In vitro, la dégradation de la matrice extracellulaire (MEC) par ces cellules invasives est effectuée par les invadopodes, des protrusions cellulaires dotées d’une activité de protéolyse émanant de la membrane ventrale de cellules cultivées sur des substrats bidimensionnels. Le facteur d'échange (GEF) Fgd1, un GEF spécifique de Cdc42, a été montré comme étant un des composants des invadopodes. Nonobstant, la façon dont Fgd1 est régulé n’est pas encore connue. Mon projet visait à élucider la régulation de Fgd1 dans les cellules cancéreuses invasives. J'ai montré que la distribution subcellulaire de la protéine endogène varie au cours des différentes étapes de la formation des invadopodes et que Fgd1 s'accumule aux sites de formation des invadopodes et ce de façon concomittante à l'assemblage du noyau F-actine/cortactine. La partie N –terminale de la molécule est essentielle pour la localisation aux invadopodes. En outre, la Filamine A (FLNa) a été identifiée comme un nouveau partenaire de liaison in vitro et in vivo. J’ai de plus montré que FLNa colocalise avec Fgd1 aux invadopodes et est nécessaire pour leur formation et leur fonction. J'ai émis l'hypothèse que FLNa puisse être impliquée dans la dégradation de Fgd1 par le protéasome, un processus étroitement lié au niveau de l'activation de Cdc42. Dans mon modèle, FLNa agirait comme une protéine d’échafaudage pour connecter Fgd1 et Cdc42 et ainsi réguler localement l'activation de la GTPase, mais également pour stabiliser Fgd1 en empêchant sa dégradation par le protéasome. Dans l'ensemble, mes résultats apportent de nouveaux éléments concernant le rôle de Fgd1 dans la biogénèse des invadopodes / In vitro, degradation of the extracellular matrix (ECM) by invasive tumor cells is carried out by invadopodia, proteolytically active protrusions emanating from the ventral membrane of cells cultured on two dimensional ECM substrates. Identification and characterization of novel molecular components of the invadopodia machinery is now witnessing a relevant interest. The guanine nucleotide exchange factors (GEFs) Fgd1, a specific GEF for Cdc42, has been recently brought into the picture of invadopodia components and regulators. Notwithstanding, how Fgd1 is regulated in invasive cancer cells remains poorly understood. My project aimed to further elucidate Fgd1 regulation in cancer cells. I showed that the cellular distribution of endogenous Fgd1 quantitatively changes along the different stages of invadopodia formation, and that Fgd1 accumulates at invadopodia sites concomitantly with the initial assembling of the actin/cortactin core. The N-terminal proline rich domain (PRD) of Fgd1 is essential for its localization and function at invadopodia. Furthermore, using a yeast two hybrid approach, Filamin A (FLNa) was identified as a novel Fgd1 binding partner and this interaction was validated in vivo. I report that FLNa co-localizes with Fgd1 at invadopodia and is required for their formation and function. I hypothesized that FLNa may be involved in the SCF FWD1/β-TrCP –mediated proteasome degradation of Fgd1, a process that is strictly connected to the Cdc42 activation rate. In my model, FLNa may act as a scaffold to connect Fgd1 and Cdc42 for local activation of the small GTPase, and to increase Fgd1 stability by preventing its proteasomal degradation. Taken together, my findings provide novel insights on the role of Fgd1 in invadopodia biogenesis

Les oncogènes Bcr-Abl (p190bcr-abl et p210bcr-abl) sont issus d'une translocation chromosomique t(9,22) qui fusionne en phase les gènes bcr et c-abl. p210bcr-abl est généralement responsable de la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) alors que p190bcr-abl induit un sous type de Leucémie Aigue Lymphoblastique (LAL). La seule différence structurale entre ces deux protéines est la présence d'un domaine DH/PH au sein de p210bcr-abl activateur spécifique de RhoA. L'expression de Bcr-Abl dans la lignée Ba/F3 est associée au déclenchement d'une migration spontanée, dépourvue de directionnalité, sous la dépendance de la GTPase Rac1.L'activation de RhoA, spécifique des cellules Ba/F3p210, est associée à un phénotype migratoire amœboïde dans une matrice de Matrigel™ en 3D où les cellules Ba/F3p190 dépourvues de RhoA activé, présentent une mobilité de type roulement. Dans ce travail, nous avons mis en évidence que l'activation spécifique de ROCK1 par RhoA détermine deux voies parallèles et mutuellement indispensables pour le mouvement amœboïde : 1) la voie de la Chaine Légère de Myosine (CLM) 2) celle des protéines de la famille ADF (Actin Depolymerizing Factor), et plus particulièrement l'isoforme ADF/destrine. Nous démontrons également l'existence d'invadopodes spécifiquement dans les cellules Ba/F3p190, dont la formation est sous la dépendance de l'absence d'activation de RhoA corrélée à une augmentation de l'activation de Cdc42. Enfin nous démontrons que la voie de signalisation RhoA/ROCK est spécifiquement activée dans les progéniteurs hématopoïétiques CD34+ issus de patients atteints de LMC et ce, indépendamment de l'activité tyrosine kinase de Bcr-Abl. / Bcr-Abl chimeric oncogenes (p190bcr-abl and p210bcr-abl) result from the t(9,22) chromosomal translocation that fuse the bcr and the c-abl genes. p210bcr-abl and p190bcr-abl are associated with Chronic Myelogenous Leukemia (CML) and a subset of Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) respectively. The only difference between these two chimeras is the presence of a specific RhoA-GEF domain in the p210bcr-abl oncogene. Bcr-Abl expression in Ba/F3 lymphoblasts induces spontaneous migration of these cells without apparent directionality. Motility triggering of Bcr-Abl-expressing Ba/F3 depends on the RhoGTPase Rac1.RhoA activity is associated with a typical amoeboid movement of Ba/F3p210 cells embedded in Matrigel™ 3D matrix, whereas the Ba/F3p190 cells, devoid of RhoA activity, display a rolling-type motility. In this work we showed that activation of the RhoA effector ROCK1 triggers two parallel pathways which are both necessary for amoeboid movement: 1) the Myosin Light chain (MLC) pathway 2) ADF family proteins (Actin Depolymerizing Factor) pathway, specifically the ADF/destrin isoform. Besides, we showed that Ba/F3p190 cells could assemble invadopodia-like structures. The formation of these structures is driven by the reduction of RhoA activity associated with the absence of the DH/PH domain in p190bcr-abl and correlates with an increase in Cdc42 activity. We finally demonstrated that the RhoA/ROCK pathway is constitutively activated in CD34+ cells isolated from CML patients while not in their normal counterparts. We also demonstrated that this activation is independent of the tyrosine Kinase activity of Bcr-Abl.

Cette thèse traite du rôle de la protéine FAK (Focal Adhésion Kinase) dans les mécanismes d'invasion cellulaire. / This thesis is about the role of the protein FAK (Focal Adhesion Kinase) in the cellular mechanisms of invasion.

Les cellules cancéreuses mammaires invasives expriment des canaux sodiques NaV1.5 dont l’activité semble être associée au développement métastatique. L’activité de ce canal dans les cellules MDA-MB-231 conduit à une acidification péricellulaire favorable à l’activité des cathepsines à cystéine B et S extracellulaires et à la dégradation de la matrice extracellulaire. Au cours de cette thèse, nous avons montré que l’échangeur NHE1 est le principal régulateur du pH des cellules MDA-MB-231 et que l’activité du canal NaV1.5 augmente l’activité d’efflux de protons par NHE1 vraisemblablement par modulation allostérique. NaV1.5 et NHE1 sont co-localisés dans des radeaux lipidiques et plus particulièrement dans les invadopodes des cellules MDA-MB-231. Les activités de NHE1 et NaV1.5 stimulent l’activité protéolytique des invadopodes. Enfin, l’activité du canal NaV1.5 semble moduler le cytosquelette et la morphologie des cellules cancéreuses MDA-MB-231 pour leur donner un phénotype invasif. En conclusion, NaV1.5 augmente l’activité de NHE1 dans les invadopodes stimulant ainsi l’invasivité des cellules cancéreuses mammaires. / Invasive breast cancer cells express NaV1.5 sodium channels which activity seems to be associated with metastatic progression. The activity of the channel in MDA-MB-231 cells leads to a pericellular acidification favourable for the activity of extracellular cysteine cathepsins B and S and for extracellular matrix degradation. During this thesis, we have shown that NHE1 exchanger is the main pH regulator in MDA-MB-231 cells and that the activity of NaV1.5 channels increases protons efflux activity of NHE1 possibly through allosteric modulation. NaV1.5 and NHE1 are co-localised in lipid rafts and in invadopodia of MDA-MB-231 cells. The activity of NHE1 and NaV1.5 promotes the proteolytic activity of invadopodia. Finally, the activity of NaV1.5 channels seems to modulate cytoskeleton and morphology of MDA-MB-231 cancer cells to promote the acquisition of a proinvasive phenotype. In conclusion NaV1.5 increases NHE1 activity in invadopodia to stimulate breast cancer cells invasiveness.