A descoberta da osteocalcina, uma proteína sintetizada por osteoblastos, como hormônio com efeitos positivos na resistência à insulina contribuiu para conceituar o osso como órgão endócrino. Pouco se conhece sobre os mecanismos moleculares de atuação da osteocalcina sobre o quadro de melhora de resistência à insulina, sendo assim o presente projeto teve o objetivo de desvendar alguns mecanismos moleculares da ação de osteocalcina na resistência à insulina e inflamação em camundongos obesos, e em adipócitos 3T3-L1. Camundongos controles, obesos tratados com solução salina e obesos tratados com osteocalcina não carboxilada foram submetidos aos testes de tolerância à insulina, ao piruvato e ao ensaio de sinalização da insulina in vivo, à coleta de sangue (análises bioquímicas e metabólicas), de tecido adiposo branco (TAB), de fígado e de fêmur. Os efeitos da osteocalcina não carboxilada na resistência à insulina e inflamação foram avaliados em adipócitos da linhagem 3T3-L1 desafiados com TNF-a. O conteúdo de mRNA foi analisado por PCR quantitativo e de proteína, por Western blotting. Os resultados obtidos mostraram que o tratamento com osteocalcina não carboxilada melhora a sensibilidade à insulina in vivo em camundongos obesos. No tecido adiposo branco (TAB), a osteocalcina teve efeitos positivos como a redução na massa do TAB periepididimal, o aumento a expressão do gene Slc2a4 e o conteúdo proteico de GLUT4, melhora na fosforilação de AKT estimulada pela sinalização da insulina, além de reduzir a expressão de genes relacionados à inflamação e à maquinaria transcricional do inflamassomo e reduzir focos inflamatórios caracterizados pela ausência de coroas de macrófagos. Em adipócitos 3T3-L1 desafiados com TNF-a, a osteocalcina recuperou o conteúdo de Slc2a4/GLUT4 e reduziu a expressão de genes inflamatórios, além de que o tratamento com osteocalcina aumentou a fosforilação de AKT induzida pela insulina. No fígado, a osteocalcina aumentou a sensibilidade à insulina e aumentou a fosforilação de AKT induzida pela insulina in vivo e reduziu a expressão de mRNA de Tnfa, sem alterar a expressão da proteína GLUT2 e de seu respectivo gene. No osso, a osteocalcina melhorou a resistência a insulina por favorecer a fosforilação de AKT induzida pela sinalização da insulina e por reduzir a expressão de genes envolvidos na resistência à insulina, resultando no aumento da secreção de osteocalcina não carboxilada na circulação. Em conclusão, conseguiu-se demonstrar alguns mecanismos de ação da osteocalcina na melhora do quadro de resistência à insulina na obesidade, em que no TAB a osteocalcina melhora a resistência à insulina por diminuir a inflamação e aumentar a sinalização da insulina e a expressão de Slc2a4/GLUT4; no fígado, a osteocalcina melhorou a sinalização insulínica e reduziu a expressão de Tnfa; e no osso a osteocalcina aumentou a secreção de osteocalcina não carboxilada por melhorar a resistência à insulina. / The discovery of osteocalcin, a protein synthetized by osteoblasts, as a hormone that has positive effects on insulin resistance, contributed to support the concept of bone as an endocrine organ. However, very little is known about the molecular pathways involved in osteocalcin improved-insulin resistance. The presente study aimed to investigate the mechanisms of action of osteocalcin on insulin resistance and inammation in obese mice and 3T3-L1 adipocytes. Lean control, saline-treated obese and uncarboxylated osteocalcin (uOC)-treated obese mice were subjected to insulin and pyruvate tolerance test and insulin signaling assessment in vivo. Blood was collect for biochemical/metabolic prole analysis; and, liver, skeletal muscle, white adipose tissue(WAT) and bone were collected for protein (Western blotting) and mRNA (RT-qPCR) analysis. uOC effects on insulin resistance and inammation were also investigated in 3T3-L1 adipocytes challenged with tumor necrosis factor. Osteocalcin treatment improved in vivo insulin resistance in obese mice. In WAT, osteocalcin had positive effects such as WAT weight reduction; upregulation of glucose transporter (GLUT4) protein and its mRNA (Slc2a4); improved insulin-induced AKT phosphorylation; downregulation of several genes involved in inammation and inammassome transcriptional machinery, and reduction of the density of macrophage in crown-like structures (histomorphometrical analysis). Notably, in 3T3-L1 adipocytes, osteocalcin restored Slc2a4/GLUT4 content and reduced the expression of inammatory genes after TNF-a challenge; moreover, osteocalcin treatment increased AKT phosphorylation induced by insulin. In liver, osteocalcin treatment improved insulin resistance and increased AKT phosphorylation induced by insulin, and reduced the expression of Tnfa, not changing the expression of glucose transporter (GLUT2) protein and its mRNA (Slc2a2). Finally, it was observed that in bone, osteocalcin improves insulin resistance by increasing insulin-induced AKT phosphorylation and reducing the expression of genes involved in bone insulin resistance, resulting in increased secretion of uncarboxylated osteocalcin in circulation. We provided some mechanisms of action for osteocalcin in the amelioration of insulin resistance in obesity: in WAT, osteocalcin improves insulin resistance by decreasing inammation, and increasing insulin signaling and the expression of Slc2a4/GLUT4; in liver, the osteocalcin improved insulin resistance and reduced Tnfa expression; and, in bone, osteocalcin increases the secretion of uncarboxylated osteocalcin by improving insulin resistance.

Em nosso laboratório foi demonstrado que ratos submetidos à restrição crônica de sal na dieta apresentaram maior peso corpóreo (PC), menor sensibilidade à insulina e alterações pressóricas em comparação com ratos submetidos à sobrecarga crônica de sal na dieta. No presente estudo, o objetivo foi avaliar alguns mecanismos de obesidade e alterações hormonais associados à dieta hipossódica. Foram utilizados ratos Wistar machos submetidos à dieta hipo (HO: 0,15% NaCl), normo (NO: 1,27% NaCl) ou hipersódica (HR: 7,94% NaCl) desde o desmame até 12 semanas de idade. Nestes animais foram realizadas medidas de pressão arterial (PA), freqüência cardíaca (FC), consumo de ração, PC, perfil dos hormônios [leptina (LEP), GH, insulina (INSh - anticorpo anti-insulina humana), T3, T4 e TSH] e decaimento da 125I-insulina (DEC-INS). O consumo de ração foi avaliado durante sete dias consecutivos com um (1G) ou quatro (4G) ratos por gaiola de plástico e com um rato por gaiola metabólica (1GM). O PC também foi medido neste período. Glicemia (GLI) e insulinemia (INSr - anticorpo anti-insulina de rato) basais foram quantificadas antes da realização do estudo do DEC-INS. Para avaliar o DEC-INS, foi injetado 1mCi de 125I-insulina humana pelo cateter implantado na veia jugular, após 6 a 8 horas de jejum fisiológico. As amostras de sangue foram coletadas pelo cateter implantado na carótida a cada 30 segundos durante 2 minutos e depois a cada 1 minuto até 10 minutos de experimento. Os resultados obtidos demonstraram que ratos submetidos à dieta HR apresentaram maior PA em comparação a ratos em dieta NO e HO. Os ratos submetidos à dieta HO apresentaram menor FC cardíaca em relação ao grupo NO. A avaliação de ingestão alimentar revelou que ratos em dieta HR consumiram maiores quantidades de ração (1G e 4G) em comparação com ratos em dieta NO e HO. O grupo HO apresentou maior PC em comparação com os grupos de ratos NO e HR. Os ratos em dieta HR ou HO apresentaram níveis diminuídos de LEP em comparação com ratos submetidos à dieta NO. Os ratos que receberam dieta HO apresentaram níveis elevados de INSr em comparação com ratos em dieta HR e NO. Os ratos em dieta HR apresentaram níveis elevados de T4 total e níveis reduzidos de TSH em comparação com animais em dieta NO e HO. INSr e GLI basais foram maiores nos ratos em dieta HO do que nos ratos que receberam dieta HR e NO. O DEC-INS (decaimento exponencial) foi mais rápido no grupo HR demonstrado por meio de menor meia-vida da 125I-insulina. Os resultados sugerem que maior PC nos ratos sob restrição salina crônica é devido a maior eficiência metabólica (maior PC e menor consumo de dieta) que pode estar relacionada com alterações hormonais e com a dieta HO. Palavras-chave: Pressão arterial, sal, sódio, ingestão alimentar e perfil hormonal. / Previous studies from our laboratory have shown that chronic salt restriction decreases blood pressure, increases insulin resistance, and body weight (BW) in Wistar rats. The aim of this study was to evaluate some mechanisms of obesity and hormonal alterations associated with chronic salt restriction. Male Wistar rats were fed a low (LSD: 0,15% NaCl), normal (NSD: 1,27% NaCl), or high salt diet (HSD: 7,94% NaCl) from weaning. At the 12th week of age, tail-cuff blood pressure (TCBP), intra arterial blood pressure (BP), heart rate ((HR), food intake, BW, hormonal levels [leptin (LEP), growth hormone (GH), insulin (INSh - antibody anti-human insulin), T3, T4 and TSH] and 125I insulin decay study (DECAY-INS) were measured. To evaluate the food intake and body weight, each dietary group was divided in 3 subgroups, according to housing conditions: one (1C) or four (4C) rats per cage and one rat per metabolic cage (1MC) for daily food consumption and BW determinations during 7 days. Fasting plasma glucose (GLU) and insulin (INSr - antibody anti-rat insulin) were measured before the DECAY-INS. To evaluate the DECAY-INS, 1mCi human 125I-insulin was injected through the jugular catheter after 6-8 hours of food restriction. Blood samples were withdrawn through the carotid catheter every 30 sec during 2min, and in sequence, every 1 min for additional 10 minutes. 125Iinsulin was determined by RIA for human insulin. Rats on HSD had higher intra arterial BP and TCBP compared to rats on NSD and LSD. Heart rate was lower on LSD than on NSD. In all housing conditions, BW was higher on LSD than on NSD and HSD. Food intake was higher on HSD (1C and 4C) than on NSD and LSD. Plasma GH and LEP were higher on NSD than on the 68 other two groups. Plasma INSh was higher in LSD compared to HSD and NSD rats. Plasma total T4 was higher on HSD than on the NSD and LSD, TSH was lower on HSD than on NSD and HSD, and T3 was not different among all groups. Fasting GLU and INSr were higher on LSD compared to HSD and NSD rats. The exponential insulin decay was faster on HSD demonstrated by a lower 125I-INS half-life. These results suggest that obesity in rats on chronic LSD is due to a higher metabolic efficiency (higher body weight and lower diet consumption), that may be related to the hormonal consequences of LSD. Key Words: blood pressure, salt, sodium, food intake and hormonal profile.

Em nosso laboratório foi demonstrado que ratos submetidos à restrição crônica de sal na dieta apresentaram maior peso corpóreo (PC), menor sensibilidade à insulina e alterações pressóricas em comparação com ratos submetidos à sobrecarga crônica de sal na dieta. No presente estudo, o objetivo foi avaliar alguns mecanismos de obesidade e alterações hormonais associados à dieta hipossódica. Foram utilizados ratos Wistar machos submetidos à dieta hipo (HO: 0,15% NaCl), normo (NO: 1,27% NaCl) ou hipersódica (HR: 7,94% NaCl) desde o desmame até 12 semanas de idade. Nestes animais foram realizadas medidas de pressão arterial (PA), freqüência cardíaca (FC), consumo de ração, PC, perfil dos hormônios [leptina (LEP), GH, insulina (INSh - anticorpo anti-insulina humana), T3, T4 e TSH] e decaimento da 125I-insulina (DEC-INS). O consumo de ração foi avaliado durante sete dias consecutivos com um (1G) ou quatro (4G) ratos por gaiola de plástico e com um rato por gaiola metabólica (1GM). O PC também foi medido neste período. Glicemia (GLI) e insulinemia (INSr - anticorpo anti-insulina de rato) basais foram quantificadas antes da realização do estudo do DEC-INS. Para avaliar o DEC-INS, foi injetado 1mCi de 125I-insulina humana pelo cateter implantado na veia jugular, após 6 a 8 horas de jejum fisiológico. As amostras de sangue foram coletadas pelo cateter implantado na carótida a cada 30 segundos durante 2 minutos e depois a cada 1 minuto até 10 minutos de experimento. Os resultados obtidos demonstraram que ratos submetidos à dieta HR apresentaram maior PA em comparação a ratos em dieta NO e HO. Os ratos submetidos à dieta HO apresentaram menor FC cardíaca em relação ao grupo NO. A avaliação de ingestão alimentar revelou que ratos em dieta HR consumiram maiores quantidades de ração (1G e 4G) em comparação com ratos em dieta NO e HO. O grupo HO apresentou maior PC em comparação com os grupos de ratos NO e HR. Os ratos em dieta HR ou HO apresentaram níveis diminuídos de LEP em comparação com ratos submetidos à dieta NO. Os ratos que receberam dieta HO apresentaram níveis elevados de INSr em comparação com ratos em dieta HR e NO. Os ratos em dieta HR apresentaram níveis elevados de T4 total e níveis reduzidos de TSH em comparação com animais em dieta NO e HO. INSr e GLI basais foram maiores nos ratos em dieta HO do que nos ratos que receberam dieta HR e NO. O DEC-INS (decaimento exponencial) foi mais rápido no grupo HR demonstrado por meio de menor meia-vida da 125I-insulina. Os resultados sugerem que maior PC nos ratos sob restrição salina crônica é devido a maior eficiência metabólica (maior PC e menor consumo de dieta) que pode estar relacionada com alterações hormonais e com a dieta HO. Palavras-chave: Pressão arterial, sal, sódio, ingestão alimentar e perfil hormonal. / Previous studies from our laboratory have shown that chronic salt restriction decreases blood pressure, increases insulin resistance, and body weight (BW) in Wistar rats. The aim of this study was to evaluate some mechanisms of obesity and hormonal alterations associated with chronic salt restriction. Male Wistar rats were fed a low (LSD: 0,15% NaCl), normal (NSD: 1,27% NaCl), or high salt diet (HSD: 7,94% NaCl) from weaning. At the 12th week of age, tail-cuff blood pressure (TCBP), intra arterial blood pressure (BP), heart rate ((HR), food intake, BW, hormonal levels [leptin (LEP), growth hormone (GH), insulin (INSh - antibody anti-human insulin), T3, T4 and TSH] and 125I insulin decay study (DECAY-INS) were measured. To evaluate the food intake and body weight, each dietary group was divided in 3 subgroups, according to housing conditions: one (1C) or four (4C) rats per cage and one rat per metabolic cage (1MC) for daily food consumption and BW determinations during 7 days. Fasting plasma glucose (GLU) and insulin (INSr - antibody anti-rat insulin) were measured before the DECAY-INS. To evaluate the DECAY-INS, 1mCi human 125I-insulin was injected through the jugular catheter after 6-8 hours of food restriction. Blood samples were withdrawn through the carotid catheter every 30 sec during 2min, and in sequence, every 1 min for additional 10 minutes. 125Iinsulin was determined by RIA for human insulin. Rats on HSD had higher intra arterial BP and TCBP compared to rats on NSD and LSD. Heart rate was lower on LSD than on NSD. In all housing conditions, BW was higher on LSD than on NSD and HSD. Food intake was higher on HSD (1C and 4C) than on NSD and LSD. Plasma GH and LEP were higher on NSD than on the 68 other two groups. Plasma INSh was higher in LSD compared to HSD and NSD rats. Plasma total T4 was higher on HSD than on the NSD and LSD, TSH was lower on HSD than on NSD and HSD, and T3 was not different among all groups. Fasting GLU and INSr were higher on LSD compared to HSD and NSD rats. The exponential insulin decay was faster on HSD demonstrated by a lower 125I-INS half-life. These results suggest that obesity in rats on chronic LSD is due to a higher metabolic efficiency (higher body weight and lower diet consumption), that may be related to the hormonal consequences of LSD. Key Words: blood pressure, salt, sodium, food intake and hormonal profile.