Níveis sustentáveis de hormônio de crescimento humano (hGH) circulante e aumento de peso altamente significativo, avaliados também em comparação a repetidas injeções de hormônio, foram observados em trabalhos anteriores, baseados na eletrotransferência de DNA plasmidial no músculo de camundongos anões imunodeficientes (lit/scid). No presente trabalho, um modelo animal homólogo de terapia gênica para GH foi estudado mediante clonagem da sequência genômica do DNA de GH de camundongo (mGH-gDNA), a qual substituiu o hGH-gDNA no vetor que havia sido utilizado em camundongos anões imunodeficientes. O novo vetor, agora nomeado UBI-mGH-gDNA, foi utilizado em camundongos anões imunocompetentes (lit/lit). Foi primeiramente realizado um teste in vitro, transfectando-se células humanas HEK 293 com este plasmídeo e obtendo-se uma expressão de 3,0 &mu;g mGH/106 células/dia, contra 3,7 &mu;g mGH/106 células/dia, para o UBI-hGH-gDNA. Estes dois plasmídeos foram então injetados (50 &mu;g/animal) no músculo quadríceps de camundongos, seguido de eletroporação, realizando um ensaio de 94 dias. Enquanto após 15 dias, as inclinações das curvas de variação de peso relacionadas ao mGH, hGH e salina foram 0,130, 0,112 e 0,027 g/camundongo/dia, respectivamente, após 94 dias, as inclinações correspondentes foram 0,041, 0,028 e 0,033 g/camundongo/dia. As análises estatísticas mostraram que após 15 dias, as inclinações das duas curvas com o GH foram significativamente maiores que a inclinação do controle (P<0,001), enquanto que após 94 dias, somente a inclinação da curva do mGH foi maior que a do controle (P<0,005). A porcentagem de aumento de peso nos animais tratados com o gene do mGH, após 94 dias, foi de 34,3%, enquanto que o comprimento nariz-cauda e o comprimento do fêmur, dois parâmetros que medem diretamente o crescimento longitudinal, foram de 9,5% e 26%, respectivamente, quando comparados aos valores iniciais. A interrupção do crescimento progressivo do grupo tratado com hGH não foi inesperada, considerando a óbvia reação imunogênica dos animais imunocompetentes contra o GH humano e não contra o de camundongo (título do anticorpo anti-hGH 1:100 a 1:3200). A inclinação altamente positiva do grupo controle, já observada em camundongos lit/lit mas não em lit/scid, é provavelmente devida ao ganho de peso natural desta linhagem, não suportada, contudo, por um proporcional crescimento longitudinal. Níveis circulatórios de mGH da ordem de 4 ng/mL foram detectados após 15 dias para o grupo tratado com o mGH, enquanto o grupo controle apresentou níveis em torno de 0,7 ng mGH/mL (P<0,001). Níveis circulatórios de mIGF-I foram também determinados nos dias 15, 45 e 94 nos animais tratados com mGH, sempre mostrando valores 1,5 - 3,0 vezes maiores que o grupo controle, e valores 1,2-1,6 vezes maiores que o grupo tratado com hGH. Este modelo de tratamento homólogo pode ser considerado uma primeira abordagem e um importante suporte para futuros ensaios pré-clínicos baseados na administração de DNA plasmidial para o tratamento da deficiência de GH humano. / Sustained levels of circulating human growth hormone (hGH) and highly significant weight increases, also found comparable to repeated hormone injections, were observed in previous works, after electrotransfer of naked plasmid DNA into the muscle of immunodeficient dwarf mice (lit/scid). In the present work an homologous animal model for GH gene therapy was studied by cloning the genomic sequence of mouse GH-DNA (mGH-gDNA), which substituted hGH-gDNA in the plasmid that had been used in immunodeficient dwarf mice, now named UBI-mGH-gDNA and used in immunocompetent dwarf mice (lit/lit). An in vitro test was first carried out by transfecting HEK 293 human cells with this plasmid and obtaining an expression of 3.0 &mu;g mGH/106 cells/day, against 3.7 &mu;g /106 cells/day obtained with UBI-hGH-gDNA. The same two plasmids DNA (50 &mu;g/mouse) were then injected into the quadriceps muscle of lit/lit, followed by electroporation, carrying out a 94-day assay. While after 15 days the slopes of the weight variation curves related to mGH, hGH and saline were 0.130, 0.112 and 0.027 g/mouse/day respectively, after 94 days the corresponding slopes were 0.041, 0.028 and 0.033 g/mouse/day. Statistical tests showed that after 15 days the slopes of both GH curves were significantly higher than the control (P<0.001), while after 94 days only the slope of the mGH curve was significantly higher than the control (P<0.005). Weight increase for mGH-treated mice, after 94 days, was 34.3%, while nose-to-tail and femur length, both directly measuring longitudinal growth, increased 9.5% and 26.0%, respectively, when compared to the initial values. The progressive growth arrest of the hGH-treated mice was not unexpected, considering the obvious immunogenic reaction of the immunocompetent animals against human and not against mouse GH ( anti-hGH antibody title 1:100 to 1:3200). The highly positive slope of the control group, already observed in lit/lit but never in lit/scid, is probably due to the natural weight gain of this strain, not supported, however, by a proportional longitudinal growth. mGH circulating levels of the order of 4 ng/mL were detected after 15 days for mGH-treated mice, while the control presented levels around 0.7 ng mGH/mL (P<0.001). Mouse IGF-I serum levels were also determined on day 15, 45 and 94 in mGH-treated mice, always showing 1.5-3.0 fold higher values than the control and 1.2-1.6 fold higher values than hGH-treated mice. This homologous treatment model can be considered a first approach and an important support to the preclinical testing of naked DNA administration for the treatment of human GH deficiency.

Queratinócitos são um veículo bastante atrativo para a transferência gênica ex vivo e liberação sistêmica uma vez que as proteínas secretadas por estas células podem atingir a circulação via um mecanismo similar ao processo natural. Um eficiente vetor retroviral (LXSN) contendo o gene do hormônio de crescimento de camundongo (mGH) foi utilizado para transduzir queratinócitos humanos primários. Os queratinócitos transduzidos apresentaram um nível de secreção in vitro alto e estável atingindo até 11 g mGH/106 células/dia. Os epitélios formados por estes queratinócitos geneticamente modificados apresentaram, porém, uma queda na taxa de secreção > 80 % quando foram retirados da placa de cultura utilizando um procedimento clássico. A substituição desta metodologia clássica por uma cultura organotípica resolveu completamente este problema. Camundongos anões imunodeficientes (lit/scid) implantados com estes enxertos organotípicos foram acompanhados durante 4 meses, e apresentaram um aumento de peso significativo (P<0,05) nos primeiros 40 dias. Níveis circulatórios de mGH atingiram um pico de 21 ng/mL 1 h após o implante, mas estes níveis rapidamente atingiram níveis basais (~2 ng/mL). Os queratinócitos humanos primários apresentaram portanto altos níveis de expressão in vitro e os maiores níveis circulatórios, porém por um breve período de tempo, reportados até o momento para GH neste tipo de células. Em conjunto com resultados que mostraram uma recuperação considerável da eficiência de secreção de mGH em cultura por enxertos organotípicos retirados dos animais, foram discutidos os fatores que ainda impedem a utilização clínica deste modelo promissor de terapia gênica cutânea. / Keratinocytes are a very attractive vehicle for ex vivo gene transfer and systemic delivery, since proteins secreted by these cells may reach the circulation via a mechanism which mimics the natural process. An efficient retroviral vector (LXSN) encoding the mouse growth hormone gene (mGH) was used to transduce primary human keratinocytes. Organotypic raft cultures were prepared with these genetically modified keratinocytes and were grafted onto immunodeficient dwarf mice (lit/scid). Transduced keratinocytes presented a high and stable in vitro secretion level of up to 11 g mGH/106cells/day. Conventional epidermal sheets made with these genetically modified keratinocytes, however, showed a drop in secretion rates of > 80% simply due to detachment of the epithelium from its substratum. Substitution of conventional grafting methodologies with organotypic raft cultures completely overcame this problem. The stable long-term grafting of such cultures onto immunodeficient dwarf (lit/scid) mice could be followed for more than 4 months, and a significant weight increase (P<0.05) over the control group was observed in the first 40 days. Circulating mGH levels revealed a peak of 21 ng/mL just 1h after grafting, but unfortunately these levels rapidly fell to baseline values (~ 2 ng/mL). mGH-secreting primary human keratinocytes presented the highest in vitro expression and peak circulatory levels reported to date for a form of GH with this type of cells. Together with data showing that excised implants can recover in culture a remarkable fraction of their original in vitro mGH secretion efficiency, the factors that might still hamper the success of this promising model of cutaneous gene therapy are discussed. SUMÁRIO

Níveis sustentáveis de hormônio de crescimento humano (hGH) circulante e aumento de peso altamente significativo, avaliados também em comparação a repetidas injeções de hormônio, foram observados em trabalhos anteriores, baseados na eletrotransferência de DNA plasmidial no músculo de camundongos anões imunodeficientes (lit/scid). No presente trabalho, um modelo animal homólogo de terapia gênica para GH foi estudado mediante clonagem da sequência genômica do DNA de GH de camundongo (mGH-gDNA), a qual substituiu o hGH-gDNA no vetor que havia sido utilizado em camundongos anões imunodeficientes. O novo vetor, agora nomeado UBI-mGH-gDNA, foi utilizado em camundongos anões imunocompetentes (lit/lit). Foi primeiramente realizado um teste in vitro, transfectando-se células humanas HEK 293 com este plasmídeo e obtendo-se uma expressão de 3,0 &mu;g mGH/106 células/dia, contra 3,7 &mu;g mGH/106 células/dia, para o UBI-hGH-gDNA. Estes dois plasmídeos foram então injetados (50 &mu;g/animal) no músculo quadríceps de camundongos, seguido de eletroporação, realizando um ensaio de 94 dias. Enquanto após 15 dias, as inclinações das curvas de variação de peso relacionadas ao mGH, hGH e salina foram 0,130, 0,112 e 0,027 g/camundongo/dia, respectivamente, após 94 dias, as inclinações correspondentes foram 0,041, 0,028 e 0,033 g/camundongo/dia. As análises estatísticas mostraram que após 15 dias, as inclinações das duas curvas com o GH foram significativamente maiores que a inclinação do controle (P<0,001), enquanto que após 94 dias, somente a inclinação da curva do mGH foi maior que a do controle (P<0,005). A porcentagem de aumento de peso nos animais tratados com o gene do mGH, após 94 dias, foi de 34,3%, enquanto que o comprimento nariz-cauda e o comprimento do fêmur, dois parâmetros que medem diretamente o crescimento longitudinal, foram de 9,5% e 26%, respectivamente, quando comparados aos valores iniciais. A interrupção do crescimento progressivo do grupo tratado com hGH não foi inesperada, considerando a óbvia reação imunogênica dos animais imunocompetentes contra o GH humano e não contra o de camundongo (título do anticorpo anti-hGH 1:100 a 1:3200). A inclinação altamente positiva do grupo controle, já observada em camundongos lit/lit mas não em lit/scid, é provavelmente devida ao ganho de peso natural desta linhagem, não suportada, contudo, por um proporcional crescimento longitudinal. Níveis circulatórios de mGH da ordem de 4 ng/mL foram detectados após 15 dias para o grupo tratado com o mGH, enquanto o grupo controle apresentou níveis em torno de 0,7 ng mGH/mL (P<0,001). Níveis circulatórios de mIGF-I foram também determinados nos dias 15, 45 e 94 nos animais tratados com mGH, sempre mostrando valores 1,5 - 3,0 vezes maiores que o grupo controle, e valores 1,2-1,6 vezes maiores que o grupo tratado com hGH. Este modelo de tratamento homólogo pode ser considerado uma primeira abordagem e um importante suporte para futuros ensaios pré-clínicos baseados na administração de DNA plasmidial para o tratamento da deficiência de GH humano. / Sustained levels of circulating human growth hormone (hGH) and highly significant weight increases, also found comparable to repeated hormone injections, were observed in previous works, after electrotransfer of naked plasmid DNA into the muscle of immunodeficient dwarf mice (lit/scid). In the present work an homologous animal model for GH gene therapy was studied by cloning the genomic sequence of mouse GH-DNA (mGH-gDNA), which substituted hGH-gDNA in the plasmid that had been used in immunodeficient dwarf mice, now named UBI-mGH-gDNA and used in immunocompetent dwarf mice (lit/lit). An in vitro test was first carried out by transfecting HEK 293 human cells with this plasmid and obtaining an expression of 3.0 &mu;g mGH/106 cells/day, against 3.7 &mu;g /106 cells/day obtained with UBI-hGH-gDNA. The same two plasmids DNA (50 &mu;g/mouse) were then injected into the quadriceps muscle of lit/lit, followed by electroporation, carrying out a 94-day assay. While after 15 days the slopes of the weight variation curves related to mGH, hGH and saline were 0.130, 0.112 and 0.027 g/mouse/day respectively, after 94 days the corresponding slopes were 0.041, 0.028 and 0.033 g/mouse/day. Statistical tests showed that after 15 days the slopes of both GH curves were significantly higher than the control (P<0.001), while after 94 days only the slope of the mGH curve was significantly higher than the control (P<0.005). Weight increase for mGH-treated mice, after 94 days, was 34.3%, while nose-to-tail and femur length, both directly measuring longitudinal growth, increased 9.5% and 26.0%, respectively, when compared to the initial values. The progressive growth arrest of the hGH-treated mice was not unexpected, considering the obvious immunogenic reaction of the immunocompetent animals against human and not against mouse GH ( anti-hGH antibody title 1:100 to 1:3200). The highly positive slope of the control group, already observed in lit/lit but never in lit/scid, is probably due to the natural weight gain of this strain, not supported, however, by a proportional longitudinal growth. mGH circulating levels of the order of 4 ng/mL were detected after 15 days for mGH-treated mice, while the control presented levels around 0.7 ng mGH/mL (P<0.001). Mouse IGF-I serum levels were also determined on day 15, 45 and 94 in mGH-treated mice, always showing 1.5-3.0 fold higher values than the control and 1.2-1.6 fold higher values than hGH-treated mice. This homologous treatment model can be considered a first approach and an important support to the preclinical testing of naked DNA administration for the treatment of human GH deficiency.

Queratinócitos são um veículo bastante atrativo para a transferência gênica ex vivo e liberação sistêmica uma vez que as proteínas secretadas por estas células podem atingir a circulação via um mecanismo similar ao processo natural. Um eficiente vetor retroviral (LXSN) contendo o gene do hormônio de crescimento de camundongo (mGH) foi utilizado para transduzir queratinócitos humanos primários. Os queratinócitos transduzidos apresentaram um nível de secreção in vitro alto e estável atingindo até 11 g mGH/106 células/dia. Os epitélios formados por estes queratinócitos geneticamente modificados apresentaram, porém, uma queda na taxa de secreção > 80 % quando foram retirados da placa de cultura utilizando um procedimento clássico. A substituição desta metodologia clássica por uma cultura organotípica resolveu completamente este problema. Camundongos anões imunodeficientes (lit/scid) implantados com estes enxertos organotípicos foram acompanhados durante 4 meses, e apresentaram um aumento de peso significativo (P<0,05) nos primeiros 40 dias. Níveis circulatórios de mGH atingiram um pico de 21 ng/mL 1 h após o implante, mas estes níveis rapidamente atingiram níveis basais (~2 ng/mL). Os queratinócitos humanos primários apresentaram portanto altos níveis de expressão in vitro e os maiores níveis circulatórios, porém por um breve período de tempo, reportados até o momento para GH neste tipo de células. Em conjunto com resultados que mostraram uma recuperação considerável da eficiência de secreção de mGH em cultura por enxertos organotípicos retirados dos animais, foram discutidos os fatores que ainda impedem a utilização clínica deste modelo promissor de terapia gênica cutânea. / Keratinocytes are a very attractive vehicle for ex vivo gene transfer and systemic delivery, since proteins secreted by these cells may reach the circulation via a mechanism which mimics the natural process. An efficient retroviral vector (LXSN) encoding the mouse growth hormone gene (mGH) was used to transduce primary human keratinocytes. Organotypic raft cultures were prepared with these genetically modified keratinocytes and were grafted onto immunodeficient dwarf mice (lit/scid). Transduced keratinocytes presented a high and stable in vitro secretion level of up to 11 g mGH/106cells/day. Conventional epidermal sheets made with these genetically modified keratinocytes, however, showed a drop in secretion rates of > 80% simply due to detachment of the epithelium from its substratum. Substitution of conventional grafting methodologies with organotypic raft cultures completely overcame this problem. The stable long-term grafting of such cultures onto immunodeficient dwarf (lit/scid) mice could be followed for more than 4 months, and a significant weight increase (P<0.05) over the control group was observed in the first 40 days. Circulating mGH levels revealed a peak of 21 ng/mL just 1h after grafting, but unfortunately these levels rapidly fell to baseline values (~ 2 ng/mL). mGH-secreting primary human keratinocytes presented the highest in vitro expression and peak circulatory levels reported to date for a form of GH with this type of cells. Together with data showing that excised implants can recover in culture a remarkable fraction of their original in vitro mGH secretion efficiency, the factors that might still hamper the success of this promising model of cutaneous gene therapy are discussed. SUMÁRIO