<p>Antibody-drug conjugates (ADCs) combine the cytotoxicity of traditional chemotherapy with the site-specificity of antibodies by conjugating payloads to antibodies with immunoaffinity. However, the conjugation alters the physicochemical properties of antibodies, increasing the risks of various types of degradation. The effects of common risk factors such as pH, temperature, and light on the stability of ADCs differ from their effects on monoclonal antibodies (mAb) due to these altered physicochemical properties. </p> <p>To date, ADC researchers have developed linkers with improved <i>in vivo</i> stability, and begun to understand the deconjugation mechanisms <i>in vivo</i>. In contrast, the <i>in vitro</i> stability of ADCs has not gained comparable attention. All nine of the U.S. FDA approved ADCs are lyophilized to minimize the potential for degradation. However, there are few studies on the solid-state stability of ADCs. To evaluate lyophilized solids, pharmaceutical development relies heavily on accelerated stability studies, which take months to determine the best formulation. Characterization methods that are often used orthogonally with accelerated studies include Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR), Raman spectroscopy, near-infrared spectroscopy (NIR), differential scanning calorimetry (DSC), and x-ray powder diffraction (XRPD). Results from these methods are often poorly correlated with stability, however. Thus, stability evaluation of solid-state ADC products, and other recombinant protein drugs, is often a bottleneck in their development.</p> <p>To provide knowledge on how to improve the <i>in vitro</i> stability of lyophilized ADC formulations, the solid-state stability of ADC formulations with varying risk factors was studied in this dissertation project. The first study investigated interactions between an ADC and excipients in terms of solid-state stability enhancement. The second study investigated the process-driven instability of ADCs during lyophilization using various concentrations of ADCs. The first two studies incorporate a new method called solid-state hydrogen/deuterium exchange coupled with mass spectrometry (ssHDX-MS) as an analytical predictor of solid-state stability. The last study investigated the effects of pH on the stability of labile hydrazones, as a model for common linker chemistry used in ADCs. </p>

Die Entwicklung von makrocyclischen Chelatoren, die mit Kupferionen thermodynamisch stabile und kinetisch inerte Komplexe bilden, ist in den letzten Jahren zunehmend in den Fokus der Forschung gerückt. Das ergibt sich insbesondere aus der Möglichkeit, Radiokupfernuklide aufgrund günstiger kernphysikalischer Eigenschaften sowohl für diagnostische (64Cu) als auch therapeutische (67Cu) Anwendungen einzusetzen. Hervorzuheben ist der Azamakrocyclus Cyclam (1,4,8,11-Tetraazacyclodecan), da dieser mit Kupfer(II)-Ionen Komplexe hoher thermodynamischer Stabilität bildet. Zudem weist der Chelator weitere Funktionalisierungsmöglichkeiten auf, um in Hinblick auf eine nuklearmedizinische Anwendung pharmakologisch relevante Moleküle wie beispielsweise Peptide oder Proteine (Antikörper oder Antikörperfragmente) kovalent zu binden und damit eine spezifische Anreicherung im Tumorgewebe zu ermöglichen. Allerdings erfordert das Maßschneidern der Eigenschaften von neuen bifunktionellen Chelatoren Kenntnisse über den Einfluss der Substituten auf die Stabilität der gebildeten Kupfer(II)-Komplexe. Die thermodynamische Stabilität lässt keine Aussagen über das Verhalten in vivo zu. Die Ursache für die kinetische Labilität in Säugetieren ist noch nicht vollständig verstanden, wird aber u. a. auf kupferbindende Enzyme bzw. Proteine zurückgeführt. Die Bioverteilung der Radiokupferkomplexe wird aber auch von weiteren Parameter, wie Hydrophilie, Ladung und Polarisierbarkeit beeinflusst. Mit dieser Arbeit wurde ein wesentlicher Beitrag zur Entwicklung von 64Cu Chelaten auf Basis von Cyclam-Propionsäure-Liganden geleistet. Diese Stoffklasse ist bisher synthetisch wenig erschlossen und Radiokupfer-markierte Komplexe zudem bisher gar nicht beschrieben. Daher ist es von besonderem Interesse die kinetische Stabilität Radiokupfer-markierter Cyclam-Propionsäure-Derivate zu untersuchen und mit einer Reihe bekannter Radiokupfer-markierter Cyclam-Essigsäure-Komplexe zu vergleichen. Es wurden vier N-funktionalisierte Cyclam-Derivate 13, 14b, 15 und 16, die eine unterschiedliche Anzahl an Propionsäuregruppen tragen, erfolgreich synthetisiert und in sehr hoher Reinheit (>99%) isoliert. Besonders hervorzuheben ist die erstmalige Synthese des trans-N,N´´-funktionalisierten Cyclam-Propionsäure-Derivates 14b in hoher Ausbeute (gesamt = 32%). Von den Verbindungen 13, 14b, 15 und 16 sind entsprechende Kupfer(II)-Komplexe hergestellt worden. Zur Aufklärung relevanter Fragestellungen bezüglich der chemischen und geometrischen Eigenschaften sind verschiedene spektroskopische Methoden (Röntgeneinkristallstrukturanalyse, IR, UV/VIS, Elektronenspinresonanz-Spektroskopie) anhand von den isolierten Kupfer(II)-Komplexen CuII-13, CuII-14b und CuII-16 herangezogen worden. Die röntgenkristallografischen Strukturaufklärungen der Komplexe CuII-14b und CuII-16 weisen eine verzerrt quadratisch-pyramidale Koordinationsgeometrie auf. Das Ligandenfeld wird innerhalb der Stickstoffebene mit steigendem Substitutionsgrad schwächer. Das wurde auch durch ESR-Messungen bestätigt. Nachweislich verursachen die zusätzlichen funktionellen Gruppen eine kleinere Ligandenfeldaufspaltung. Weiterhin nahm die kinetische Stabilität unter stark sauren Bedingungen mit steigendem Substitutionsgrad ab. Der Vergleich mit den bekannten oktaedrischen Kupfer(II)-Cyclam-Essigsäure-Komplexen zeigt, dass die quadratisch-pyramidalen Kupfer(II)-Cyclam-Propionsäure-Derivate unter stark sauren Bedingungen schneller dissoziieren. Als Ursache können die unterschiedlichen Konfigurationen diskutiert werden, da bei 4N+2-Geometrien die thermodynamisch bevorzugte trans III-Konfigurationen gebildet wird. Radiochemische Untersuchungen zur Bewertung der kinetischen Stabilität in vitro und in vivo sind mit den 64Cu-markierten Liganden 13, 14b, 15 und 16 durchgeführt worden. Hierfür ist ein In-vitro-Stabilitätstest basierend auf dem kupferbindenden Enzym Superoxid-Dismutase (SOD) bzw. humanem Serum für radiomarkierte Verbindungen entwickelt worden. In humanem Serum ist Albumin (~66 kDa) in sehr hoher Konzentration enthalten und eines der wichtigsten Transportproteine für extrazelluläre Kupfer-Ionen. Aufgrund seiner Abundanz im Blutplasma ist im Serum-Assay jeweils nur eine stark ausgeprägte Bande bei ca. 66 kDa detektiert worden. Dieser etablierte In-vitro-Stabilitätstest beruht im Gegensatz zu anderen herkömmlichen Analysemethoden (Radio-HPLC oder Radio-DC) auf dem Prinzip der Gelelektrophorese. Von großem Vorteil ist, dass mehrere Proben simultan untersucht werden können und die Ergebnisse zuverlässig und reproduzierbar sind. Die In-vitro-Ergebnisse zeigen einen ähnlichen Trend wie bei der säure-assoziierten Dissoziation, wobei die höchste Stabilität bemerkenswerterweise bei dem [64Cu]Cu-14b Komplex bestimmt wurde. Allerdings beruht der Mechanismus hier nicht auf einer Dissoziation sondern auf einer Transchelatisierung. Die Ergebnisse der Bioverteilungen in Wistar-Ratten korrelieren mit den In-vitro-Studien in humanem Serum. Der Komplex [64Cu]Cu 14b zeigte sowohl eine schnelle renale Blut-Clearence als auch eine sehr geringe Anreicherung in der Leber und stellt damit eine Alternative zu den kommerziell erwerblichen Liganden dar. Als geeignete Chelatoren bieten Cyclam-Monopropionsäure 13 und Cyclam-Dipropionsäure 14b die Möglichkeit, Radiokupfernuklide stabil zu binden und erlauben die mehrfache Einführung von EGFR-spezifischen Peptiden an das Grundgerüst. Als Grundgerüst wurde der Ligand 13 ausgewählt. Durch die Multifunktionalisierung sollen höhere Affinitäten zum Rezeptor und verbesserte metabolische Stabilitäten hervorgerufen werden. Für diese Verbindung liegen erste vielversprechende Ergebnisse vor, wobei hohe Affinitäten zu zwei EGFR-positiven Zelllinien bestimmt wurden.

Die Entwicklung von makrocyclischen Chelatoren, die mit Kupferionen thermodynamisch stabile und kinetisch inerte Komplexe bilden, ist in den letzten Jahren zunehmend in den Fokus der Forschung gerückt. Das ergibt sich insbesondere aus der Möglichkeit, Radiokupfernuklide aufgrund günstiger kernphysikalischer Eigenschaften sowohl für diagnostische (64Cu) als auch therapeutische (67Cu) Anwendungen einzusetzen. Hervorzuheben ist der Azamakrocyclus Cyclam (1,4,8,11-Tetraazacyclodecan), da dieser mit Kupfer(II)-Ionen Komplexe hoher thermodynamischer Stabilität bildet. Zudem weist der Chelator weitere Funktionalisierungsmöglichkeiten auf, um in Hinblick auf eine nuklearmedizinische Anwendung pharmakologisch relevante Moleküle wie beispielsweise Peptide oder Proteine (Antikörper oder Antikörperfragmente) kovalent zu binden und damit eine spezifische Anreicherung im Tumorgewebe zu ermöglichen. Allerdings erfordert das Maßschneidern der Eigenschaften von neuen bifunktionellen Chelatoren Kenntnisse über den Einfluss der Substituten auf die Stabilität der gebildeten Kupfer(II)-Komplexe. Die thermodynamische Stabilität lässt keine Aussagen über das Verhalten in vivo zu. Die Ursache für die kinetische Labilität in Säugetieren ist noch nicht vollständig verstanden, wird aber u. a. auf kupferbindende Enzyme bzw. Proteine zurückgeführt. Die Bioverteilung der Radiokupferkomplexe wird aber auch von weiteren Parameter, wie Hydrophilie, Ladung und Polarisierbarkeit beeinflusst. Mit dieser Arbeit wurde ein wesentlicher Beitrag zur Entwicklung von 64Cu Chelaten auf Basis von Cyclam-Propionsäure-Liganden geleistet. Diese Stoffklasse ist bisher synthetisch wenig erschlossen und Radiokupfer-markierte Komplexe zudem bisher gar nicht beschrieben. Daher ist es von besonderem Interesse die kinetische Stabilität Radiokupfer-markierter Cyclam-Propionsäure-Derivate zu untersuchen und mit einer Reihe bekannter Radiokupfer-markierter Cyclam-Essigsäure-Komplexe zu vergleichen. Es wurden vier N-funktionalisierte Cyclam-Derivate 13, 14b, 15 und 16, die eine unterschiedliche Anzahl an Propionsäuregruppen tragen, erfolgreich synthetisiert und in sehr hoher Reinheit (>99%) isoliert. Besonders hervorzuheben ist die erstmalige Synthese des trans-N,N´´-funktionalisierten Cyclam-Propionsäure-Derivates 14b in hoher Ausbeute (gesamt = 32%). Von den Verbindungen 13, 14b, 15 und 16 sind entsprechende Kupfer(II)-Komplexe hergestellt worden. Zur Aufklärung relevanter Fragestellungen bezüglich der chemischen und geometrischen Eigenschaften sind verschiedene spektroskopische Methoden (Röntgeneinkristallstrukturanalyse, IR, UV/VIS, Elektronenspinresonanz-Spektroskopie) anhand von den isolierten Kupfer(II)-Komplexen CuII-13, CuII-14b und CuII-16 herangezogen worden. Die röntgenkristallografischen Strukturaufklärungen der Komplexe CuII-14b und CuII-16 weisen eine verzerrt quadratisch-pyramidale Koordinationsgeometrie auf. Das Ligandenfeld wird innerhalb der Stickstoffebene mit steigendem Substitutionsgrad schwächer. Das wurde auch durch ESR-Messungen bestätigt. Nachweislich verursachen die zusätzlichen funktionellen Gruppen eine kleinere Ligandenfeldaufspaltung. Weiterhin nahm die kinetische Stabilität unter stark sauren Bedingungen mit steigendem Substitutionsgrad ab. Der Vergleich mit den bekannten oktaedrischen Kupfer(II)-Cyclam-Essigsäure-Komplexen zeigt, dass die quadratisch-pyramidalen Kupfer(II)-Cyclam-Propionsäure-Derivate unter stark sauren Bedingungen schneller dissoziieren. Als Ursache können die unterschiedlichen Konfigurationen diskutiert werden, da bei 4N+2-Geometrien die thermodynamisch bevorzugte trans III-Konfigurationen gebildet wird. Radiochemische Untersuchungen zur Bewertung der kinetischen Stabilität in vitro und in vivo sind mit den 64Cu-markierten Liganden 13, 14b, 15 und 16 durchgeführt worden. Hierfür ist ein In-vitro-Stabilitätstest basierend auf dem kupferbindenden Enzym Superoxid-Dismutase (SOD) bzw. humanem Serum für radiomarkierte Verbindungen entwickelt worden. In humanem Serum ist Albumin (~66 kDa) in sehr hoher Konzentration enthalten und eines der wichtigsten Transportproteine für extrazelluläre Kupfer-Ionen. Aufgrund seiner Abundanz im Blutplasma ist im Serum-Assay jeweils nur eine stark ausgeprägte Bande bei ca. 66 kDa detektiert worden. Dieser etablierte In-vitro-Stabilitätstest beruht im Gegensatz zu anderen herkömmlichen Analysemethoden (Radio-HPLC oder Radio-DC) auf dem Prinzip der Gelelektrophorese. Von großem Vorteil ist, dass mehrere Proben simultan untersucht werden können und die Ergebnisse zuverlässig und reproduzierbar sind. Die In-vitro-Ergebnisse zeigen einen ähnlichen Trend wie bei der säure-assoziierten Dissoziation, wobei die höchste Stabilität bemerkenswerterweise bei dem [64Cu]Cu-14b Komplex bestimmt wurde. Allerdings beruht der Mechanismus hier nicht auf einer Dissoziation sondern auf einer Transchelatisierung. Die Ergebnisse der Bioverteilungen in Wistar-Ratten korrelieren mit den In-vitro-Studien in humanem Serum. Der Komplex [64Cu]Cu 14b zeigte sowohl eine schnelle renale Blut-Clearence als auch eine sehr geringe Anreicherung in der Leber und stellt damit eine Alternative zu den kommerziell erwerblichen Liganden dar. Als geeignete Chelatoren bieten Cyclam-Monopropionsäure 13 und Cyclam-Dipropionsäure 14b die Möglichkeit, Radiokupfernuklide stabil zu binden und erlauben die mehrfache Einführung von EGFR-spezifischen Peptiden an das Grundgerüst. Als Grundgerüst wurde der Ligand 13 ausgewählt. Durch die Multifunktionalisierung sollen höhere Affinitäten zum Rezeptor und verbesserte metabolische Stabilitäten hervorgerufen werden. Für diese Verbindung liegen erste vielversprechende Ergebnisse vor, wobei hohe Affinitäten zu zwei EGFR-positiven Zelllinien bestimmt wurden.