<p> Lipopolysaccharide (LPS) a major non-protein component of the outer membrane of Gram-negative bacteria, defines many of the host-bacterium interactions and provides an effective barrier by inhibiting diffusion of bile salts, detergents, and lipophilic antibiotics. The heptose molecule is an essential component of the bacterial LPS inner core and the synthesis of this subunit is an attractive antimicrobial target. A major challenge to exploit this pathway for antibiotic discoveries has been the unavailability of substrates. </p> <p> TktA, GmhA, HidE and GmhB proteins involved in the biosynthesis of the LPS precursor ADP-D-glycero-β-manno-heptose have been cloned and overexpressed in Escherichia coli to develop a simultaneous in vitro assay suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules. Readily accessible ribose-5-phosphate and fructose-6-phosphate were used as substrates for the heptose pathway and to circumvent the obstacles of substrate availability and stability. We have optimized an in-vitro pathway assay and report its use to screen a small molecule library that identifies the first reported inhibitor of heptose synthesis. The inhibitor, 2-Methyl-6-methylamino-7-oxo-78naphthol [ 1 ,2,3-de]quinoline-4-sulfonic acid was determined to be a competitive inhibitor of the HidE kinase with Ki of 63 ± 8 f..LM. This assay enables probing an important biochemical pathway that otherwise would be highly challenging and allows for efficient detection of novel LPS inhibitors that could potentially lead into antimicrobial treatment. </p> <p> This study also exploited structure-based drug design via protein crystallization. The crystal apoprotein structure of GmhA was determined to a 1.95 A resolution. The GmhA with the substrate bound was determined to a 2.79 A resolution which is the first reported structure of this protein bound with the substrate. By applying knowledge and techniques earned from a combination of advances in assay development, compound library development, robotic instrumentation and protein crystallization, identification and modification of novel inhibitors is possible and has the potential to advance antibiotic research. </p> / Thesis / Master of Science (MSc)

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Eines der prävalentesten humanen Pathogene ist das Magenbakterium Helicobacter pylori, welches ca. die Hälfte der Weltbevölkerung infiziert. Die Persistenz geht mit einer chronischen Gastritis einher, welche bis zu Magenkrebs fortschreiten kann. H.pylori bedient sich diverser Mechanismen um sich der Erkennung des Immunsystems zu entziehen und somit eine chronische Infektion zu ermöglichen. Erhöhte Expression des Immunzellinhibitors PD-L1 wurde in Magenepithelzellen gefunden, welche mit diesem Gram-negativen Erreger infiziert wurden. In dieser Arbeit wurde die Regulation auf in vitro Ebene untersucht, wobei zwei unterschiedliche Mechanismen identifiziert wurden. Ursächlich für die frühe PD-L1-Induktion ist die ADP-heptose/ALPK1 Signalkaskade. Der bakterielle Metabolit ADP-heptose, welcher für die Bildung von LPS benötigt wird, wurde als PAMP identifiziert, welcher durch das Sekretionssystems cagT4SS in die infizierte transportiert und anschließend von der Host Kinase ALPK1 erkannt wird. Gegensätzlich hierzu, wurde festgestellt, dass die zweite PD-L1-Hochregulation auf der metabolischen Reprogrammierung des Wirts beruht. Ein Merkmal von H. pylori ist dessen Bedarf an Cholesterin, welches es aus dem Medium oder aus membranösen Lipidregionen des Wirts extrahiert wird. Es konnte bewiesen werden, dass dieser Sterol-Abbauprozess zu einer erhöhten Stoffwechselaktivität führt, die spezifisch mit einer Zunahme der Glykolyse verbunden ist und mit einer Expressionsverschiebung des ersten Glykolyseenzyms Hexokinase von der Isoform 1 zu 2 einhergeht. Knockdown und Knockout- Experimente wiesen auf einen Zusammenhang mit der Regulation des Immunzellinhibitoren PD-L1 hin. / One of the most prevalent bacteria is the gastric bacterium Helicobacter pylori, which infects half of the world’s population. Persistence is accompanied with chronic gastritis which can progress towards gastric cancer. Several strategies are used by H.pylori to evade the immune system, enabling chronic infection. Heightened expression of the immune cell inhibitor PD-L1 was found in gastric epithelial cells, infected with this Gram-negative pathogen. Within this thesis, upregulation was studied in in vitro models, revealing two distinct mechanism. Causative for early PD-L1 induction is the ADP heptose/ALPK1 signaling axis. The bacterial metabolite ADP heptose, which is needed for LPS synthesis, was identified as PAMP, which is transported through the secretion system cagT4SS into the infected cell and is recognized by the host kinase ALPK1. In contrast, late upregulation of PD-L1 was found to be linked to metabolic reprogramming upon infection. Characteristic to H.pylori is its need of cholesterol, which it has to extract from the surrounding medium or lipid-rich regions within the host membrane. It could be shown that this sterol extraction process is accompanied with an increased metabolic activity which is linked with enhanced glycolysis and an expression shift of the glycolytic enzyme hexokinase isoform 1 to 2. Knockdown and knockout experiments showed a link between HK2 and regulation of the immune checkpoint PD-L1.

Les autotransporteurs monomériques, appartenant au système de sécrétion de type V, correspondent à une famille importante de facteurs de virulence bactériens. Plusieurs fonctions, souvent essentielles pour le développement d’une infection ou pour le maintien et la survie des bactéries dans l’organisme hôte, ont été décrites pour cette famille de protéines. Malgré l’importance de ces protéines, notre connaissance de leur biogenèse et de leur mécanisme d’action demeure relativement limitée. L’autotransporteur AIDA-I, retrouvé chez diverses souches d’Escherichia coli, est un autotransporter multifonctionnel typique impliqué dans l’adhésion et l’invasion cellulaire ainsi que dans la formation de biofilm et d’agrégats bactériens. Les domaines extracellulaires d’autotransporteurs monomériques sont responsables de la fonctionnalité et possèdent pratiquement tous une structure caractéristique d’hélice β. Nous avons mené une étude de mutagenèse aléatoire avec AIDA-I afin de comprendre la base de la multifonctionnalité de cette protéine. Par cette approche, nous avons démontré que les domaines passagers de certains autotransporteurs possèdent une organisation modulaire, ce qui signifie qu’ils sont construits sous la forme de modules fonctionnels. Les domaines passagers d’autotransporteurs peuvent être clivés et relâchés dans le milieu extracellulaire. Toutefois, malgré la diversité des mécanismes de clivage existants, plusieurs protéines, telles qu’AIDA-I, sont clivées par un mécanisme qui demeure inconnu. En effectuant une renaturation in vitro d’AIDA-I, couplée avec une approche de mutagenèse dirigée, nous avons démontré que cette protéine se clive par un mécanisme autocatalytique qui implique deux acides aminés possédant un groupement carboxyle. Ces résultats ont permis la description d’un nouveau mécanisme de clivage pour la famille des autotransporteurs monomériques. Une des particularités d’AIDA-I est sa glycosylation par une heptosyltransférase spécifique nommée Aah. La glycosylation est un concept plutôt récent chez les bactéries et pour l’instant, très peu de protéines ont été décrites comme glycosylées chez E. coli. Nous avons démontré que Aah est le prototype pour une nouvelle famille de glycosyltransférases bactériennes retrouvées chez diverses espèces de protéobactéries. La glycosylation d’AIDA-I est une modification cytoplasmique et post-traductionnelle. De plus, Aah ne reconnaît pas une séquence primaire, mais plutôt un motif structural. Ces observations sont uniques chez les bactéries et permettent d’élargir nos connaissances sur la glycosylation chez les procaryotes. La glycosylation par Aah est essentielle pour la conformation d’AIDA-I et par conséquent pour sa capacité de permettre l’adhésion. Puisque plusieurs homologues d’Aah sont retrouvés à proximité d’autotransporteurs monomériques putatifs, cette famille de glycosyltranférases pourrait être importante, sinon essentielle, pour la biogenèse et/ou la fonction de nombreux autotransporteurs. En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse apportent de nouvelles informations et permettent une meilleure compréhension de la biogenèse d’une des plus importantes familles de protéines sécrétées chez les bactéries Gram négatif. / Monomeric autotransporters, a family of proteins that use the type V secretion pathway, are important mediators of virulence for many bacterial pathogens. Many functions important for host colonization and survival have been described for these proteins. Despite the recognized importance of this family of proteins, the mechanisms that are required for the biogenesis and functionality of monomeric autotransporters still remain poorly understood. The Escherichia coli adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I) is a classical multifunctional autotransporter protein that mediates bacterial aggregation and biofilm formation, as well as adhesion and invasion of cultured epithelial cells. Extracellular domains of autotransporters are responsible for the protein function and fold into a characteristic β-helical structure. We performed a random mutagenesis of the AIDA-I passenger domain in order to identify regions involved in the various phenotypes associated with the expression of this protein. Our study suggests that the passenger domain of AIDA-I possesses a modular organization, which means that AIDA-I is built with individual functional modules. Autotransporter passenger domains can be cleaved from the β-domain and released into the extracellular milieu. However, despite the fact that diverse cleavage mechanisms have been previously described, many autotransporters, like AIDA-I, are cleaved by an unknown mechanism. By monitoring the in vitro refolding and cleavage following by site-directed mutagenesis, we showed that AIDA-I processing is an autocatalytic event that involves two acidic residues. Our results unveil a new mechanism of auto-processing in the autotransporter family. AIDA-I is one of the few glycosylated proteins found in Escherichia coli. Glycosylation is mediated by a specific heptosyltransferase encoded by the aah gene, but little is known about the role of this modification and the mechanism involved. Our findings suggest that Aah represents the prototype of a new large family of bacterial protein O-glycosyltransferases that modify various substrates recognized through a structural motif. Furthermore, we showed that glycosylation occurs in the cytoplasm by a cotranslational mechanism. These observations are unique in bacteria and represent a significant advance in our comprehension of prokaryotic glycosylation. We also showed that glycosylation is required to ensure a normal conformation of AIDA-I and, as a consequence, is necessary for its cell-binding function. The finding that other autotransporters or large adhesin-encoding genes are linked to Aah homologue-encoding genes suggests that glycosylation may be important, if not essential, for the function of these proteins, as for AIDA-I. In conclusion, the results presented in this thesis bring new information about the autotransporter family and also give new insight into the mechanisms that are important for different aspects of the biogenesis of monomeric autotransporters.

Les autotransporteurs monomériques, appartenant au système de sécrétion de type V, correspondent à une famille importante de facteurs de virulence bactériens. Plusieurs fonctions, souvent essentielles pour le développement d’une infection ou pour le maintien et la survie des bactéries dans l’organisme hôte, ont été décrites pour cette famille de protéines. Malgré l’importance de ces protéines, notre connaissance de leur biogenèse et de leur mécanisme d’action demeure relativement limitée. L’autotransporteur AIDA-I, retrouvé chez diverses souches d’Escherichia coli, est un autotransporter multifonctionnel typique impliqué dans l’adhésion et l’invasion cellulaire ainsi que dans la formation de biofilm et d’agrégats bactériens. Les domaines extracellulaires d’autotransporteurs monomériques sont responsables de la fonctionnalité et possèdent pratiquement tous une structure caractéristique d’hélice β. Nous avons mené une étude de mutagenèse aléatoire avec AIDA-I afin de comprendre la base de la multifonctionnalité de cette protéine. Par cette approche, nous avons démontré que les domaines passagers de certains autotransporteurs possèdent une organisation modulaire, ce qui signifie qu’ils sont construits sous la forme de modules fonctionnels. Les domaines passagers d’autotransporteurs peuvent être clivés et relâchés dans le milieu extracellulaire. Toutefois, malgré la diversité des mécanismes de clivage existants, plusieurs protéines, telles qu’AIDA-I, sont clivées par un mécanisme qui demeure inconnu. En effectuant une renaturation in vitro d’AIDA-I, couplée avec une approche de mutagenèse dirigée, nous avons démontré que cette protéine se clive par un mécanisme autocatalytique qui implique deux acides aminés possédant un groupement carboxyle. Ces résultats ont permis la description d’un nouveau mécanisme de clivage pour la famille des autotransporteurs monomériques. Une des particularités d’AIDA-I est sa glycosylation par une heptosyltransférase spécifique nommée Aah. La glycosylation est un concept plutôt récent chez les bactéries et pour l’instant, très peu de protéines ont été décrites comme glycosylées chez E. coli. Nous avons démontré que Aah est le prototype pour une nouvelle famille de glycosyltransférases bactériennes retrouvées chez diverses espèces de protéobactéries. La glycosylation d’AIDA-I est une modification cytoplasmique et post-traductionnelle. De plus, Aah ne reconnaît pas une séquence primaire, mais plutôt un motif structural. Ces observations sont uniques chez les bactéries et permettent d’élargir nos connaissances sur la glycosylation chez les procaryotes. La glycosylation par Aah est essentielle pour la conformation d’AIDA-I et par conséquent pour sa capacité de permettre l’adhésion. Puisque plusieurs homologues d’Aah sont retrouvés à proximité d’autotransporteurs monomériques putatifs, cette famille de glycosyltranférases pourrait être importante, sinon essentielle, pour la biogenèse et/ou la fonction de nombreux autotransporteurs. En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse apportent de nouvelles informations et permettent une meilleure compréhension de la biogenèse d’une des plus importantes familles de protéines sécrétées chez les bactéries Gram négatif. / Monomeric autotransporters, a family of proteins that use the type V secretion pathway, are important mediators of virulence for many bacterial pathogens. Many functions important for host colonization and survival have been described for these proteins. Despite the recognized importance of this family of proteins, the mechanisms that are required for the biogenesis and functionality of monomeric autotransporters still remain poorly understood. The Escherichia coli adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I) is a classical multifunctional autotransporter protein that mediates bacterial aggregation and biofilm formation, as well as adhesion and invasion of cultured epithelial cells. Extracellular domains of autotransporters are responsible for the protein function and fold into a characteristic β-helical structure. We performed a random mutagenesis of the AIDA-I passenger domain in order to identify regions involved in the various phenotypes associated with the expression of this protein. Our study suggests that the passenger domain of AIDA-I possesses a modular organization, which means that AIDA-I is built with individual functional modules. Autotransporter passenger domains can be cleaved from the β-domain and released into the extracellular milieu. However, despite the fact that diverse cleavage mechanisms have been previously described, many autotransporters, like AIDA-I, are cleaved by an unknown mechanism. By monitoring the in vitro refolding and cleavage following by site-directed mutagenesis, we showed that AIDA-I processing is an autocatalytic event that involves two acidic residues. Our results unveil a new mechanism of auto-processing in the autotransporter family. AIDA-I is one of the few glycosylated proteins found in Escherichia coli. Glycosylation is mediated by a specific heptosyltransferase encoded by the aah gene, but little is known about the role of this modification and the mechanism involved. Our findings suggest that Aah represents the prototype of a new large family of bacterial protein O-glycosyltransferases that modify various substrates recognized through a structural motif. Furthermore, we showed that glycosylation occurs in the cytoplasm by a cotranslational mechanism. These observations are unique in bacteria and represent a significant advance in our comprehension of prokaryotic glycosylation. We also showed that glycosylation is required to ensure a normal conformation of AIDA-I and, as a consequence, is necessary for its cell-binding function. The finding that other autotransporters or large adhesin-encoding genes are linked to Aah homologue-encoding genes suggests that glycosylation may be important, if not essential, for the function of these proteins, as for AIDA-I. In conclusion, the results presented in this thesis bring new information about the autotransporter family and also give new insight into the mechanisms that are important for different aspects of the biogenesis of monomeric autotransporters.