OBJETIVO: Evaluar si existe relación entre el nivel de hemoglobina glicosilada y la presencia de periodontitis crónica. MATERIALES Y MÉTODOS: se evaluaron 77 pacientes, 64 varones y 13 mujeres, se agruparon en dos grupos en función a si presentaban o no periodontitis crónica asociada a placa dental. Los datos fueron recolectados en una ficha de recolección donde se tomaron datos de edad, género, índice de masa corporal (IMC) y antecedentes de dislipidemias, adicionalmente, se llenaron los periodontogramas para establecer al grupo de pertenencia de los pacientes, se les envió a laboratorio clínico para recabar y procesar las muestras de hemoglobina glicosilada. Todos los pacientes firmaron el consentimiento informado. RESULTADO: se obtuvo un 5,58% de HbA1c para el grupo con periodontitis crónica, y un 5,31% para el grupo sin periodontitis, valores sin ajustar, se determinó estadísticamente una diferencia significativa (P=0,000), al realzar el estudio de las variables de riesgo, se obtuvo que no hay influencia estadística del género ni del IMC. Aun considerando estos factores de riesgo la diferencia seguía siendo significativa (P=0,001). No se halló una diferencia significativa (P=0,921) entre los varones (5,58%) y mujeres (5,60%) con periodontitis crónica. En el grupo de pacientes sin periodontitis crónica tampoco hubo diferencia significativa (P=0,230) entre varones (5,33%) y mujeres (5,29%). CONSLUSIONES: Se encontró una diferencia estadísticamente significativa en el porcentaje de Hemoglobina Glicosilada y la presencia de Periodontitis Crónica. No se halló diferencia significativa en los pacientes en función al género, tanto en el grupo con periodontitis crónica, como aquellos que no presentaban periodontitis crónica. El análisis de factores de riesgo, mostró que las causales de los niveles elevados de porcentaje de Hemoglobina Glicosilada fueron la presencia de periodontitis crónica, edad del paciente y la presencia de dislipidemias, más no del género y el Índice de Masa Corporal (IMC). La periodontitis crónica está relacionada con valores elevados de Hemoglobina Glicosilada, ya sea de manera directa, o aun relacionado a factores de riesgo. PALABRAS CLAVE: Periodontitis Crónica – Hemoglobina Glicosilada / --- OBJECTIVE: To evaluate the correlation between the level of glycosylated hemoglobin and the presence of chronic periodontitis. MATERIALS AND METHODS: 77 patients, 64 men and 13 women were evaluated were grouped into two groups according to whether or not Chronic periodontitis associated with dental plaque. Data were collected in a data sheet where took it data on age, gender, body mass index (BMI) and a history of dyslipidemia, additionally, periodontogram were filled to set the membership group of patients, were sent to clinical laboratory to collect and process samples glycosylated hemoglobin. All patients signed informed consent. RESULTS: HbA1c was 5.58% for the group with chronic periodontitis, and 5.31% for the group without periodontitis, unadjusted values, determined it statistically significant difference (P = 0.000), in conducting the study of risk variables it obtained no statistical influence of gender or BMI. Even considering these risk factors remained significant difference (P = 0.001). No significant differences were found (P = 0.921) among men (5.58%) and women (5.60%) with chronic periodontitis .In the group of patients without chronic periodontitis there is no significant difference (P = 0.230) between males (5.33%) and women (5.29%). CONCLUSIONS: A statistically significant difference was found in the percentage of Hemoglobin and the presence of chronic periodontitis. No significant difference was found in patients according to gender, both in the group with chronic periodontitis, such as those without chronic periodontitis. The analysis of risk factors showed that the causes of the high levels of percentage of Hemoglobin were the presence of chronic periodontitis, patient age and the presence of dyslipidemia, but not gender and Body Mass Index (BMI). Chronic periodontitis is associated with elevated levels of glycosylated hemoglobin, either directly, or even related to risk factors. KEYWORDS: Chronic Periodontitis – Glycosylated Hemoglobin / Tesis

Orientador: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Banca: Flávio Augusto Vicente Seixas / Banca: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Banca: Mário Sérgio Palma / Banca: Arno Rudi Schwantes / Doutor

As leucemias são neoplasias que afetam o sistema hematopoiético e compreendem 2,53% dos casos de câncer relatados. Entre as leucemias, 27,95% correspondem a casos de leucemia mielóide crônica (LMC), que apresenta como marcador genético o cromossomo Philadelphia (Ph). Presente em mais de 80% dos casos, o cromossomo Ph é derivado da translocação t(9;22) (q34;q11), que origina um gene híbrido entre a região 5´ do gene bcr e 3´do gene abl. O produto deste gene é uma proteína Bcr-Abl na qual a atividade reguladora e nuclear do domínio tirosina quinase, originado da proteína Abl, torna-se constitutiva e citoplasmática. Estas mudanças na atividade tirosina quinase afetam diferentes vias de sinalização, com consequências em vários processos celulares como adesão, proliferação e apoptose. Em nível fisiológico, foi mostrado tanto in vitro quanto in vivo que as células hematopoiéticas precursoras Ph+ se diferenciam principalmente em células eritróides. Entretanto, quase 70% dos pacientes com LMC sofrem anemia, mostrando que, as células Ph+ diferenciadas em células eritróides não conseguem amadurecer até hemácias funcionais. Isto faz da LMC um bom modelo para o estudo da diferenciação de células eritróides e suas características, como os fatores que afetam a sintese de hemoglobina (Hb). A linhagem K562 é uma linhagem celular eritroleucêmica Ph+, amplamente utilizada como modelo para estudar drogas com capacidade anti-proliferativa e/ou indutoras da síntese de hemoglobina fetal. Entre estas drogas encontram-se a aclarrubicina (ACLA) e doxorrubicina (DOX) que, embora sejam análogos químicos pertencentes à família das antraciclinas, possuem mecanismos de ação diferentes e ainda não completamente esclarecidos. Neste trabalho, foram investigados vários aspectos da biologia das células K562 durante o tratamento com estas drogas. Foi observado que o tratamento com DOX produz um aumento de tamanho nas células e bloqueio do ciclo celular na fase G2/M, afetando também grandemente a viabilidade celular, com 70% de células mortas no sétimo dia de tratamento. Já durante o tratamento com ACLA a viabilidade, tamanho e ciclo celular foram menos afetados, com aproximadamente 15% de células mortas no sétimo dia de tratamento e um bloqueio transitório do ciclo na fase G1. No entanto, as duas drogas causaram um aumento significativo da síntese de hemoglobina, principalmente DOX que induziu um aumento quase duas vezes maior que o induzido por ACLA. A análise da expressão gênica realizada através da técnica de differential display mostrou várias bandas diferencialmente representadas e com diversas cinéticas de expressão, apresentando semelhanças e diferenças quando são comparados os dois tratamentos ou células tratadas e controle. Destas bandas, 26 estão sequenciadas mostrando genes envolvidos em vários processos celulares como dano do DNA, resistência a drogas, processamento do RNA e codificação de proteinas relacionadas com ferro. Das bandas sequenciadas, 7 foram validadas por RT-PCR (ndrg1, erk2, nf2l2, atp6ap1, rfc1, phf20 e zkscan) sendo observado um aumento na sua expressão durante o tratamento, com exceção de ndrg1 para o qual a expressão foi induzida em vez de aumentada e nf2l2 onde a diferença com o controle foi pequena e não permitiu validar este gene como diferencialmente expresso. Com o objetivo de procurar por mecanismos comuns entre os vários indutores da síntese de hemoglobina em células K562, estes genes foram também analisados durante o tratamento destas células com os indutores hidroxiuréia e dGTP. Além de induzirem a expressão de hemoglobina, os dois tratamentos provocaram um aumento no tamanho das células tratadas e um bloqueio no ciclo celular na fase S. Visando futuros trabalhos envolvendo os genes diferencialmente expressos, foi ainda otimizado um sistema de transferência gênica por eletroporação. Para isto foram testados varios parâmetros como campo elétrico, resistência, capacitância, meios de eletroporação, manipulação das células e uso de inibidores de DNAses. Como resultado, foi alcançado com o eletroporador padrão uma eficiência de transfecção de 81%, similar àquela alcançada pelo nucleoporator (eletroporador de última geração). As condições estabelecidas foram 750 V/cm, resistência infinita, 500 μF, meio RPMI1640, centrifugação e sulfato de zinco pós-pulso. A relação das antraciclinas e a hidroxiuréia, assim como de outros indutores da síntese de hemoglobina, com o ferro intracelular, juntamente com a diferença na expressão, durante o tratamento, de genes afetados direta ou potencialmente pela não disponibilidade de ferro intracelular, nos permitiu gerar uma hipótese para a via de sinalização que leva à síntese de hemoglobina. Nesta, sinais de falta ou não disponibilidade de ferro nas células ativariam a maquinaria celular para a captação e internalização do ferro extra-celular, simultaneamente com síntese de proteínas que utilizam o ferro para realizar as suas funções biológicas, entre elas a hemoglobina. Do mesmo modo, propomos a via de sinalização do ferro como um alvo potencialmente afetado por drogas indutoras da síntese de hemoglobina, como as antraciclinas, cujos alvos são ainda pouco conhecidos. Contudo, mais genes desta via de sinalização, bem como outros indutores, deveram ser estudados para saber se a síntese de hemoglobina pode ser induzida por drogas mais específicas e com menos efeitos colaterais que aquelas usadas atualmente para o tratamento de câncer e outras doenças.

O presente trabalho caracterizou alguns aspectos enzimáticos da digestão de vitelina e de hemoglobina no carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Um novo protocolo foi desenvolvido para a purificação de uma cisteíno endopeptidase de larvas do carrapato (R. microplus Larval Cysteine Endopeptidase; RmLCE). A seqüência parcial de aminoácidos de RmLCE mostrou similaridade com outra cisteíno endopeptidase descrita neste organismo (Boophilus microplus Cathepsin -L1; BmCL1). Vitelina (Vt), preparada a partir de homogenatos de ovos e larvas de R. microplus, foi degradada diferencialmente por RmLCE e VTDCE (Vitellin-Degrading Cysteine Endopeptidase; uma enzima de atividade semelhante purificada de ovos de R. microplus). RmLCE também apresentou capacidade de degradação de hemoglobina em pH 4,0, e a presença de uma atividade cisteíno endopeptidásica acídica em intestino de larvas foi demonstrada. A atividade peptidásica total, presente em homogenatos de ovos, larvas e intestino de partenóginas, sobre substrato sintético em pH 4,0, mostrou-se diferencialmente susceptível a inibidores de cisteíno e aspártico endopeptidases (E-64 e pepstatina A, respectivamente). A ação combinada dos dois inibidores inibiu completamente a atividade peptidásica. Estes inibidores também afetaram a degradação de vitelina e hemoglobina por homogenatos de larvas e intestino de partenóginas. A presença de pepstatina A inibiu cerca de 50 % da atividade sobre hemoglobina em larvas, enquanto E-64 foi capaz de inibir completamente a degradação das proteínas por ambos os homogenatos. Um enzima com atividade aspártico endopeptidásica presente em larvas de R. microplus foi parcialmente purificada e identificada por Western blot e seqüenciamento N-terminal como Boophilus Yolk Cathepsin (BYC). Esta enzima foi eluída de uma coluna de gel-filtração em pH ácido associada a uma atividade cisteíno endopeptidásica. A degradação de hemoglobina de forma sinérgica pela aspártico endopeptidase (BYC) e a cisteíno endopeptidase (RmLCE) purificadas de larva indica a existência de uma cascata enzimática responsável pela digestão de hemoglobina. Estes resultados sugerem que RmLCE tem um papel continuo na digestão de vitelina e hemoglobina durante o desenvolvimento de R. microplus.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-04-25T04:10:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 346923.pdf: 20792678 bytes, checksum: eb28875251556262a18b2acedbf0ddc0 (MD5) Previous issue date: 2016 / A reação química que ocorre entre a hemoglobina e o oxigênio é essencial para a manutenção da homeostase do organismo e sobrevivência das células. Essa reação ocorre em quatro etapas reversíveis e consecutivas, onde o ferro de cada grupo heme que compõe a hemoglobina, reage sequencialmente com quatro moléculas de oxigênio de modo cooperativo. A hemoglobina é uma proteína de extrema importância em processos biológicos vitais, cuja função é transportar gases (oxigênio e dióxido de carbono). No presente trabalho, a oxi-hemoglobina foi obtida a partir da redução da meta-hemoglobina, utilizando o agente redutor ditionito de sódio (Na2S2O4). Esse procedimento foi realizado no ?Laboratório de Neuroengenharia Computacional? (Neurolab/UFSC) em uma coluna cromatográfica composta pela resina Sephadex G-25, por meio do método de cromatografia líquida de filtração em gel de exclusão molecular. A quantificação da oxi-hemoglobina foi verificada pelo método de Drabkin e a reação de desoxigenação foi avaliada no equipamento Stopped Flow Mixer 4000/S (SFM 4000/S) pelo método de mistura rápida com fluxo interrompido. Os resultados experimentais obtidos foram utilizados para determinar as constantes cinéticas de um modelo matemático para a reação de desoxigenação da oxi-hemoglobina por um método de otimização híbrido. Comparou-se os resultados com os do modelo de pseudo primeira ordem e constatou-se que o modelo do presente trabalho não só apresenta um resultado com menor erro com relação ao experimental, quanto possibilita uma análise aprofundada da dinâmica dos compostos intermediários da reação. Foi possível constatar também que não é aceitável a definição de um conjunto de constantes cinéticas absolutos, mas pode-se falar em uma região viável, cujo critério é o ordenamento dos seus valores em ordem crescente (k_4 < k_3 < k_2 < k_1) e k_4 dentro de um intervalo entre 40 a 60 s-1.<br> / Abstract : The chemical reaction involving hemoglobin and oxygen is essential for the maintenance of homeostasis and cell survival. This reaction occurs in four reversible and consecutive steps, where the iron of each group composing the heme group of the hemoglobin reacts sequentially and cooperatively with four oxygen molecules. Hemoglobin is a protein of extreme importance in vital biological processes, whose function is to transport gases (oxygen and carbon dioxide). In this study, the oxyhemoglobin was obtained from the reduction of the methemoglobin using the agent reducing sodium dithionite (Na2S2O4). This procedure was performed in the "Computational Neuroengineering Laboratory" (Neurolab/UFSC) in a chromatographic column composed of the resin Sephadex G-25, using the exclusion molecular liquid chromatography method. The quantification of oxyhemoglobin was verified by the Drabkin method and the deoxygenation reaction was evaluated in the equipment Stopped Flow Mixer 4000/S (SFM 4000/S) by rapid mixing method with stopped flow. The experimental results obtained were used to determine the kinetic constants of a mathematical model for deoxygenation reaction of the oxyhemoglobin using a hybrid optimization method. We compared the results with the model of pseudo first order and it is found that the model of the present work not only presents a result with smaller error comparing with the experimental one, as well allows a thorough analysis of the dynamics of the intermediates of the reaction. It was possible observe also that it is not acceptable the definition of a set of kinetic absolute constants, but can think in a feasible region, whose criterion is the ordering of the values in crescent order (k_4 < k_3 < k_2 < k_1) e k_4 and within a range of 40 a 60 s-1.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2002-10-29Bitstream added on 2014-06-13T20:41:34Z : No. of bitstreams: 1 mendes_lcn_dr_jabo.pdf: 366850 bytes, checksum: f17f9a24a35f6a63b085647431bd07eb (MD5) / Quinze eqüinos adultos foram aleatoriamente divididos em 5 grupos com três animais cada, os quais foram inoculados intraperitonealmente com as seguintes suspensões: Grupo 1: 1x109unidades formadoras de colônias (UFC) de E. coli diluídas em 500 mL de solução salina a 0,9% adicionadas de 5 gramas de hemoglobina, Grupo 2: 1x109UFC de B. fragilis diluídas em 500 mL de solução salina a 0,9% adicionadas de 5 gramas de hemoglobina, Grupo 3: 1x109UFC de E. coli em combinação com 1x109UFC de B. fragilis diluídas em 500 mL de solução salina a 0,9% adicionadas de 5 gramas de hemoglobina, Grupo 4: 500 mL de solução salina a 0,9% adicionadas de 5 gramas de hemoglobina e Grupo 5: 500 mL de solução salina a 0,9%. Leucopenia com neutrofilia foram observadas nos grupos 1 e 3 dentro das primeiras seis horas do estudo e aumento da concentração plasmática de fibrinogênio nos eqüinos do Grupo 1 foi observado das 48 até as 120 horas após a inoculação (HAI). Houve aumento significativo na contagem total de células nucleadas do líquido peritoneal dos eqüinos dos Grupos 1, 2, 3 e 4 das 10 HAI até as 120 HAI. Os teores de proteína total do líquido peritoneal aumentaram significativamente das 2 HAI até o término das observações, nos eqüinos do Grupo 1; das 10 HAI até as 72 HAI, nos eqüinos do Grupo 2; das 6 HAI até as 72 HAI, nos eqüinos do grupo 3; e das 4 HAI até as 60 HAI nos eqüinos do Grupo 4, enquanto que aumento dos níveis de fibrinogênio no líquido peritoneal ocorreram das 2 as 120 HAI nos eqüinos do Grupo 1. Hipertermia, taquicardia, taquipnéia, aumento da tensão e sensibilidade da parede abdominal, diarréia, mímica de dor e diminuição dos sons intestinais foram os sinais clínicos mais freqüentemente observados nos eqüinos dos grupos 1, 2, 3 e 4... / Fifteen adult horses were randomly divided into 5 equal groups which was injected intraperitoneally with the following suspension: Group 1: 1x109 colony-forming units (CFU) of E. coli diluted in 500 mL of 0.9% saline plus 5 gr. of hemoglobin, Group 2: 1x109 CFU of B. fragilis diluted in 500 mL of 0.9% saline plus 5 gr. of hemoglobin, Group 3: 1x109 CFU of E. coli in combination with 1x109 CFU of B. fragilis diluted in 500 mL of 0.9% saline plus 5 gr. of hemoglobin, Group 4: 500 mL of 0.9% saline plus 5 gr. of hemoglobin and Group 5: 500 mL of 0.9% saline. Leukopenia with neutropenia was observed in groups 1 and 3 within the first 6 hours of the study and significant increase in plasma fibrinogen concentration in horses of group 1 was observed from 48 till 120 hours after inoculation (HAI). There was a significant increase in total nucleated cell count in peritoneal fluid in horses of groups 1, 2, 3 and 4 from 10 HAI till 120 HAI. Total protein had a significant increase from 2 HAI till the end of the study in G1, from 10 HAI till 72 HAI in G2, from 6 HAI till 72 HAI in G3 and from 4 HAI till 60 HAI in G4, while there was significant increased fibrinogen levels from 2 to 120 HAI in G1. Fever, tachicardia, tachipnea, abdominal wall sensitivity and tension, diarrhoea, colic, decreased borborigmi sounds were the most frequent clinical signs observed in horses of G1, G2, G3 and G4 similarly to others in natural and experimental peritonitis. Animals of Group 5 showed no physical signs alterations. Horses of Groups 2 and 4 demonstrated mild and self-limiting peritonitis, while those of groups 1 and 3 demonstrated clinical signs of higher intensity and duration... (complete abstract, access undermentioned eletronic address)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2001Bitstream added on 2014-06-13T19:42:37Z : No. of bitstreams: 1 hokama_nk_dr_botfm.pdf: 442709 bytes, checksum: 19c729c7bb99de9b488b0c496f8b3922 (MD5) / A hemoglobina, o componente principal do citoplasma eritrocitário, está sujeita à oxidação, fisiologicamente ou por agentes externos, seja através da formação de Metahemoglobina, ou pela oxidação da cisteína β93 por agentes tiois. Impossibilitado de sintetizar proteína, o eritrócito depende primordialmente da via glicolítica, que, além de fornecer ATP, através da integração da formação de NADH e da Via da Hexose Monofosfato, mantém o potencial redutor extremamente eficiente. A presente investigação teve como finalidade avaliar o sistema de óxido-redução eritrocitário, à partir da oxidação da hemoglobina pelas seguintes drogas: a) Nitrito de Sódio, indutora da formação de Metahemoglobina; b) Azul de Metileno, utilizado terapeuticamente e em testes laboratoriais na redução de Metahemoglobina; c) Cistamina, agente tiol, que induz à formação do complexo Hemoglobina-Etilamina, através da oxidação da cisteína β93. Doadores de sangue da Divisão Hemocentro foram convidados a participar do trabalho e tiverem seu sangue coletado após consentimento - 96 - verbal e por escrito. Todos os indivíduos eram do sexo masculino, não anêmicos e sem deficiência de G6PD. Foram utilizados, para os testes, glóbulos lavados, ressuspensos em PBS, pH 7.45, com hemoglobina ajustada entre 11 e 13 g/dl, na presença de glicose e incubados a 37o C com as drogas testadas, nos momentos 10. 90 e 180 minutos de incubação... / Hemoglobin, the essential component of erythrocyte cytoplasm, is physiologically prone to oxidation by external agents, through the formation of Methemoglobin or the oxidation of β93 cysteine by thiol agents. Unable to protein synthesis, the erythrocyte depends essentially on glycolysis, which, besides producing ATP, maintains the highly efficient reduction potential through the integration of NADH production and the Hexose Monophosphate Shunt. The present investigation’s purpose was to evaluate the erythrocyte antioxidant system by studying hemoglobin oxidation by the following substances: a) Sodium Nitrite (SN), a well known Methemoglobin-forming agent; b) Methylene Blue (MB), a Methemoglobin reductant reagent, available for therapeutic and laboratory tests; c) the thiol reagent Cystamine (CI), that reacts with hemoglobin through the β93 cysteine oxidation, forming the Hemoglobin-Ethylamine complex. After informed... (Complete abstract click electronic access below)

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007. / Submitted by Aline Jacob (alinesjacob@hotmail.com) on 2010-01-21T19:05:20Z No. of bitstreams: 1 2007_GiseleFerreiraEsteves.pdf: 4786645 bytes, checksum: 022fe241400fc9eeb51f7a8933799cca (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-01-21T22:29:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_GiseleFerreiraEsteves.pdf: 4786645 bytes, checksum: 022fe241400fc9eeb51f7a8933799cca (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-21T22:29:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_GiseleFerreiraEsteves.pdf: 4786645 bytes, checksum: 022fe241400fc9eeb51f7a8933799cca (MD5) Previous issue date: 2007 / A hemoglobina de Cerdocyon thous (HbCt) foi purificada e cristalizada pelo método de difusão de vapor a 21°C na condição PEG 4000 16%, Hepes-Na 0,1 M pH 7,8. Os dados cristalográficos foram coletados no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS). O grupo espacial do cristal é do tipo P212121, com os eixos da célula unitária de a=52,73; b=84,24 e c=130,28 Å, correspondentes a cristais do sistema ortorrômbico. A estrutura cristalográfica da HbCt foi resolvida até o limite de 2,2 Å de resolução, pelo método de substituição molecular utilizando a estrutura da hemoglobina de Chrysocyon brachyurus (PDB ID: 1FHJ) como modelo. O modelo final obtido após o refinamento foi depositado no PDB com o código 2B7H, apresentando boa qualidade conforme indicado por vários parâmetros, dentre eles, o valor baixo dos fatores de temperatura, o Rfactor de 0,168 e Rfree de 0,232. A estrutura dessa hemoglobina apresenta uma água como ligante do ferro e sua organização estrutural assemelha-se às hemoglobinas do tipo metahemoglobina. A sua estrutura cristalográfica foi utilizada como um modelo de estudo para análise do comprometimento estrutural tridimensional com substituições de aminoácidos em posições específicas. Para isso, foram utilizadas estruturas cristalográficas de hemoglobinas de humano e de cavalo, disponíveis no PDB. Além dessas substituições uma análise detalhada da relação estrutura vs estabilidade foi feita. Por ser uma proteína multimérica, a desnaturação da hemoglobina varia de acordo com a condição de pH e o tipo de desnaturante utilizado. Neste trabalho, o processo de desdobramento da HbCt e da hemoglobina de Pseudalopex vetulus (HbPv) foi realizado para analisar a estabilidade dessas moléculas. Estes ensaios foram acompanhados por fluorescência e dicroísmo circular utilizando a uréia, a guanidina, diferentes pHs e a temperatura como agentes desnaturantes. Além disso, foi analisado o efeito do surfactante catiônico brometo de hexadeciltrimetil amônio (CTAB) na estabilidade das hemoglobinas, por dicroísmo circular. A HbCt é mais estável em pH ácido e mais instável do que a HbPv em pH básico. Esses dados foram comparados com a cianometahemoglobina humana. O CTAB na concentração de 0,5 e 1 mM para HbCt e HbPv, respectivamente estabiliza as hemoglobinas principalmente pelo efeito de hidratação preferencial. Uma análise da relação da estabilidade de hemoglobinas com a estrutura tridimensional foi feita baseando-se nos modelos tridimensionais da HbCt, humana e de cavalo. Comparando com a hemoglobina humana, as modificações apresentadas na HbCt tendem a ser estabilizadoras. Em contrapartida, comparando com a hemoglobina eqüina, as modificações apresentadas na HbCt tendem a ser desfavoráveis para a estabilidade conformacional. As substituições e o comprometimento com a organização estrutural, causadas no ambiente molecular, foram caracterizadas e podem servir de modelo para o desenho racional de proteínas mais estáveis, com vistas à aplicação biotecnológica, como é o caso do desenvolvimento do sangue artificial recentemente descrito na literatura. Esse tipo de estudo pode ser aplicado como um modelo da relação estrutura vs estabilidade de proteínas em geral, mas principalmente para aquelas com maior número de entradas no PDB e que merecem atenção pela função e aplicação biotecnológica. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The hemoglobin from C. thous (HbCt) was purified and crystallized by hanging drop vapor diffusion method at 21oC in 16% PEG 4000, 0.1 M Hepes-Na pH 7.8. The crystallographic data were collected in the National Laboratory of Synchrotron Light (LNLS). The crystals grew in space group P212121 (orthorhombic type) with cell dimensions of a=52.73, b=84.24 and c=130.28 Å. The crystallographic structure of the HbCt was solved at 2.2 Å resolution, by molecular replacement using the structure of the hemoglobin from Chrysocyon brachyurus (pdb 1FHJ)as a search model. The model was refined and deposited in the PDB under the code 2B7H with structural quality indicated by some parameters, among them, the low value of B-factor, the Rfactor of 0.168 and the Rfree of 0.232. The hemoglobin presents one water molecule as ligand of the iron characterizing the methemoglobin form. The structural organization of the subunits of the HbCt is similar to the known hemoglobins. The crystallographic structure of HbCt and hemoglobins from human and horse were used as models to study the structural effects concerning the amino acid substitutions in specific positions and the consequent conformational changes of the respective molecular environment. Indeed, an extensive analysis of the relationship between estructure and stability was done. The hemoglobin is a multimeric protein and its unfolding process depends of several conditions such as pH and denaturing agent. In this work, the unfolding process of the HbCt and the hemoglobin from Pseudalopex vetulus (HbPv) was performed by fluorescence and circular dichroism using urea, guanidine, different pHs and temperature as denaturing agents. Moreover, the stabilizing effect of the cationic surfactant hexadecyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) was analyzed by circular dichroism. HbCt is more stable in acid pH and more instable than HbPv in basic pH. The CTAB, at 0.5 and 1.0 mM for HbCt and HbPv, respectively, stabilizes the hemoglobins mainly by preferential hydration. An analysis of the relationship between stability and the threedimensional structure was done based on the three-dimensional models of HbCt, human and horse. The differences in amino acidic content of HbCt comparing with the human hemoglobin tend to stabilize the HbCt. On the other hand, comparing with equine hemoglobin, the modifications presented in HbCt tend to be unfavorable for the conformational stability. VII The amino acidic substitutions and the consequent conformational changes in the molecular environment of the HbCt were characterized. Generally, this study is very important for rational design of stable proteins with biotechnological applications. For hemoglobin, in particular, this study is fundamental in order to produce the artificial blood, a new tendency of pharmaceutical companies, as recently described in the literature.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-03-01T20:53:32Z No. of bitstreams: 1 2017_DéboraGonçalvesdaSilva.pdf: 913766 bytes, checksum: fe45a7450dec2caa04c9c3a493dc1146 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-03-07T14:31:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_DéboraGonçalvesdaSilva.pdf: 913766 bytes, checksum: fe45a7450dec2caa04c9c3a493dc1146 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-07T14:31:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_DéboraGonçalvesdaSilva.pdf: 913766 bytes, checksum: fe45a7450dec2caa04c9c3a493dc1146 (MD5) Previous issue date: 2018-03-07 / Introdução: Os casos de diabetes crescem dramaticamente em todo o mundo. Tratar uma doença crônica com complicações graves é um desafio constante e, consequentemente, mais de 60% dos diabéticos do mundo não atingem a meta de controle. Objetivo: Traçar o perfil epidemiológico da doença em uma população que representa um país de renda média-alta com alta prevalência de diabetes, localizada no noroeste de Minas Gerais para entender quais estratégias estão relacionadas ao bom controle. Métodos: Estudo de corte transversal através de análise de prontuários em centros atendidos por especialista em endocrinologia. Estabelecido o valor de ponte de corte para o bom controle do diabetes como hemoglobina glicada inferior a 7%, dividimos a amostra em dois grupos para cálculo de estimativa de risco (odds ratio) estabelecendo, dessa forma, as variáveis relacionadas ao bom/mau controle. Resultados: Foram analisados os dados de 688 pacientes, 87,5% de diabetes tipo 2, mediana de idade de 55 anos, 68% mulheres e 50% com menos de 5 anos de diabetes. Encontramos mediana de hemoglobina glicada 7,7%. Apenas 14,81% dos diabéticos tipo 1 e 35,58% dos diabéticos tipo 2 obtiveram hemoglobina glicada inferior a 7%. Os fatores associados ao mau controle foram: escolaridade inferior a 4 anos, uso de insulina. Os fatores associados ao bom controle foram: tempo de doença inferior a 10 anos, consultas com nutricionista e consultas com endocrinologista. Conclusão: O nível educacional da população tem importante impacto no controle da doença, o tratamento multidisciplinar é peça-chave para obtermos melhor controle e a terapia com insulina precisa ser melhor trabalhada. / Introduction: Diabetes cases grow dramatically around the world. Treating a chronic disease with severe complications is a constant challenge, and consequently more than 60% of the world's diabetics are out of control goal. Objective: Establish the epidemiological profile of the disease in a population that represents a high-middle income country with a high prevalence of diabetes, located in the northwest of Minas Gerais, to understand which factors are related to good control. Methods: Cross-sectional study through the analysis of medical records in centers attended by a specialist in endocrinology. Establishing the cutoff value for good control of diabetes as glycated hemoglobin less than 7%, we divided a sample into two groups for odds ratio calculation. Results: Data from 688 patients, 87,5% of type 2 diabetes, median age of 55 years, 68% of women and 50% with less than 5 years of diabetes were analyzed. We found a median of 7.7% glycated hemoglobin. Only 14.81% of type 1 diabetics and 35.58% of type 2 diabetics had glycated hemoglobin less than 7%. The factors associated to bad control were: schooling less than 4 years, use of insulin. The factors associated to good control were: diabetes time less than 10 years, consultations with a nutritionist and consultations with endocrinologist. Conclusion: The level educational of population has important impact on disease control; multidisciplinary treatment is a key factor to achieve good control and insulin therapy needs to be better worked on.

O presente trabalho caracterizou alguns aspectos enzimáticos da digestão de vitelina e de hemoglobina no carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Um novo protocolo foi desenvolvido para a purificação de uma cisteíno endopeptidase de larvas do carrapato (R. microplus Larval Cysteine Endopeptidase; RmLCE). A seqüência parcial de aminoácidos de RmLCE mostrou similaridade com outra cisteíno endopeptidase descrita neste organismo (Boophilus microplus Cathepsin -L1; BmCL1). Vitelina (Vt), preparada a partir de homogenatos de ovos e larvas de R. microplus, foi degradada diferencialmente por RmLCE e VTDCE (Vitellin-Degrading Cysteine Endopeptidase; uma enzima de atividade semelhante purificada de ovos de R. microplus). RmLCE também apresentou capacidade de degradação de hemoglobina em pH 4,0, e a presença de uma atividade cisteíno endopeptidásica acídica em intestino de larvas foi demonstrada. A atividade peptidásica total, presente em homogenatos de ovos, larvas e intestino de partenóginas, sobre substrato sintético em pH 4,0, mostrou-se diferencialmente susceptível a inibidores de cisteíno e aspártico endopeptidases (E-64 e pepstatina A, respectivamente). A ação combinada dos dois inibidores inibiu completamente a atividade peptidásica. Estes inibidores também afetaram a degradação de vitelina e hemoglobina por homogenatos de larvas e intestino de partenóginas. A presença de pepstatina A inibiu cerca de 50 % da atividade sobre hemoglobina em larvas, enquanto E-64 foi capaz de inibir completamente a degradação das proteínas por ambos os homogenatos. Um enzima com atividade aspártico endopeptidásica presente em larvas de R. microplus foi parcialmente purificada e identificada por Western blot e seqüenciamento N-terminal como Boophilus Yolk Cathepsin (BYC). Esta enzima foi eluída de uma coluna de gel-filtração em pH ácido associada a uma atividade cisteíno endopeptidásica. A degradação de hemoglobina de forma sinérgica pela aspártico endopeptidase (BYC) e a cisteíno endopeptidase (RmLCE) purificadas de larva indica a existência de uma cascata enzimática responsável pela digestão de hemoglobina. Estes resultados sugerem que RmLCE tem um papel continuo na digestão de vitelina e hemoglobina durante o desenvolvimento de R. microplus.