Abstract Breast cancer is the most common cancer among women, and inherited predisposition is one of the major recognized causes of increased breast cancer risk. Only about half of the hereditary cases are explained by mutations in the known susceptibility genes, including the DNA damage response genes BRCA1, BRCA2 and PALB2, leaving the majority still uncovered. Identification of the missing genetic predisposing factors is important for more effective diagnostics and counseling of the risk families, and also for better understanding of the etiology and cellular characteristics of breast cancer. The first aim of this study was to investigate the cancer associations of six rare germline copy number variant (CNV) deletions, which were previously identified in breast cancer patients by a genome-wide microarray approach. The second aim was to identify novel susceptibility alleles, both protein-truncating variants and missense mutations, by next-generation sequencing (NGS) of nearly 800 DNA damage response genes in 189 hereditary breast cancer patients. The cancer-associations of all selected candidate alleles (6 CNVs, 39 protein-truncating variants and 35 missense mutations) were studied by case-control approach using DNA samples from several hundred breast cancer patients and healthy controls. The prevalence of the studied CNVs did not significantly differ between the cases and controls, but when studying the associations with specific clinical parameters, deletion in the CYP2C19 gene showed enrichment in the breast cancer patients with hormonally triple-negative tumors (p=0.021). As CYP2C19 functions in estrogen metabolism, the results indicate that disturbance of hormonal balance due to enzyme defects may predispose specifically to the estrogen receptor-negative subtype of breast cancer. Two protein truncating-variants, TEX15 c.7253dupT and FANCD2 c.2715+1G>A showed significant breast cancer association in the Northern Finnish cohort (p=0.018 and p=0.036, respectively). Similarly, two of the studied missense variants, RECQL p.Ile156Met (p=0.043) and POLG p.Leu392Val (p=0.010), were enriched in the breast cancer cases. Thus, this study provided novel connections between increased breast cancer risk and inherited mutations in TEX15, FANCD2 and POLG genes, and further supported the recently established role of RECQL as a breast cancer susceptibility gene. / Tiivistelmä Rintasyöpä on naisten yleisin syöpä, ja perinnöllinen alttius on yksi merkittävimmistä sairastumisriskiin vaikuttavista tekijöistä. Tunnetuimpia alttiustekijöitä ovat mutaatiot BRCA1-, BRCA2- ja PALB2-DNA-vauriovastegeeneissä, mutta ne yhdessä muiden altistavien geenimutaatioiden kanssa selittävät kuitenkin vain noin puolet perinnöllisistä rintasyöpätapauksista. Uusien alttiusgeenien löytäminen mahdollistaa tehokkaamman diagnostiikan ja korkeassa syöpäriskissä olevien sukujen perinnöllisyysneuvonnan, sekä auttaa ymmärtämään syvemmin rintasyövän etiologiaa ja syntymekanismeja solutasolla. Tämän väitöskirjan ensimmäisenä päämääränä oli tutkia tarkemmin aiemmin genominlaajuisella mikrosirumenetelmällä rintasyöpäpotilailta tunnistettujen harvinaisten perinnöllisten DNA-kopiolukuvariaatioiden (CNV) yhteyttä rintasyöpäriskiin. Toisena tavoitteena oli tunnistaa uusia rintasyöpäalttiusalleeleja, sekä proteiinitrunkaatioita että missense-mutaatioita, hyödyntämällä uuden sukupolven sekvensointitekniikkaa, jonka avulla tutkittiin mutaatioita lähes 800 DNA-vauriovastegeenistä 189 pohjoissuomalaiselta rintasyöpäpotilaalta. Valittujen kandidaattialleelien (6 deleetion aiheuttavaa CNV:tä, 39 proteiinitrunkaatiota ja 35 missense-mutaatiota) yhteyttä rintasyöpään tutkittiin tapaus-verrokkimenetelmällä käyttäen DNA-näytteitä usealta sadalta rintasyöpäpotilaalta ja terveeltä kontrollihenkilöltä. Tutkittujen CNV:iden esiintyvyydessä ei ollut merkitseviä eroja potilaiden ja kontrollien välillä, mutta tarkasteltaessa yhteyttä potilaiden kasvaimista saatuihin kliinisiin parametreihin, deleetio CYP2C19-geenissä oli yleisempi hormonaalisesti kolmoisnegatiivisissa rintatuumoreissa kuin muissa tuumorityypeissä (p=0.021). Koska CYP2C19 on estrogeenimetaboliaan osallistuva entsyymi, sen viallinen toiminta voi mahdollisesti altistaa erityisesti estrogeenireseptorinegatiiviselle rintasyövälle. Kaksi tutkituista proteiinitrunkaatioista, TEX15 c.7253dupT ja FANCD2 c.2715+1G>A, olivat rikastuneet perinnöllisessä rintasyöpäpotilasaineistossa verrattuna kontrolleihin (p=0.018 ja p=0.036). Myös kaksi missense-alleelia, RECQL p.Ile156Met (p=0.043) ja POLG p.Leu392Val (p=0.010), olivat yleisempiä rintasyöpäpotilailla. Tulokset osoittivat uuden yhteyden kohonneen rintasyöpäriskin ja perinnöllisten muutosten TEX15-, FANCD2- ja POLG-geenien välillä, sekä tukivat aiempia tutkimustuloksia, joiden mukaan RECQL on kohtalaisen riskin rintasyöpäalttiusgeeni.

Abstract Breast cancer is the most common malignancy in women and it is strongly influenced by hereditary risk factors. So far, most of the breast cancer-associated genes, including BRCA1/2, have been identified among those that encode proteins involved in DNA damage response (DDR) pathways. However, known genetic risk factors explain less than half of the familial risk of breast cancer. Identification of novel genes and mutations that predispose to breast cancer is important for the understanding of the mechanisms that contribute to the disease development and also for the identification of those individuals who are at high risk. The first aim of this study was to resolve the complementation groups of Finnish patients with Fanconi anemia (FA), which is a rare genetic disease caused by defects in a specific DDR pathway, and to study the role of the causative gene mutations in breast cancer predisposition. The second aim of this study was to identify novel breast cancer susceptibility genes and alleles by targeted next-generation sequencing (NGS) of multiple (~800) DDR related genes. In both approaches, the identified gene mutations were subjected to case-control association analysis utilizing DNA samples of over 1,000 breast cancer cases and 1,000 healthy controls. Investigation of the Finnish FA patients revealed six different disease-causing mutations in three different genes (FANCA, FANCG and FANCI). All of the studied mutations were recurrent in the Finnish population but did not associate with breast cancer. Targeted NGS identified three novel potential breast cancer susceptibility genes. A significant enrichment of TEX15 c.7253dupT and FANCD2 c.2715+1G>A mutations was observed among the hereditary breast cancer cases (P = 0.018 and P = 0.036, respectively). The strongest evidence was found for a Finnish founder mutation in MCPH1 (c.904_916del), which associated with breast cancer susceptibility both in familial (P = 0.003, OR 8.3) and unselected (P = 0.016, OR 3.3) patient cohorts. The tumor suppressive function of MCPH1 was indicated by the loss of the wild-type allele of MCPH1 in 40% of the studied carrier tumors. Furthermore, carriers exhibited a significant increase in genomic instability measured by spontaneous chromosomal rearrangements in peripheral blood lymphocytes. / Tiivistelmä Rintasyöpä on naisten yleisin syöpä. Sairastumisriskiin vaikuttavat voimakkaasti perinnölliset alttiustekijät, ja suurin osa tähän asti tunnistetuista rintasyöpäalttiusgeeneistä, kuten BRCA1/2, koodaa DNA-vauriovasteessa (DDR) toimivia proteiineja. Tunnistetut tekijät selittävät yhä kuitenkin vain alle puolet rintasyövän perinnöllisestä alttiudesta. Uusien alttiusgeenien tunnistaminen on tärkeää rintasyövän patomekanismien ymmärtämiseksi sekä korkean rintasyöpäriskin omaavien henkilöiden tunnistamiseksi. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli määrittää viallisesta DDR-signaalinsiirtoreitistä johtuvan Fanconin anemian (FA) komplementaatioryhmät suomalaisilta FA-potilailta sekä tutkia sairauden taustalla olevien geenimutaatioden yhteyttä rintasyöpäriskiin. Uusia alttiusgeenejä etsittiin myös kohdennetulla uuden sukupolven sekvensointimenetelmällä, jonka avulla tutkittiin yhtäaikaisesti n. 800 DDR-geeniä. Molemmilla lähestymistavoilla tunnistettujen geenimuutosten yhteyttä rintasyöpään selvitettiin tapaus-verrokkitutkimuksen avulla, jossa tutkittiin DNA-näytteitä yli tuhannelta rintasyöpäpotilaalta sekä yli tuhannelta terveeltä henkilöltä. Suomalaisten FA-potilaiden geenimuutoksia selvittävässä tutkimuksessa tunnistettiin yhteensä kuusi mutaatiota kolmessa eri geenissä (FANCA, FANCG ja FANCI). Kaikki tutkimuksessa tunnistetut mutaatiot olivat toistuvia suomalaisessa väestössä, mutta merkitsevää assosiaatiota näiden mutaatioiden ja rintasyöpäalttiuden välillä ei havaittu. DDR-geenien sekvensoinnin avulla tunnistettiin kolme uutta mahdollista rintasyöpäalttiusgeeniä. Tutkimuksessa havaittiin TEX15 c.7253dupT ja FANCD2 c.2715+1G>A mutaatioiden rikastuminen perinnöllisessä rintasyöpäaineistossa (P = 0.018 ja P = 0.036). Merkittävin yhteys rintasyöpäalttiuden kanssa todettiin MCPH1-geenin perustajamutaatiolle (c.904_916del). Tämä mutaatio assosioitui rintasyöpäalttiuden kanssa sekä perinnöllisessä (P = 0.003, OR 8.3) että valikoimattomassa potilasaineistossa (P = 0.016, OR 3.3). Useissa mutaatiokantajien tuumoreissa (40 %) normaali MCPH1 vastinalleeli oli hävinnyt, mikä viittaisi siihen, että MCPH1 toimii tuumorisuppressorina. Mutaatiokantajilla todettiin myös kohonnut määrä kromosomaalisia muutoksia veren periferaalisissa lymfosyyteissä, mahdollisesti kohonneeseen genomiseen epävakauteen liittyen.