Modulation of the tumor microenvironment represents a possible way to inhibit cancer growth and enhance anti-cancer immune responses. In the presented work we employ two strategies for tumor microenvironment modulation. Firstly, we have constructed rVACV co-expressing the tumor suppressor gene insulin-like growth factor-binding protein-3 (IGFBP- 3) and the fusion gene encoding the immunogen SigE7LAMP. The expression of IGFBP-3 was regulated either by the early vaccinia virus H5 promoter or by the synthetic early/late (E/L) promoter. We have shown that expression of IGFBP-3 regulated by the H5 promoter yielded higher amounts of IGFBP-3 protein when compared with the E/L promoter. Immunization with P13-SigE7LAMP-H5-IGFBP-3 was more effective in inhibiting the growth of TC-1 tumors in mice and elicited a higher T-cell response against VACV-encoded antigens than the control virus P13-SigE7LAMP-TK- . We found that high-level production of IGFBP-3 enhanced virus replication both in vitro and in vivo, resulting in profound antigen stimulation. Production of IGFBP-3 was associated with a higher adsorption rate of P13-SigE7LAMP-H5-IGFBP-3 to CV-1 cells when compared with P13-SigE7LAMP-TK- . We have identified two structural differences between the IMVs of the IGFBP-3 expressing virus P13-SigE7LAMP-H5-IGFBP-3...

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur möglichen therapeutischen Bedeutung von IGFBP3 (Insulin-like-Growth Factor Binding Protein 3) beim Lungenkrebs in vitro durchgeführt. Es handelt sich bei IGFBP3 um das Hauptbin- dungsprotein für IGF (Insulin-like-Growth Factor), welches nachweißlich Einfluss auf die Regulation des IGF-Signalwegs und damit auf Zellwachstum, Zellprolifera- tion und Apoptose hat. Für die Untersuchungen wurde die NSCLC-Zelllinie H1299 stabil mit einem Vektor für das Gen IGFBP3 transfiziert. Als Kontrolle dienten einerseits die H1299-Zellen ohne Vektor, wie auch Zellen, welche nur den Vektor ohne cDNA enthielten. Bei den Untersuchungen sollte geklärt werden, inwieweit die Überexpression von IGFBP3 die Proliferation, Migration, Invasion und die Chemosensitivität von NSCLC (non small cell lung cancer) Zellen beeinflusst. Ziel war die Beantwortung der Frage, ob IGFBP3 die tumorgenen Eigenschaften von Lungenkarzinomzellen verändern kann und dadurch ein neues und interessantes Forschungsobjekt für die Therapie von Lungentumoren darstellt.:INHALTSVERZEICHNIS 1 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 3 1 EINFÜHRUNG 5 1.1 Lungenkrebs 5 1.1.1 Histologische Einteilung 6 1.1.2 Stadieneinteilung und Therapieoptionen 7 1.1.3 Zugelassenes Chemotherapeutikum Cisplatin 8 1.2 Tumorgene Eigenschaften 9 1.2.1 Tumorentstehung und Proliferation 9 1.2.2 Invasion 10 1.2.3 Migration 11 1.2.4 Angiogenese 12 1.3 IGF-Achse 12 1.3.1 IGF und IGF-Rezeptoren 13 1.3.2 IGF-Signalweg 14 1.3.3 IGFBPs 16 1.3.3.1 Struktur von IGFBP3 17 1.3.3.2 Funktionale Rolle von IGFBP3 18 1.4 Zellkulturen 19 1.4.1 NSCLC-Zelllinie H1299 20 1.4.2 pIRES-EGFP-Vektor 20 2 ZIELSTELLUNG 21 3 MATERIALIEN & METHODEN 23 3.1 Verwendete Materialien 23 3.1.1 Zelllinie & Vektor (Tab. 1) 23 3.1.2 Zellmedien (Tab. 2) 23 3.1.3 Chemikalien & Reagenzien (Tab. 3) 23 3.1.4 Gebrauchslösungen & Gele (Tab. 4) 25 3.1.5 Kommerzielle Assays / Kits (Tab. 5) 25 3.1.6 Laborbedarf, Geräte & Software (Tab. 6) 26 3.2 Methoden 29 3.2.1 Kultivieren der Zelllinie 29 3.2.1.1 Auftauen der Zellen 29 3.2.1.2 Umsetzen, Splitten und Passagieren der Zellen 30 3.2.1.3 Bestimmung der Transfektionsrate & Sortieren von Zellen 30 3.2.1.4 Zellen zählen 31 3.2.2 Versuchsaufbau Nachweis IGFBP3 Produktion und Einfluss auf das 2D-Wachstum 32 3.2.3 Versuchsaufbau Nachweis IGF-1-Bindung durch IGFBP3 32 3.2.4 Versuchsaufbau Bestimmung der 3D Proliferation & der Invasion 33 3.2.5 Versuchsaufbau Bestimmung der Migration 34 3.2.6 Zelllysate und Überstände für ELISA-Versuche 343.2.7 ELISA-Verfahren 35 3.2.8 BCA-Protein Assay 36 3.2.9 Versuchsaufbau Einfluss von IGFBP3 auf die Chemosensitivität 37 3.2.10 LDH-Test 37 3.2.11 MTT-Test 38 3.2.12 Bildaufnahmen und Statistische Auswertung 38 4 ERGEBNISSE 39 4.1 Nachweis der Produktion von IGFBP3 39 4.2 Verminderung von freiem IGF-1 nach Überexpression von IGFBP3 41 4.3 Einfluss von IGFBP3 auf das Zellwachstum 43 4.3.1 IGFBP3 hat keinen Einfluss auf das 2D – Wachstum 43 4.3.2 IGFBP3 vermindert die 3D - Proliferation 45 4.4 IGFBP3 vermindert die Invasion der Tumorzellen 48 4.5 IGFBP3 hat keinen Einfluss auf die Migration der Tumorzellen 49 4.6 Einfluss von IGFBP3 auf die Bildung von Angiogenesefaktoren VEGF und bFGF 50 4.7 IGFBP3 hemmt die Freisetzung von MMP-1 52 4.8 Einfluss von IGFBP3 auf die Chemosensitivität 53 4.8.1 Einfluss von IGFBP3 auf 2D- Kulturen nach Zugabe von Cisplatin 53 4.8.2 Einfluss von IGFBP3 auf die 3D- Proliferation nach Zugabe von Cisplatin 56 5 DISKUSSION 59 5.1 Überexpression von IGFBP3 und Verminderung von freiem IGF-1 59 5.2 Wachstum (2D und 3D) 60 5.3 Invasion und MMP-1 62 5.4 Migration 63 5.5 Veränderungen bei der Produktion von Angiogenesefaktoren 64 5.6 Veränderungen bei der Chemosensitivität der H1299- Zellen 65 5.7 Therapeutische Bedeutung von IGFBP3 bei NSCLC 67 6 ZUSAMMENFASSUNG 70 7 LITERATURVERZEICHNIS 73 8 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 75 9 TABELLENVERZEICHNIS 75 10 SELBSTSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG 76 11 LEBENSLAUF 77 12 DANKSAGUNG 78