Gonadotropin-releasing hormone (GnRH) and its superactive analogues are currently being used in the treatment of a number of endocrine disorders, such as endometriosis, precocious puberty, infertility and prostatic cancer. Selection of these analogues for clinical use have been previously based on their activities in animal models. This thesis has therefore investigated the binding characteristics of the human GnRH receptor, in comparison to those of the rat receptor, as well as the activities of a number of GnRH analogues for stimulating luteinising hormone (LH) and follicle stimulating hormone (FSH) secretion from cultured human pituitary cells. The establishment of a human pituitary bioassay system has further made possible the investigation of the direct regulatory roles of GnRH and other neuropeptides in man. To date, such studies in man have been performed in vivo and are thus complicated by the simultaneous interactions of numerous modulators.

The control of prolactin secretion is a complex interaction of peptides and neurotransmitters acting either in an inhibitory or stimulating way to effect final secretion of this hormone from the lactotrope cell in the anterior hypothalamus. These factors may act either directly on the lactotrope cell or indirectly by changing either dopamine restraint of prolactin secretion or by modulating peptide substances or neurotransmitters higher up in the hypothalamus. Gonadal steroids may also modulate the effect of peptides or dopamine at the level of the lactotrope. Prolactin's major role in the female rat is one of milk production post - partum, nurturing the young. It probably also has other physiological functions and may play a part in the menstrual cycle although this is controversial. Certainly, pulsatile secretion of prolactin during the menstrual cycle is well established and in the luteal phase this is concomitant with the secretion of luteinizing hormone. Theories explaining the synchronous surges seen during this phase of the menstrual cycle have been proposed and GnRH has been implicated in the genesis of the concordance of these secretory spikes. Using a potent GnRH antagonist an experiment was undertaken to establish the role of GnRH by blocking this hypothalamic peptide and observing the effect that this had on luteinizing hormone, prolactin and follicle stimulating hormone. In the first part of the thesis the control of prolactin secretion is reviewed. In the following section, an experiment was performed using a potent GnRH antagonist. A dose response curve was established for the antagonist action on LH. Then a twice maximum dose of this peptide was administered to three subjects in the midluteal phase of the menstrual cycle and the response of LH, prolactin and FSH was measured. The results indicate that although the GnRH antagonist significantly blocked LH secretory peaks, this action was not observed for either prolactin or FSH. This result is perhaps at variance with previous data which suggested that GnRH was responsible for concordant secretory spikes of LH and prolactin in the midluteal phase of the menstrual cycle.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Il est maintenant bien établi que les GHRPs constituent une classe de peptides synthétiques stimulant la sécrétion de l'hormone de croissance par interaction avec leur récepteur spécifique au niveau hypophysaire. Ce récepteur constitué de 364 acides aminés appartient à la famille des récepteurs à sept passages transmembranaires couplé aux protéines G. Il est exprimé non seulement au niveau de l'hypophyse mais également au niveau de l'hypothalamus, des noyaux arqués et paraventriculaires. Récemment, il a été découvert par étude de photomarquage covalent que l'hexarelin, un hexapeptide de la famille des GHRPs se lie de façon spécifique à une glycoprotéine membranaire de poids moléculaire de 84 kDa exprimée dans les membranes de coeur de rat. La liaison de l'hexarelin à ce récepteur au niveau cardiaque induit une forte vasoconstriction coronarienne de façon dose­dépendante dans le modèle de coeur de rat perfusé. Les buts de la présente étude sont premièrement de déterminer si la liaison est spécifique seulement à l'hexarelin ou à d'autres analogues peptidiques de la famille des GHRPs, notamment le dérivé EP 70905. Dans un deuxième temps nous déterminerons si les analogues se liant au récepteur cardiaque des GHRPs exercent un effet vasoconstricteur sur les coronaires utilisant le modèle de cœur de rat perfusé. Troisièmement nous caractériserons les voies de signalisation impliquées dans la vasoconstriction induite par les GHRPs. Les études de compétition entre le radioligand photoactivable [125] I-Tyr-Ala-Bpa­hexarelin et le EP 70905 effectuées sur les membranes de cœur de rat démontrent une affinité de liaison comparable du EP 70905 et de l'hexarelin au récepteur cardiaque des GHRPs. Cependant, le EP 70905 induit une augmentation de la pression coronarienne significativement plus élevée que celle induite par l'hexarelin. Les études des voies de signalisation démontrent que les tyrosine kinases ne semblent pas être impliquées dans la vasoconstriction induite par le EP 70905, puisque la perfusion simultanée avec la génistéine n'affecte pas la vasoconstriction induite par ce peptide. Le rôle de l'endothéline endogène dont la libération est stimulée par le EP 70905 semble être mineur dans la vasoconstriction observée considérant les taux femtomolaires d'endothéline libérés dans le perfusat. De plus, la perfusion simultanée d'un antagoniste des récepteurs d'endothéline, le LU 302872 affecte que faiblement la vasoconstriction induite par le EP 70905. Par contre, la vasoconstriction coronarienne induite par le EP 70905 est inhibée de façon majeure suite à la perfusion de la nifédipine, un bloqueur des canaux calciques de type L. La perfusion simultanée d'un inhibiteur de la protéine kinase C, la chélérythrine affecte de façon significative la vasoconstriction induite par le EP 70905.

Le CD36 est un récepteur de type éboueur de classe B exprimé à la surface de nombreux types cellulaires dont les macrophages, les cellules endothéliales de la microvasculature et les plaquettes. Ce récepteur multiligand est impliqué dans plusieurs processus pathologiques notamment l’athérosclérose, l’angiogénèse et la malaria via la liaison spécifique de ligands comme les lipoprotéines oxydées de basse densité, la thrombospondine-1 et la protéine PfEMP-1, respectivement. Les peptides de la relâche de l’hormone de croissance (GHRP) ont été identifiés comme les premiers ligands synthétiques du CD36. Afin de développer de nouveaux ligands synthétiques du CD36, l’établissement d’une méthode de criblage est essentiel pour découvrir des composés avec une liaison de haute affinité pour ce récepteur. Pour y parvenir, nous avons surexprimé le domaine extracellulaire du CD36 humain dans les cellules d’insectes Sf9. La protéine soluble purifiée par chromatographie d’affinité fut immobilisée à la surface d’une plaque de résonance de plasmons de surface (SPR) pour les études de liaison. La méthodologie développée a permis de caractériser les ligands du CD36 en déterminant leurs constantes de dissociation (KD), et d’établir une relation structure-activité des ligands de la famille des azapeptides, des composés dérivés du GHRP-6. Afin de valider la méthode par spectroscopie SPR, une corrélation a été établie entre les valeurs de KD obtenues en SPR et les valeurs d’CI50 de courbes d’inhibition de la phosphorylation des MAP kinases JNK1/2 induite par un phospholipide oxydé, le POVPC, en présence de concentrations croissantes de ligands du CD36 dans les macrophages RAW 264.7. / CD36 is a class B scavenger receptor expressed at the cell surface of macrophages, endothelial cells and platelets, among others. This multiligand receptor is implicated in various diseases such as atherosclerosis, angiogenesis and malaria through the specific binding of ligands, such as oxidized low-density lipoproteins, thrombospondin-1 and the PfEMP-1 protein, respectively. Growth hormone-releasing peptides (GHRP) were identified as the first CD36 synthetic ligands. In order to identify new CD36 synthetic ligands, the development of a high-throughput method is essential to unveil compounds of high binding affinity. We have expressed a recombinant CD36 ectodomain protein in Sf9 insect cells. The soluble and affinity purified protein was immobilized on a surface plasmon resonance (SPR) sensor for binding studies. Synthetic ligands were analyzed by SPR spectroscopy for determination of their respective dissociation constant (KD). A structure-activity relationship of CD36 ligands was established. To validate the SPR binding signal, a good correlation was observed between KD and the IC50 values obtained from the inhibition curves of the MAPK kinase JNK1/2 phosphorylation induced by an oxidized phospholipid, the POVPC, in the presence of increasing concentrations of CD36 ligands in RAW 264.7 macrophage cells.

Cheng Fu Yip Gheorghe. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2003. / Includes bibliographical references (leaves 97-116). / Abstracts in English and Chinese. / Acknowledgement --- p.I / Abstract (in English) --- p.III / Abstract (in Chinese) --- p.V / Table of Content --- p.VII / Symbols and Abbreviations --- p.XII / Scientific Names --- p.XIV / List of Tables --- p.XV / List of Figures --- p.XVI / Chapter Chapter 1 --- General Introduction / Chapter 1.1 --- Gonadotropin / Chapter 1.1.1 --- Structure --- p.2 / Chapter 1.1.2 --- Function --- p.3 / Chapter 1.1.3 --- Regulation --- p.4 / Chapter 1.1.3.1 --- Neuroendocrine and endocrine regulation of GTHs --- p.4 / Chapter 1.1.3.1.1 --- Hypothalamic neuropeptides and neurotransmitters --- p.6 / Chapter 1.1.3.1.2 --- Gonadal steroids --- p.7 / Chapter 1.1.3.2 --- Paracrine regulation of GTH --- p.8 / Chapter 1.2 --- Activin / Chapter 1.2.1 --- Structure --- p.8 / Chapter 1.2.2 --- Function --- p.9 / Chapter 1.2.3 --- Regulation of activin activity --- p.12 / Chapter 1.2.3.1 --- Intracellular blockade of activin signaling by Smad7 --- p.12 / Chapter 1.2.3.2 --- Extracellular control of activin access --- p.13 / Chapter 1.2.3.2.1 --- Inhibin --- p.13 / Chapter 1.2.3.2.2 --- Activin-binding protein --- p.14 / Chapter 1.3 --- Follistatin / Chapter 1.3.1 --- Structure --- p.14 / Chapter 1.3.2 --- Function --- p.16 / Chapter 1.3.3 --- Regulation in the pituitary --- p.19 / Chapter 1.4 --- Objectives of the Present Study --- p.20 / Chapter Chapter 2 --- Cloning and Recombinant Production of Goldfish Follistatin / Chapter 2.1 --- Introduction --- p.24 / Chapter 2.2 --- Materials and Methods / Chapter 2.2.1 --- Reagents --- p.26 / Chapter 2.2.2 --- Animal --- p.26 / Chapter 2.2.3 --- Extraction of total RNA and reverse transcription --- p.27 / Chapter 2.2.4 --- Cloning of full-length cDNA encoding goldfish follistatin --- p.27 / Chapter 2.2.5 --- Sequencing of the cDNA --- p.29 / Chapter 2.2.6 --- Distribution of follistatin mRNA in different tissues --- p.29 / Chapter 2.2.7 --- Production of rgFS --- p.30 / Chapter 2.2.8 --- RT-PCR of the rgFS-positive clones --- p.34 / Chapter 2.2.9 --- Extraction of genomic DNA from rgFS-positive clones --- p.34 / Chapter 2.2.10 --- Functional analysis of rgFS --- p.35 / Chapter 2.2.11 --- Data Analysis --- p.37 / Chapter 2.3 --- Results / Chapter 2.3.1 --- Cloning and sequence analysis of goldfish follistatin --- p.37 / Chapter 2.3.2 --- Tissue distribution of follistatin mRNA in the goldfish --- p.39 / Chapter 2.3.3 --- Production and bioassay of rgFS --- p.43 / Chapter 2.4 --- Discussion --- p.47 / Chapter Chapter 3 --- Function and Regulation of Follistatin in the Goldfish Pituitary; Evidence for an Intrinsic Activin/Follistatin Regulatory Feedback Loop / Chapter 3.1 --- Introduction --- p.54 / Chapter 3.2 --- Materials and Methods / Chapter 3.2.1 --- Reagents --- p.57 / Chapter 3.2.2 --- Animals --- p.57 / Chapter 3.2.3 --- Primary culture of dispersed pituitary cells --- p.57 / Chapter 3.2.4 --- RNA extraction and reverse transcription --- p.58 / Chapter 3.2.5 --- Ovariectomy on pituitary follistatin expression --- p.5 9 / Chapter 3.2.6 --- Seasonal expression profile of follistatin --- p.59 / Chapter 3.2.7 --- Validation of semi-quantitative RT-PCR assays --- p.61 / Chapter 3.2.8 --- Real-time PCR for assay on follistatin and β-actin expression --- p.61 / Chapter 3.2.9 --- Data analysis --- p.63 / Chapter 3.3 --- Results / Chapter 3.3.1 --- Expression of follistatin in the goldfish pituitary --- p.64 / Chapter 3.3.2 --- Validation of semi-quantitative RT-PCR assay --- p.64 / Chapter 3.3.3 --- Activin regulation of pituitary follistatin --- p.64 / Chapter 3.3.4 --- Effects of sex steroids on pituitary follistatin expression --- p.69 / Chapter 3.3.5 --- Effect of GnRH on follistatin expression in the pituitary --- p.74 / Chapter 3.3.6 --- Effect of intracellular cAMP level on pituitary follistatin expression --- p.74 / Chapter 3.3.7 --- Seasonal variation profile of goldfish pituitary follistatin --- p.78 / Chapter 3.4 --- Discussion --- p.78 / Chapter Chapter 4 --- General Discussion / Chapter 4.1 --- Overview --- p.89 / Chapter 4.2 --- Contribution of the Present Study / Chapter 4.2.1 --- Cloning of full-length goldfish follistatin cDNA --- p.91 / Chapter 4.2.2 --- Establishment of stable cell line for expression of rgFS --- p.92 / Chapter 4.2.3 --- Evidence for the presence of intrinsic feedback loop of activin in the goldfish pituitary --- p.92 / Chapter 4.2.4 --- Modulation of follistatin expression in the pituitary by sex steroids --- p.93 / Chapter 4.2.5 --- Conclusions --- p.93 / Chapter 4.3 --- Future Prospects / Chapter 4.3.1 --- Production of rgFS --- p.95 / Chapter 4.3.2 --- Regulation of activin-follistatin system in the pituitary --- p.95 / Reference --- p.96

Le CD36 est un récepteur de type éboueur de classe B exprimé à la surface de nombreux types cellulaires dont les macrophages, les cellules endothéliales de la microvasculature et les plaquettes. Ce récepteur multiligand est impliqué dans plusieurs processus pathologiques notamment l’athérosclérose, l’angiogénèse et la malaria via la liaison spécifique de ligands comme les lipoprotéines oxydées de basse densité, la thrombospondine-1 et la protéine PfEMP-1, respectivement. Les peptides de la relâche de l’hormone de croissance (GHRP) ont été identifiés comme les premiers ligands synthétiques du CD36. Afin de développer de nouveaux ligands synthétiques du CD36, l’établissement d’une méthode de criblage est essentiel pour découvrir des composés avec une liaison de haute affinité pour ce récepteur. Pour y parvenir, nous avons surexprimé le domaine extracellulaire du CD36 humain dans les cellules d’insectes Sf9. La protéine soluble purifiée par chromatographie d’affinité fut immobilisée à la surface d’une plaque de résonance de plasmons de surface (SPR) pour les études de liaison. La méthodologie développée a permis de caractériser les ligands du CD36 en déterminant leurs constantes de dissociation (KD), et d’établir une relation structure-activité des ligands de la famille des azapeptides, des composés dérivés du GHRP-6. Afin de valider la méthode par spectroscopie SPR, une corrélation a été établie entre les valeurs de KD obtenues en SPR et les valeurs d’CI50 de courbes d’inhibition de la phosphorylation des MAP kinases JNK1/2 induite par un phospholipide oxydé, le POVPC, en présence de concentrations croissantes de ligands du CD36 dans les macrophages RAW 264.7. / CD36 is a class B scavenger receptor expressed at the cell surface of macrophages, endothelial cells and platelets, among others. This multiligand receptor is implicated in various diseases such as atherosclerosis, angiogenesis and malaria through the specific binding of ligands, such as oxidized low-density lipoproteins, thrombospondin-1 and the PfEMP-1 protein, respectively. Growth hormone-releasing peptides (GHRP) were identified as the first CD36 synthetic ligands. In order to identify new CD36 synthetic ligands, the development of a high-throughput method is essential to unveil compounds of high binding affinity. We have expressed a recombinant CD36 ectodomain protein in Sf9 insect cells. The soluble and affinity purified protein was immobilized on a surface plasmon resonance (SPR) sensor for binding studies. Synthetic ligands were analyzed by SPR spectroscopy for determination of their respective dissociation constant (KD). A structure-activity relationship of CD36 ligands was established. To validate the SPR binding signal, a good correlation was observed between KD and the IC50 values obtained from the inhibition curves of the MAPK kinase JNK1/2 phosphorylation induced by an oxidized phospholipid, the POVPC, in the presence of increasing concentrations of CD36 ligands in RAW 264.7 macrophage cells.

京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(医学) / 乙第13362号 / 論医博第2204号 / 新制||医||1045(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 稲垣 暢也, 教授 渡邉 大, 教授 影山 龍一郎 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

La maladie cardiaque ischémique, la plus commune des maladies qui affectent le cœur, est encore aujourd’hui une importante cause de décès dans les pays industrialisés. Une réponse cardio-métabolique inflammatoire à un changement aigu initié par une modification du métabolisme énergétique du cœur ischémique est accentuée après que l’apport en oxygène ait été rétabli. Parmi les altérations délétères dans le myocarde qui en résultent, sont inclus l’accumulation d’acides gras non estérifiés (AGNE) ainsi que leur oxydation au détriment de l’utilisation du glucose, ce qui amplifie la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Les tissus en périphérie du cœur tel que le tissu adipeux peuvent affecter l’étendue des blessures au myocarde par la relâche en circulation de substances bioactives comme les AGNE et l’adiponectine. Le CD36 est le principal facilitateur de l’entrée d’AGNE dans le cœur et les adipocytes et constitue une importante cible métabolique spécialement lors d’un stress d’ischémie-reperfusion (I/R). Il a été rapporté précédemment par notre groupe qu’un ligand synthétique et sélectif envers le CD36 exerce un effet protecteur puissant sur le système vasculaire. Cependant, aucune étude in vivo n’a rapporté d’effet cardioprotecteur de ligands sélectifs envers le CD36. Ainsi, ce projet visait à évaluer le rôle et possiblement l’effet cardioprotecteur de ligands sélectifs du récepteur CD36 sur la blessure au myocarde en I/R. Des souris CD36+/+ et CD36-/- ont été traitées quotidiennement avec le EP 80317, le CP-3(iv) ou le véhicule pendant 14 jours avant de subir la ligature temporaire de l’artère coronaire antérieure descendante gauche (LAD). Notre première étude a montré que le EP 80317 exerce un effet cardioprotecteur puissant tel que montré par la réduction de la surface des lésions et l’amélioration de la fonction cardiaque in vivo suivant la blessure au myocarde en I/R. De plus, le EP 80317 a réduit l’internalisation totale d’AGNE dans le myocarde, mesurée in vivo par l’imagerie métabolique cardiaque, en accord avec la diminution du niveau circulant d’AGNE. Une réduction de la lipolyse révélée par une perfusion de radiotraceur de palmitate et une augmentation du niveau d’expression de gènes adipogéniques et anti-lipolytiques appuient davantage l’effet du EP 80317 dans la prévention de la mobilisation délétère d’acides gras du tissu adipeux. Notre deuxième étude a investigué le mécanisme cardioprotecteur d’une nouvelle génération de ligands dotés d’une plus grande affinité de liaison envers le CD36. Cette étude a montré que le CP-3(iv) est aussi pourvu d’un puissant effet cardioprotecteur comme le montre la réduction de la taille de l’infarctus et l’amélioration de la fonction cardiaque post-I/R du myocarde qui est fonction d’une signalisation métabolique et anti-oxydante de l’adiponectine. En effet, l’augmentation des principales voies de signalisation régulant la sécrétion de l’adiponectine et des gènes antioxydants a été démontrée dans le tissu adipeux suivant l’I/R du myocarde et un traitement avec le CP-3(iv). L’activation de la protéine kinase B ou Akt dans le myocarde avec la diminution de la génération de ROS et de la signalisation de mort cellulaire appuient davantage le rôle cardioprotecteur du CP-3(iv) dans l’I/R du myocarde. En conclusion, le travail présenté dans cette thèse soutient qu’une signalisation du CD36 par le EP 80317 et le CP-3(iv) pourrait s’avérer être une nouvelle approche thérapeutique dans le traitement de la maladie cardiaque ischémique. Ces ligands synthétiques sélectifs envers le CD36 provoquent un effet salutaire sur le myocarde ischémique par le biais d’une amélioration du profil métabolique dans les premières heures de la reperfusion. Le EP 80317 réduit le niveau délétère d’AGNE et leur internalisation dans le cœur en situation d’excès, tandis que le CP-3(iv) augmente le niveau bénéfique d’adiponectine et son effet cardioprotecteur. / Ischaemic heart disease, the most common cause of heart disease, is still today a leading cause of mortality in industrialized countries. An inflammatory cardiometabolic response to acute changes elicited by energetic substrate shift in the ischemic heart is amplified once the oxygen supply is reinstated. Resulting deleterious alterations include increased myocardial accumulation of non-esterified fatty acids (NEFA) and their oxidation at the expense of glucose, thus enhancing reactive oxygen species (ROS) generation. Peripheral tissues such as the adipose tissue can affect the extent of myocardial injury by releasing bioactive substances such as adiponectin and NEFA into the circulation. CD36 is the main facilitator of the entry of NEFA in the heart or adipocytes and constitutes an important metabolic target especially during an ischaemia-reperfusion (I/R) stress. It was previously reported by our group that a selective synthetic ligand of CD36 exerts potent protective effects on the vasculature. However, no study has reported the in vivo cardioprotective effects of selective CD36 ligands. Thus, this project aimed to evaluate the role and possibly cardioprotective effects of selective CD36 receptor ligands on myocardial I/R injury. CD36+/+ and CD36-/- mice were pretreated with EP 80317, CP-3(iv) or vehicle for 14 days prior to undergoing a transient occlusion of the left anterior descending (LAD) coronary artery. Our first study showed that EP 80317 exerted potent cardioprotective effects as shown by reduced lesion area and ameliorated cardiac function following in vivo myocardial I/R injury. Furthermore, EP 80317 reduced total myocardial NEFA uptake, as assessed by in vivo metabolic cardiac imaging, in agreement with reduced levels of circulating NEFA. Reduced lipolysis revealed by palmitate radiotracer infusion and increased expression levels of adipogenic and anti-lipolytic genes further support an effect of EP 80317 in preventing deleterious fatty acid mobilization from adipose tissue. Our second study investigated the cardioprotective mechanisms of a new generation of ligands with increased affinity towards CD36. This study showed that CP-3(iv) is also endowed of potent cardioprotective effects as shown by reduced infarct area and improved myocardial function following myocardial I/R injury which is mediated by an adiponectin metabolic and anti-oxidative signaling pathway. Indeed, main signaling pathways regulating adiponectin secretion and antioxidative genes were shown to be increased in adipose tissue following myocardial I/R and CP-3(iv) treatment. Myocardial protein kinase B or Akt activation along with reduced ROS generation and cell death signaling further support a cardioprotective role of CP-3(iv) in MI/R. In conclusion, work from this thesis support that CD36 signaling by EP 80317 and CP-3(iv) may constitute a novel therapeutic approach for the treatment of ischemic heart disease. These synthetic CD36 selective ligands provoke salutary effects on ischaemic myocardium by means of an ameliorated metabolic profile in the first hours of reperfusion. EP 80317 reduces deleterious NEFA levels and their uptake into the heart in time of excess, while CP-3(iv) increases beneficial adiponectin level and its cardioprotective effects.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Abstract not available