N-linked glycosylation often imparts important properties to protein therapeutics. An essential step in this intracellular process is the transfer of oligosaccharide from dolichol monophosphate (Dol-P) to a potential glycosylation site. Variability in the success rate of this reaction affects the extent of protein glycosylation. The critical role of Dol-P suggests that its availability may influence the extent of glycosylation by limiting the pool of lipid-linked oligosaccharides (LLOs), the glycosyl donor. To test this hypothesis, the impact of Dol-P supplementation on protein glycosylation in Chinese hamster ovary (CHO) cells was investigated. Although exogenous Dol-P was incorporated by CHO cells and processed into LLOs in a dose-dependent manner, Dol-P supplementation had no marked effects on LLO or overall cellular glycosylation levels. While concentrations of exogenous Dol-P exceeding 100 µg/ml were detrimental to CHO cell viability, maximum non-toxic supplemental doses of Dol-P had no significant impact on the glycosylation of recombinant interferon-γ produced by batch cultures of CHO cells. These results show that glycosylation in CHO cells cannot be readily enhanced by Dol-P feeding under normal culture conditions. / Singapore-MIT Alliance (SMA)

Interferon γ is an important T-cell helper type 1 (Th1) cytokine involves in antimicrobial immunity. It is a part of the inflammatory immune response in the site of infection. However, for its proper function, the regulation of immunity is necessary to avoid injury of the tissue caused by long-term inflammation. While interferon γ triggers expression of proinflammatory genes, it also regulates genes which inactivate immune response. The B7-H1 molecule belongs among these inhibitory regulators. Furthermore, antitumour effect of interferon γ is well-known as well. After extensive experiments, interferon γ was tested as an immunotherapeutic drug against melanomas in clinical trials. However, the trials had to be terminated prematurely because of unsuccessful results. It started to be clear that interferon γ could have also a protumour effect. Interferon γ upregulates the expression of B7-H1 molecule which aids tumour in escape from immunity. The B7-H1 molecule possesses a binding site for interferon regulatory factor 1 (IRF-1) in its promoter region. This IRF-1 is induced by interferon γ - JAK/STAT signalling pathway. In our previous research, we observed interferon γ induced DNA demethylation of promoters in genes that are involved in antigen presenting machinery. Additionally, DNA methylation of...

Les anticorps monoclonaux (AcM) ont été utilisés pour traiter des cancers dès le début des années 1980, en particulier lors du travail pionnier de l’équipe de Ronald Levy dans le traitement des lymphomes. Ces traitements ont pendant longtemps été considérés comme une sérothérapie passive à effet immédiat et à court terme. Cependant, au cours de ces dernières années, le concept d’un effet « vaccinal » des anticorps à usage thérapeutique en oncologie a peu à peu vu le jour du fait de réponses cliniques à long terme observées chez certains patients et de différentes études précliniques. En 2010, notre équipe a démontré que des souris immunocompétentes injectées avec les cellules tumorales EL4-huCD20 et traitées avec un AcM anti-huCD20 générait une réponse immunitaire anti-tumorale à long-terme par le biais de mécanismes dépendants de la région constante de l’anticorps et de lymphocytes T CD4+. Mon travail de thèse a donc porté sur l’analyse des mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels le traitement par un AcM anti-CD20 génère une immunité cellulaire adaptative anti-tumorale. J’ai ainsi pu montrer que le traitement des souris avec l’AcM anti-CD20 conduit à une expansion de lymphocytes Th1 producteurs d’IFN-γ, à l’apparition de lymphocytes T CD4+ effecteurs mémoires spécifiques des cellules tumorales CD20+, et au blocage de l’expansion de lymphocytes Tregs induite par les cellules tumorales. Le rôle central dans la protection anti-tumorale et la genèse d’une réponse adaptative anti-tumorale joué par l’axe IL-12/IFN-γ et leurs principales sources cellulaires, cellules dendritiques (DCs) et cellules NK, a été démontré par des expériences de neutralisation de ces cytokines, qui provoque une importante diminution du nombre de Th1 spléniques, de déplétion des cellules NK, ainsi que par des analyses phénotypiques qui ont permis d’identifier des DCs activées par le traitement - comme le montre l’expression accrue des molécules de classe II du CMH et de co-stimulation CD80 et CD86 - comme une importante source cellulaire de l’IL-12. Enfin, nous avons pu montrer qu’un variant de l’IL-2, liant préférentiellement le récepteur de l’IL-2By et faiblement le récepteur de l’IL-2aBy exprimé majoritairement par les Tregs, permettait l’obtention d’une protection anti-tumorale accrue d’animaux porteurs de tumeurs et traités par l’AcM anti-CD20. En conclusion, nous avons démontré qu’un contexte immunitaire pro-tumoral façonné par la présence d’une tumeur en développement peut être inversé par le traitement par un anticorps anti-tumoral, aboutissant à un contexte anti-tumoral. Qu’une telle réponse immunitaire adaptative cellulaire puisse être observée chez des patients atteints de lymphomes, traités par un anticorps anti-CD20, reste encore à être déterminé. / Monoclonal antibodies have been used to treat cancers since the early 1980s, in particular with the pioneer work of Ronald Levy for the treatment of lymphomas. Those treatments have been considered for a long time as a passive serotherapy with immediate and short term actions. Yet, recently, the idea of a vaccine effect of therapeutic antibodies in oncology have appeared, after preclinical studies and clinic observations suggesting a long term immune response in patients. In 2010, our team demonstrated that immunocompetent mice injected with EL4-huCD20 tumor cells and treated with anti-huCD20 monoclonal antibody generated a long term anti-tumor immune response linked with mechanisms dependent on constant part of antibodies and CD4+ T cells. My PhD work was based on the analysis of cellular and molecular mechanisms by which the treatment by an anti-CD20 mAb generates a cellar adaptive anti-tumor immunity. I could show that the treatment of mice with anti-CD20 antibody lead to the expansion of Th1 lymphocytes IFN-γ producers, to the apparition of effector memory CD4+ T cells specific for CD20 antigen, and to the blockade of the expansion of Treg cells induced by tumor cells. The key role of an adaptive anti-tumor immune response played by IL-12/IFN- γ and their main cellular sources, dendritic cells and NK cells, in the anti-tumor protection and genesis, has been demonstrated by experiments of cytokine neutralization, provoking an important decrease of splenic Th1 number, by NK depletion and by phenotypic analysis that allowed the identification of DCs activated by the treatment – as it is shown by the increased expression of MHC-II and CD80 and CD86 costimulation molecules, - as an important cellular source of IL-12. Finally, we could show that a variant of IL-2, binding preferentially IL-2By with a lower affinity for the IL-2aBy receptor mainly expressed by Tregs, could induce an increased anti-tumor protection of tumor-bearing animals treated with anti-CD20 mAb. In conclusion, we have demonstrated that a pro-tumor immune contexture affected by a growing tumor can be modified by an anti-tumor antibody leading to an anti-tumor contexture. That such cellular adaptive immune response could be observed in lymphoma patients treated with anti-CD20 still need to be determined.

Les anticorps monoclonaux (AcM) ont été utilisés pour traiter des cancers dès le début des années 1980, en particulier lors du travail pionnier de l’équipe de Ronald Levy dans le traitement des lymphomes. Ces traitements ont pendant longtemps été considérés comme une sérothérapie passive à effet immédiat et à court terme. Cependant, au cours de ces dernières années, le concept d’un effet « vaccinal » des anticorps à usage thérapeutique en oncologie a peu à peu vu le jour du fait de réponses cliniques à long terme observées chez certains patients et de différentes études précliniques. En 2010, notre équipe a démontré que des souris immunocompétentes injectées avec les cellules tumorales EL4-huCD20 et traitées avec un AcM anti-huCD20 générait une réponse immunitaire anti-tumorale à long-terme par le biais de mécanismes dépendants de la région constante de l’anticorps et de lymphocytes T CD4+. Mon travail de thèse a donc porté sur l’analyse des mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels le traitement par un AcM anti-CD20 génère une immunité cellulaire adaptative anti-tumorale. J’ai ainsi pu montrer que le traitement des souris avec l’AcM anti-CD20 conduit à une expansion de lymphocytes Th1 producteurs d’IFN-γ, à l’apparition de lymphocytes T CD4+ effecteurs mémoires spécifiques des cellules tumorales CD20+, et au blocage de l’expansion de lymphocytes Tregs induite par les cellules tumorales. Le rôle central dans la protection anti-tumorale et la genèse d’une réponse adaptative anti-tumorale joué par l’axe IL-12/IFN-γ et leurs principales sources cellulaires, cellules dendritiques (DCs) et cellules NK, a été démontré par des expériences de neutralisation de ces cytokines, qui provoque une importante diminution du nombre de Th1 spléniques, de déplétion des cellules NK, ainsi que par des analyses phénotypiques qui ont permis d’identifier des DCs activées par le traitement - comme le montre l’expression accrue des molécules de classe II du CMH et de co-stimulation CD80 et CD86 - comme une importante source cellulaire de l’IL-12. Enfin, nous avons pu montrer qu’un variant de l’IL-2, liant préférentiellement le récepteur de l’IL-2By et faiblement le récepteur de l’IL-2aBy exprimé majoritairement par les Tregs, permettait l’obtention d’une protection anti-tumorale accrue d’animaux porteurs de tumeurs et traités par l’AcM anti-CD20. En conclusion, nous avons démontré qu’un contexte immunitaire pro-tumoral façonné par la présence d’une tumeur en développement peut être inversé par le traitement par un anticorps anti-tumoral, aboutissant à un contexte anti-tumoral. Qu’une telle réponse immunitaire adaptative cellulaire puisse être observée chez des patients atteints de lymphomes, traités par un anticorps anti-CD20, reste encore à être déterminé. / Monoclonal antibodies have been used to treat cancers since the early 1980s, in particular with the pioneer work of Ronald Levy for the treatment of lymphomas. Those treatments have been considered for a long time as a passive serotherapy with immediate and short term actions. Yet, recently, the idea of a vaccine effect of therapeutic antibodies in oncology have appeared, after preclinical studies and clinic observations suggesting a long term immune response in patients. In 2010, our team demonstrated that immunocompetent mice injected with EL4-huCD20 tumor cells and treated with anti-huCD20 monoclonal antibody generated a long term anti-tumor immune response linked with mechanisms dependent on constant part of antibodies and CD4+ T cells. My PhD work was based on the analysis of cellular and molecular mechanisms by which the treatment by an anti-CD20 mAb generates a cellar adaptive anti-tumor immunity. I could show that the treatment of mice with anti-CD20 antibody lead to the expansion of Th1 lymphocytes IFN-γ producers, to the apparition of effector memory CD4+ T cells specific for CD20 antigen, and to the blockade of the expansion of Treg cells induced by tumor cells. The key role of an adaptive anti-tumor immune response played by IL-12/IFN- γ and their main cellular sources, dendritic cells and NK cells, in the anti-tumor protection and genesis, has been demonstrated by experiments of cytokine neutralization, provoking an important decrease of splenic Th1 number, by NK depletion and by phenotypic analysis that allowed the identification of DCs activated by the treatment – as it is shown by the increased expression of MHC-II and CD80 and CD86 costimulation molecules, - as an important cellular source of IL-12. Finally, we could show that a variant of IL-2, binding preferentially IL-2By with a lower affinity for the IL-2aBy receptor mainly expressed by Tregs, could induce an increased anti-tumor protection of tumor-bearing animals treated with anti-CD20 mAb. In conclusion, we have demonstrated that a pro-tumor immune contexture affected by a growing tumor can be modified by an anti-tumor antibody leading to an anti-tumor contexture. That such cellular adaptive immune response could be observed in lymphoma patients treated with anti-CD20 still need to be determined.

Les anticorps monoclonaux (AcM) ont été utilisés pour traiter des cancers dès le début des années 1980, en particulier lors du travail pionnier de l’équipe de Ronald Levy dans le traitement des lymphomes. Ces traitements ont pendant longtemps été considérés comme une sérothérapie passive à effet immédiat et à court terme. Cependant, au cours de ces dernières années, le concept d’un effet « vaccinal » des anticorps à usage thérapeutique en oncologie a peu à peu vu le jour du fait de réponses cliniques à long terme observées chez certains patients et de différentes études précliniques. En 2010, notre équipe a démontré que des souris immunocompétentes injectées avec les cellules tumorales EL4-huCD20 et traitées avec un AcM anti-huCD20 générait une réponse immunitaire anti-tumorale à long-terme par le biais de mécanismes dépendants de la région constante de l’anticorps et de lymphocytes T CD4+. Mon travail de thèse a donc porté sur l’analyse des mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels le traitement par un AcM anti-CD20 génère une immunité cellulaire adaptative anti-tumorale. J’ai ainsi pu montrer que le traitement des souris avec l’AcM anti-CD20 conduit à une expansion de lymphocytes Th1 producteurs d’IFN-γ, à l’apparition de lymphocytes T CD4+ effecteurs mémoires spécifiques des cellules tumorales CD20+, et au blocage de l’expansion de lymphocytes Tregs induite par les cellules tumorales. Le rôle central dans la protection anti-tumorale et la genèse d’une réponse adaptative anti-tumorale joué par l’axe IL-12/IFN-γ et leurs principales sources cellulaires, cellules dendritiques (DCs) et cellules NK, a été démontré par des expériences de neutralisation de ces cytokines, qui provoque une importante diminution du nombre de Th1 spléniques, de déplétion des cellules NK, ainsi que par des analyses phénotypiques qui ont permis d’identifier des DCs activées par le traitement - comme le montre l’expression accrue des molécules de classe II du CMH et de co-stimulation CD80 et CD86 - comme une importante source cellulaire de l’IL-12. Enfin, nous avons pu montrer qu’un variant de l’IL-2, liant préférentiellement le récepteur de l’IL-2By et faiblement le récepteur de l’IL-2aBy exprimé majoritairement par les Tregs, permettait l’obtention d’une protection anti-tumorale accrue d’animaux porteurs de tumeurs et traités par l’AcM anti-CD20. En conclusion, nous avons démontré qu’un contexte immunitaire pro-tumoral façonné par la présence d’une tumeur en développement peut être inversé par le traitement par un anticorps anti-tumoral, aboutissant à un contexte anti-tumoral. Qu’une telle réponse immunitaire adaptative cellulaire puisse être observée chez des patients atteints de lymphomes, traités par un anticorps anti-CD20, reste encore à être déterminé. / Monoclonal antibodies have been used to treat cancers since the early 1980s, in particular with the pioneer work of Ronald Levy for the treatment of lymphomas. Those treatments have been considered for a long time as a passive serotherapy with immediate and short term actions. Yet, recently, the idea of a vaccine effect of therapeutic antibodies in oncology have appeared, after preclinical studies and clinic observations suggesting a long term immune response in patients. In 2010, our team demonstrated that immunocompetent mice injected with EL4-huCD20 tumor cells and treated with anti-huCD20 monoclonal antibody generated a long term anti-tumor immune response linked with mechanisms dependent on constant part of antibodies and CD4+ T cells. My PhD work was based on the analysis of cellular and molecular mechanisms by which the treatment by an anti-CD20 mAb generates a cellar adaptive anti-tumor immunity. I could show that the treatment of mice with anti-CD20 antibody lead to the expansion of Th1 lymphocytes IFN-γ producers, to the apparition of effector memory CD4+ T cells specific for CD20 antigen, and to the blockade of the expansion of Treg cells induced by tumor cells. The key role of an adaptive anti-tumor immune response played by IL-12/IFN- γ and their main cellular sources, dendritic cells and NK cells, in the anti-tumor protection and genesis, has been demonstrated by experiments of cytokine neutralization, provoking an important decrease of splenic Th1 number, by NK depletion and by phenotypic analysis that allowed the identification of DCs activated by the treatment – as it is shown by the increased expression of MHC-II and CD80 and CD86 costimulation molecules, - as an important cellular source of IL-12. Finally, we could show that a variant of IL-2, binding preferentially IL-2By with a lower affinity for the IL-2aBy receptor mainly expressed by Tregs, could induce an increased anti-tumor protection of tumor-bearing animals treated with anti-CD20 mAb. In conclusion, we have demonstrated that a pro-tumor immune contexture affected by a growing tumor can be modified by an anti-tumor antibody leading to an anti-tumor contexture. That such cellular adaptive immune response could be observed in lymphoma patients treated with anti-CD20 still need to be determined.

Tuberculosis (TB) is an important disease worldwide. Currently, one-third of the world’s population is infected with TB, and it is a leading cause of death among people living with HIV. Immediate but also accurate diagnosis is required for disease control, yet available diagnostics cannot do both simultaneously. Therefore, designing a technique that can diagnose the disease correctly in the shortest possible time is in great demand in order to stop its spread. Diffraction-based sensing is a novel technique for measuring of biomolecular interaction that has potential for disease diagnosis. In this study, diffraction-based sensing successfully demonstrated its usefulness for diagnostics of TB using recombinant TB antigen, or by detection of interferon-γ that is produced from white blood cells when the immune system activates. The feasibility of the technology was also evaluated in terms of providing real time observation, reducing diagnostic duration, and increasing sensitivity of detection.

Tuberculosis (TB) is an important disease worldwide. Currently, one-third of the world’s population is infected with TB, and it is a leading cause of death among people living with HIV. Immediate but also accurate diagnosis is required for disease control, yet available diagnostics cannot do both simultaneously. Therefore, designing a technique that can diagnose the disease correctly in the shortest possible time is in great demand in order to stop its spread. Diffraction-based sensing is a novel technique for measuring of biomolecular interaction that has potential for disease diagnosis. In this study, diffraction-based sensing successfully demonstrated its usefulness for diagnostics of TB using recombinant TB antigen, or by detection of interferon-γ that is produced from white blood cells when the immune system activates. The feasibility of the technology was also evaluated in terms of providing real time observation, reducing diagnostic duration, and increasing sensitivity of detection.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(薬学) / 甲第17862号 / 薬博第793号 / 新制||薬||236(附属図書館) / 30682 / 京都大学大学院薬学研究科医療薬科学専攻 / (主査)教授 髙倉 喜信, 教授 橋田 充, 教授 佐治 英郎 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Pharmaceutical Sciences / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(医学) / 乙第12957号 / 論医博第2099号 / 新制||医||1011(附属図書館) / 32356 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 生田 宏一, 教授 岩井 一宏, 教授 椛島 健治 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Die Nierentransplantation ermöglicht Patienten die Wiederherstellung der Nierenfunktion. Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit an Organen nimmt dabei die Zahl der Transplantationen von einem lebenden Spender stetig zu. Zudem ermöglichen die präzisen und genauen Vorbereitungen und Abläufe bei Lebendnierenspenden eine bessere 5-Jahres-Überlebensrate als bei Kadaverspenden. Die genetische Verschiedenheit zwischen Spender und Empfänger bedingt jedoch eine lebenslange immunsuppressive Therapie, um Abstoßungsreaktionen und damit das Scheitern einer Organtransplantation zu verhindern. An den Universitätskliniken Leipzig und Halle/Saale besteht diese Therapie aus einer Dreifachkombination von Tacrolimus, Mycophenolat-Mofetil und Prednisolon, wobei mögliche Nebenwirkungen wie opportunistische Infektionen, kardiovaskuläre und metabolische Erkrankungen sowie Tumore in Kauf genommen werden. Zudem besteht für den immunsupprimmierten Organismus die ständige Gefahr einer Abstoßungsreaktion. Diese Aspekte führen bei den Empfängern zu einer massiven Einschränkung der Gesundheit und Lebensqualität. Inwieweit die ausgeprägte Immunsuppression notwendig ist, bleibt unklar und muss individuell festgelegt werden. Bisher existiert kein geeignetes Verfahren für ein Immunmonitoring, weshalb in vielen Fällen eine umfangreiche und überdosierte Immunsuppression in Kauf genommen wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein geeignetes Testverfahren, der Elispot-Assay, für die Expression der beiden proinflammatorischen Zytokine IFN-γ und IL-17 erstellt. Dafür wurden die PBMC der Spender und Empfänger aus Vollblut separiert, um sie anschließend sowohl separat als auch in einer Lymphozytenmischreaktion zu untersuchen. Die Darstellung von IL-17 konnte nur aufgrund einer zusätzlichen Stimulation mit OKT3 gelingen, während der IFN-γ-Elispot sowohl im Leerwert als auch unter Stimulation mit IL-2 zu ausreichenden Spotanzahlen führte. Die Spotanzahlen der Spender-PBMC wurden mit Hilfe von γ-Strahlung signifikant reduziert (IFN-γ: p=0,047 | IFN-γ + IL-2: p=0,007 | IL-17: p = 0,001), um in den Lymphozytenmischreaktionen die alleinige Zytokinausschüttung der Empfänger-PBMC messen zu können. Die Spender- PBMC fungierten dabei nur als Antigene. Insgesamt konnten zwischen 2009 und 2012 zwölf von siebzehn Patientenpaaren in die Studie eingeschlossen werden. Die Spotanzahlen der Paare wurden dabei sowohl im IFN-γ- als auch im IL-17-Elispot-Assay zu vier unterschiedlichen Zeitpunkten gemessen (vor Transplantation | 21±3 d postoperativ | 28±3 d postoperativ | 75±15 d postoperativ). In den meisten Fällen zeigte sich vor Transplantation eine erhöhte Spotanzahl im Vergleich zu den drei postoperativen Werten. Zudem stiegen die Spotanzahlen sowohl für IFN-γ als auch für IL-17 nach niedrigen Messergebnissen kurz nach der Transplantation im postoperativen Verlauf wieder an und erreichten in einigen Fällen die Spotanzahl der präoperativen Ausgangswerte. Ein signifikanter Unterschied konnte aufgrund der geringen Fallzahl nicht erreicht werden. Die kurzfristige Reduktion der Spotanzahlen postoperativ ist dabei aller Wahrscheinlichkeit nach auf die hohen Dosen an immunsuppressiven Medikamenten zurückzuführen. Insgesamt zeigten die Verläufe der IFN-γ- und der IL-17- Elispot-Assays ähnliche Verläufe. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass der IL-17-Elispot- Assay in Bezug auf mögliche Abstoßungsreaktionen eine ähnliche Aussagekraft besitzen könnte wie der bereits vielfach untersuchte IFN-γ-Elispot-Assay. Weiterhin wurden die Messergebnisse mit der Serumkreatininmolarität verglichen. Diese zeigte präoperativ höhere Molaritäten als postoperativ, wobei die postoperativen Molaritäten im Verlauf, im Gegensatz zu den Elispot-Messungen, abnahmen, was das Einsetzen der Nierenfunktion widerspiegelt. Unter den zwölf Patientenpaaren gab es keine einzige nachgewiesene akute Abstoßungsreaktion, der Verlauf der Serumkreatininmolaritäten war bei allen zwölf Empfängern vergleichbar. Demzufolge konnten die Werte der Elispot-Assays nicht herangezogen werden, um an ihnen eine Abstoßungsreaktion der transplantierten Nieren erkennen zu können. Das präoperative Abschätzen einer möglichen Abstoßungsreaktion anhand der Elispot-Assays konnte aufgrund fehlender Abstoßungsreaktionen ebenfalls nicht untersucht werden. Zusätzlich wurde bei den Patienten eine HLA-Typisierung vorgenommen, wobei der Bereich von optimalen bis maximal ungünstigen Konstellationen reichten (HLA-Mismatch: 0-0-0 bis 2-2-2). Auch hier konnten die Ergebnisse nicht mit möglichen Abstoßungsreaktionen verglichen werden. In der vorliegenden Arbeit wurden zahlreiche Varianten untersucht, die das Abschätzen einer Immunreaktion nach Nierentransplantation (Immunmonitoring) ermöglichen könnten. Aufgrund fehlender Abstoßungsreaktionen bei den Empfängern konnte das Testverfahren nicht an den klinischen Verläufen validiert werden. Mit dem in dieser Arbeit entwickelten Messverfahren kann jedoch eine neue und größer angelegte Studie erfolgen, die in Zukunft ein Immunmonitoring bei Patienten nach Nierentransplantation ermöglicht. / Introduction Since the first kidney transplantation in the 1950ies, kidney transplantation is still being challenged by graft dysfunction and complete graft failure. Permanent immunsuppressive treatment is mandatory to avoid an unfavourable outcome. The treatment with Prednisolone, Tacrolimus and Mycophenolat-Mofetil may cause toxic side effects resulting in Diabetes mellitus, hypertension, infections and cancer. In the present study we tried to demonstrate that the amount of spots in the Enzyme linked immunospot assay (Elispot-Assay) of IFN-γ and IL-17 correlates with the probability of graft dysfuction and complete graft failure. We also compared the results to clinical parameters. Methods Between the years 2009 and 2012, twelve pairs of related living kidney transplantations were included in this study. From each pair blood samples were taken at four time points (before transplantation, and at 21±3, 28±3 and 75±15 days after kidney transplantation, respectively). After establishing the technique of IFN-γ- and IL-17-Elispot-Assays, we separated the periphale blood mononuclear cells (PBMC) and performed follow up examinations at the four time points mentioned above. The PBMC of each donor and each recipient were examined separatly, and in addition together in a lymphocyte mixed reaction. We stimulated the PBMC of the IFN-γ-Elispot with Interleukin-2 (IL-2) and the PBMC of the IL-17-Elispot with OKT3 to get significant characteristics. PBMC of the donors were irradiated with 30 Gy before mixing them with the PBMC of the recipients. We also took the HLA-matches and serum creatinine molarity to compare important clinical parameters with the results of the Elispot-Assays. Results Sufficient spots were measured using the unstimulated and stimulated IFN-γ-Elispot and the stimulated IL-17-Elispot. Radiation was significant at all three tests (IFN-γ: p=0,047 | IFN-γ + IL-2: p=0,007 | IL-17: p = 0,001). All twelve recipients showed a high number of spots before transplantation in both types of Elispot-Assays and most of them an increasing number of spots after a minimal turning point three weeks after transplantation. Due to the small number of cases, no significant results could be obtained at follow up. Non recipient developed a graft rejection as proven by biopsy or graft failure. The molarity of serum creatinine was permanently reduced whereas it was high before transplantation. Because of the abscence of any rejection episodes, HLA matches could not be compared. Discussion Due to the absence of rejection episodes or graft failure, no prediction for rejection by the IFN-γ- and IL-17-Elispot was possible. The low number of cases of living related kidney transplantation demonstrated the challange of the investigation of living related kidney transplantation. Although we could prove a significant effect of the irradiation of PBMC, there was no significant result in the follow up investigations. A higher number of cases are needed in future investigations. The established method of the IFN-γ- and IL-17-Elispot can be used in a future study with an extended number of cases and a longer follow up of time.