of protein hydration in aqueous solution. The entropic cost, ÂSsol, was estimated as approximately -2,89cal/mol.K.H2O. At 298K, the free energy...(Complete abstract click electronic access below) / Doutor