Les dimères interbrins sont des lésions de type complexe, où les deux brins d'ADN sont pontés de façon covalente. Par conséquent, ce type de lésion est très toxique pour la cellule, car il nuit à la séparation des brins d'ADN nécessaire à des processus cruciaux pour la cellule, comme la réplication et la transcription. De plus, des expériences récentes montrent que la réparation des dimères interbrins passe par la formation d'un bris double brin, une autre lésion avec un potentiel toxique élevé. Ce n'est que tout récemment qu'on a montré que la radiation ionisante menait à la formation de dimères interbrins dans l'ADN cellulaire. On en sait donc encore très peu sur les conditions dans lesquelles se produisent les dimères et comment ils sont réparés. Récemment, à la suite d'une exposition aux radiations ionisantes, notre groupe a mis en évidence la formation de dimères interbrins dans un ADN où une thymidine avait été remplacée par le 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU). Ces dimères n'étaient formés que lorsque le BrdU se trouvait au centre d'une zone mésappariée. Puisque c'était la première fois que ce type de dommage était observé lors d'une exposition de l'ADN bromé à la radiation ionisante, ma thèse a porté sur l'exploration de la formation du dimère interbrin, particulièrement sur les conditions qui favorisaient sa formation.Les trois articles présentés dans cette thèse montrent que la forme de l'ADN (forme A vs forme B), la séquence, ainsi que le type de radiation employé ont une influence importante sur le type et la fréquence du dommage produit. Ces résultats montrent qu'on en sait encore très peu sur le mécanisme réel de radiosensibilisation de l'ADN bromé dans les cellules. Cependant, ils mettent aussi en évidence la réactivité distincte des régions rnésappariées de l'ADN, ainsi que leur fort potentiel pour la formation de dimères. Or, ces régions mésappariées ne représentent qu'une fraction des structures secondaires et tertiaires de l'ADN présentes dans la cellule.

Ce mémoire est présenté à la Faculté de médecine et des sciences de la santé de l'Université de Sherbrooke en vue de l'obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.) en radiobiologie (2009). Un jury a révisé les informations contenues dans ce mémoire. Il était composé de professeurs de la Faculté de médecine et des sciences de la santé soit : Darel Hunting PhD, directeur de recherche (département de médecine nucléaire et radiobiologie), Léon Sanche PhD, directeur de recherche (département de médecine nucléaire et radiobiologie), Richard Wagner PhD, membre du programme (département de médecine nucléaire et radiobiologie) et Guylain Boissonneault PhD, membre extérieur au programme (département de biochimie). Le 5-bromodéoxyuridine (BrdU), un analogue halogéné de la thymidine reconnu depuis les années 60 comme étant un excellent radiosensibilisateur. L'hypothèse la plus répandue au sujet de l'effet radio sensibilisant du BrdU est qu'il augmente le nombre de cassures simple et double brin lorsqu'il est incorporé dans l'ADN de la cellule et exposé aux radiations ionisantes. Toutefois, de nouvelles recherches semblent remettre en question les observations précédentes. Ces dernières études ont confirmé que le BrdU est un bon radiosensibilisateur, car il augmente les dommages radio-induits dans l'ADN. Mais, c'est en étant incorporé dans une région simple brin que le BrdU radiosensibilise l'ADN. Ces recherches ont également révélé pour la première fois un nouveau type de dommages produits lors de l'irradiation de l'ADN contenant du BrdU : les dimères interbrins. Le but de ces travaux de recherche est de déterminer si la présence de bromodéoxyuridine dans l'ADN augmente l'induction de bris simple et / ou double brin chez les cellules irradiées en utilisant de nouvelles techniques plus sensibles et spécifiques que celles utilisées auparavant. Pour ce faire, les essais comètes et la détection des foci H2AX phosphorylée pourraient permettre d'établir les effets engendrés par le BrdU au niveau cellulaire. Notre hypothèse (basée sur des résultats préliminaires effectués dans notre laboratoire) est que l'irradiation de l'ADN cellulaire en présence de BrdU augmentera le nombre de bris simple brin sans toutefois augmenter le nombre de bris double brin. Les résultats présentés dans ce mémoire semblent corroborer cette hypothèse. Les nouvelles méthodes d'analyse, soient l'essai comète et la détection des foci [gamma]-H2AX remettent en question ce qui a été dit sur le BrdU au sujet de l'induction des cassures double brin depuis plusieurs années. L'ensemble de ces nouveaux résultats effectué à l'aide de cellules ayant incorporées du BrdU sont en corrélation avec de précédents résultats obtenus dans notre laboratoire sur des oligonucléotides bromés. Ils réaffirment que l'irradiation combinée au BrdU augmente l'induction de bris simple brin mais pas de bris double brin. L'investigation approfondie des mécanismes d'action non élucidés du BrdU au niveau cellulaire et son utilisation à des moments stratégiques pendant le traitement de radiothérapie pourraient accroître son efficacité à des fins d'utilisation clinique.

Les facteurs endogènes et exogènes induisent diverses modifications chimiques et structurales dans l’ADN cellulaire et sont à l’origine de nombreuses erreurs lors de la réplication et de la division cellulaire. Elles sont souvent à l’origine de cancers et de maladies chroniques liées à l’âge. Les agents alkylants induisent des lésions complexes de l’ADN. Ils sont utilisés comme des outils efficaces dans les traitements par chimiothérapies. Les deux caractéristiques majeures des lésions complexes de l’ADN sont d’une part l’encombrement et d’autre part la présence de plus d’une modification dans un tour d’hélice. Les données biochimiques et génétiques montrent que l’élimination des dommages complexes de l’ADN nécessitent plusieurs voies de réparation distinctes. Les caractéristiques cliniques des maladies héréditaires caractérisées par des désordres de réparation de l’ADN, comme l’anémie de Fanconi et le syndrome de Cockayne, visent la nature complexe des lésions oxydatives endogène incluant les adduits encombrants et les pontages interbrins (PIBs). D’autre part, les effets biologiques sévères des agents ionisants, des traitements de chimiothérapie et des cancérigènes environnementaux sont impliqués dans la formation de cassures double brins, des PIBs et des adduits encombrants. Bien que ces derniers représentent une faible proportion des dommages de l’ADN induit par stress oxydatif et les agents chimiques dans les cellules, ils sont extrêmement cytotoxiques s’ils ne sont pas réparés. Par exemple, les cellules cancéreuses sont très sensibles aux PIBs et aux cassures double brins. Alors que la consommation de produits contenant de l’acide aristolochique (AA), qui génère des adduits encombrants dans l’ADN cellulaire, peut être à l’origine de neuropathies et a été associé à une cancérogénèse plus élevée que la fumée de cigarette. L’objectif majeur de ce projet est l’étude de la réparation des lésions complexes de l’ADN et leur implication dans le développement des cancers et leur thérapie. Dans cette présente étude, nous nous sommes intéressés aux mécanismes moléculaires de la réparation des PIBs et des adduits encombrants de l’ADN et leurs possibles rôles dans la chimio- et radiorésistance acquise. De plus, nous avons étudié le mécanisme moléculaire impliqué dans la mutagénèse induite par la réparation aberrante des adduits encombrants initiée par des ADN glycosylases de la voie BER dans des cellules bactériennes et de mammifères. Durant les trois années de thèse, (i) j’ai construit et caractérisé différents substrats d’ADN contenant diverses bases oxydées, des PIBs induits par le psoralène, des adduits encombrants aristolactame et des photoproduits issus des UV, (ii) j’ai purifié divers ADN glycosylases recombinantes (TDG, MBD4, NEIL1 et NEIL3), (iii) j’ai reconstruit in vitro la réparation des lésions de l’ADN et (iv) j’ai également étudié les interactions protéine-protéine et les modifications post-traductionnelles des protéines impliquées dans la réparation des PIBs générés par le cisplatine initiée par les ADN glycosylases NEIL1 et NEIL3. En combinant les différentes approches développées dans notre laboratoire, nous avons identifié et caractérisé des voies de réparation alternatives impliquées dans l’élimination des dommages complexes de l’ADN. Les résultats obtenus dans ce travail permettraient de comprendre la mécanistique du développement de certains cancers et à identifier les facteurs associés à la chimio- radiorésistance des cellules cancéreuses et par conséquent contribuer au développement de nouvelles préventions de stratégies thérapeutiques. / Endogenous and exogenous mutagenic factors induce variety of chemical and structural modifications in cellular DNA that are at the origin of errors that occur during DNA replication and cell division and often give rise to cancer and other age-related chronic diseases. Importantly, alkylating agents which induce complex DNA lesions are used as a powerful tool for anti-cancer chemotherapy. Two most important features of complex DNA lesions are their bulky character and presence of more than one modification within one turn of DNA helix. Genetic and biochemical data indicate that the elimination of complex DNA lesions requires several distinct DNA repair pathways. The clinical features of inherited human DNA repair deficient disorders such as Fanconi anemia and Cockayne syndrome point to complex nature of endogenous oxidative DNA damage which include bulky adducts and inter-strand DNA crosslinks (ICLs). On the other hand, severe biological effects of ionizing radiation, anticancer drugs and environmental carcinogens are correlated with formation of dirty DNA strand breaks, ICLs and bulky adducts. Although complex lesions typically constitute relatively small fraction of the total DNA damage induced by oxidative stress and drugs in cells, they are extremely cytotoxic if not repaired. For example, cancer cells are primarily very sensitive to ICLs and dirty DNA strand breaks. While, consumption of products containing aristolochic acid (AA), which generates bulky adenine DNA adducts in cellular DNA, can cause neuropathy and has been associated with higher risk of cancer than cigarette smoking. The major objective of the present project is to study the repair of complex DNA lesions and their implications in cancer development and therapy. Here, we investigated molecular mechanisms of the repair of ICLs and bulky DNA lesions and their possible role in the acquired chemo-resistance of cancer cells. In addition, we studied the molecular mechanism of mutagenesis induced by the aberrant DNA glycosylase-mediated BER towards bulky adducts in bacterial and mammalian cells. During three years of the project, I have (i) constructed and characterized DNA substrates containing various oxidized bases, psoralen-derived ICLs, bulky aristolactam-adenine adducts and UV photoproducts; (ii) purified several recombinant human DNA glycosylases (TDG, MBD4. NEIL1 and NEIL3); (iii) reconstituted in vitro the repair of complex DNA lesions; and finally (iv) studied the protein-protein interactions and post-translational protein modifications involved in the DNA glycosylases NEIL1 and NEIL3 initiated repair of cis-platinum induced ICLs. By combining the approaches developed in our laboratories we have identified and characterized alternative DNA repair pathways involved in the cellular processing of complex DNA damage. The results obtained in present work can provide mechanistic understanding of the development of certain cancer and lead to identification of the factors associated with the acquired chemo- and radio-resistance of tumour cells and therefore would contribute to development of new prevention and therapeutic strategies.