Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-04-24T11:58:24Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2198129 bytes, checksum: c5d3129c9b7c12c04418684fdb9c9224 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-24T11:58:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2198129 bytes, checksum: c5d3129c9b7c12c04418684fdb9c9224 (MD5) Previous issue date: 1997-07-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Visando caracterizar dois fenótipos de Leonurus sibiricus L. (flores brancas e flores roxas), provenientes do campus da Universidade Federal de Viçosa, em Viçosa-MG, foram estudados os padrões isozimáticos, a anatomia da epiderme e do mesofilo foliares, a produção de óleo essencial e a germinação das sementes. As plantas dos fenótipos estudados apresentaram polimorfismo para o sistema isozimático peroxidase. O estudo da epiderme foliar revelou haver diferenças na freqüência de tricomas glandulares e não-glandulares entre os dois fenótipos. Foram verificadas diferenças quanto à porcentagem total e à velocidade de germinação, que foram superiores para as sementes do fenótipo roxo. As sementes dos dois fenótipos apresentaram dormência primária, caracterizada pela exigência de sementes recém-colhidas por luz e temperatura, alternada de 20-30oC, para germinarem. Não foram observadas diferenças qualitativas ou quantitativas entre o óleo essencial extraído dos dois fenótipos, havendo, porém, distinção no rendimento de óleo essencial de acordo com a época de coleta e o órgão da planta utilizado, notando-se que em plena floração o conteúdo de óleo essencial presente nas folhas e inflorescências aumenta e o dos caules diminui, quando comparado com o início da floração. De modo geral, as folhas+inflorescências produzem mais óleo essencial que os caules. O óleo essencial mostrou ser quimicamente composto de uma mistura complexa de sesqui e diterpenos, de acordo com os tempos de retenção e as massas moleculares dos compostos analisados. / In order to characterize two phenotypes of Leonurus sibiricus L. (white and purple flowers) from Federal University of Viçosa campus, in Viçosa, MG, it was studied isozymatic patterns, anatomy of epidermis and leaf mesophyl, essential oil production and seed germination. The phenotype of the studied plants showed polymorphism for isozymatic system peroxidase. Leaf epidermis observations showed differences in glandular and non-glandular trichome frequency between white and purple phenotypes. It was observed difference related to total percentage and seed germination velocity, that were higher for purple phenotype than for white one. Seeds from the two phenotypes showed primary dormancy, characterized for the necessity of fresh harvested seeds for light and alternate temperature of 20-30oC to promote germination. It was not observed qualitative or quantitative differences of the extracted oil from each phenotype, observing therefore, differences between the production of the essential oil according to harvest period and the plant organ used. At full flowering, essential oil content in the leaves and inflorescences increase, and that of stems decrease when compared at flowering initiation. Generally observing, leaves+inflorescences yielded more oil than stems. Oil composition is chemically made of a complex mixture of sesqui and diterpenes, according to retention time and molecular mass of analyzed components.

Ácido clavulânico (AC) é um potente inibidor de β-lactamases, produzido por Streptomyces clavuligerus, usado clinicamente em combinação com antibióticos β-lactâmicos para tratar infecções bacterianas resistentes. Apesar da produção industrial de AC já ser bem estabelecida muitos aspectos importantes relacionados com sua biossíntese permanecem carentes de estudo. Sabe-se que a via de síntese do AC envolve no mínimo 8 passos enzimáticos sendo os primeiros passos mais abordados. Por exemplo, as enzimas N2-(2-carboxietil) arginina sintase (CEAS), β-lactama sintase (BLS) e proclavaminato amidino hidrolase (PAH) são as responsáveis pela primeira, segunda e quarta reações enzimáticas respectivamente. Estudos mutagênicos recentes em S.clavuligerus relacionaram cópias extras dos genes ceas, bls e pah (ceas1, bls1 e pah1) com essa via porém nenhum ensaio enzimático foi relatado. Embora os passos finais da via ainda não estejam completamente estabelecidos, a ação de algumas enzimas putativas, como a codificada por orf12, mostraram ser essenciais a produção do AC. Assim, com o objetivo de aumentar a informação disponível sobre a biossíntese do AC estudamos quatro de seus membros: CEAS1, BLS1, PAH1 e a proteína putativa codificada pela orf12. Os genes foram isolados a partir do DNA genômico de S. clavuligerus por PCR e clonados em vetores para produção das proteínas recombinantes em E.coli. Os protocolos de expressão foram estabelecidos para CEAS1, PAH1 e ORF12 e as proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade por metal. BLS foi obtida de forma isolúvel. As proteínas solúveis foram caracterizadas por meio de técnicas bioquímicas e estruturais. As análises de CEAS1 e PAH1 foram comparadas com informações já obtidas para as isozimas CEAS2 e PAH2, respectivamente. Assim, as análises de oligomerização das proteínas resultaram em uma mistura de oligômeros (monômero, dímero e tetrâmero) para CEAS1, na forma hexamérica para PAH1 e na forma dimérica para ORF12, estando de acordo com as formas solúvel e cristalográfica de CEAS2 (dímero e tetrâmero) e PAH2 (hexâmero). Espectros de dicroísmo circular mostraram que CEAS1 e PAH1 possuem um enovelamento do tipo α/β sendo estáveis até 35ºC e numa ampla faixa de pH. Os parâmetros termodinâmicos da interação entre CEAS1 e o cofator Mg+2 foram determinados mostrando que é entropicamente dirigida, com uma estequiometria de ligação de 4 : 1, com uma constante de afinidade na ordem de micromolar (KD = 1,76 ± 0.23 µM). Análises realizadas com as técnicas de reação acoplada, de Cromatografia Líquida de Alta Pressão acoplada a Espectrometria de Massas (LC-MS) e de Calorimetria de Titulação Isotérmica mostraram que CEAS1, assim como CEAS2, apresenta atividade sob o substrato gliceraldeído-3-fosfato, porém sem a formação do produto final N2-(2-carboxietil)arginina. Por outro lado, a proteína recombinante PAH1 mostrou ser inativa sobre o substrato análogo, N-α-acetil-L-arginina. Assim, apesar das isozimas manterem um padrão estrutural, podem ter mecanismos de ação distintos. Em relação a ORF12 esta proteína foi classificada com uma β-lactamase com atividade esterase de acordo com nossos estudos realizados com os substratos cefalosporina C e p-nitrofenil acetato. / Clavulanic acid (CA) is a potent inhibitor of β-lactamases, produced by Streptomyces clavuligerus, clinically used in combination with β-lactam antibiotics to treat resistant bacterial infections. Although CA industrial production is well-established, many important aspects related to its biosynthesis remains under study. It is known that CA pathway involves at least 8 enzymatic steps, being the earliest stages more addressed. For instance, N2-(2-carboxyethyl) arginine synthase (CEAS), β-lactam synthase (BLS) and proclavaminate amidinohydrolase (PAH) are responsible for the first, second and fourth enzymatic reaction, respectively. Recent mutagenic studies in S.clavuligerus have related extra copies of ceas, bls and pah genes ((ceas1, bls1 e pah1) to this pathway but none enzymatic assay was further reported. Although later stages the pathway remain unclear, the action of some putative enzymes like the codified by orf12 showed essential to CA production. Thus, aiming to increase the information available about CA biosynthesis we studied four of its members: CEAS1, BLS1, PAH1, and the putative protein codified by orf12. The genes were isolated from S.clavuligerus genomic DNA by PCR and further cloned into expression vectors in order to produce recombinant proteins in E.coli. Protocols of protein expression were established to CEAS1, PAH1 and ORF12 and recombinant proteins were purified by metal affinity chromatography. BLS was obtained as an insoluble form. Soluble proteins were characterized by means of biochemical and structural approaches. Analyses of CEAS1 and PAH1 were compared with information ever conducted to the isozymes CEAS2 and PAH2, respectively. Thus, oligomerization analysis of proteins resulted respectively in a mix of oligomers forms (monomer, dimer, tetramer) to CEAS1, hexameric form to PAH1 and dimeric form to ORF12, according to the soluble and crystallographic form of CEAS2 (dimer and tetramer) and PAH2 (hexamer). Circular Dichroism spectra showed that CEAS1 and PAH1 have an α-β conformation and were stable up to 35ºC over a wide pH range. Thermodynamic parameters of CEAS1 cofactor (Mg+2) binding were determined showing that is entropic driven, with a 4:1 binding stoichiometry, with a micro-molar affinity (KD = 1.76 ± 0.23 µM). Analyses by coupled assay, High Pressure Liquid Chromatography coupled to Mass Spectroscopy (LC-MS) and Isothermal Titration Calorimetry showed that CEAS1, as well as the CEAS2, presents activity at the substrate glyceraldehydes-3-phosphate, however without formation of final product, N2-(2-carboxyethyl)arginine. Meanwhile recombinant PAH1 showed none activity at analogous substrate, N-α-acetil-L-arginine. Thus despite isozymes maintain a structural pattern, they may have distinct action mechanism. Regards to ORF12, this protein was classified as a β-lactamase with an esterase activity according to our studies performed with the substrates cephalosporin C and p-nitrophenyl acetate.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-07-19T14:08:52Z No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 938401 bytes, checksum: 1a334d28da74f16445f0f193d63f6358 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-19T14:08:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 938401 bytes, checksum: 1a334d28da74f16445f0f193d63f6358 (MD5) Previous issue date: 2001-08-09 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A caracterização de 46 indivíduos de Bidens pilosa, coletados em nove altitudes, foi realizada a partir de sete sistemas enzimáticos, utilizando-se a eletroforese em géis de amido a 12%. As enzimas fosfatase ácida, α-esterase, β- esterase, glutamato oxaloacetato transaminase, peroxidase, chiquimato desidrogenase e superóxido dismutase foram analisadas e apresentaram elevado polimorfismo. diferentes As altitudes. variações ocorreram Utilizando-se da entre matriz indivíduos de de mesma dissimilaridade ou obtida de pelo Complemento Aritmético do Índice de Similaridade de Jaccard, agruparam-se os indivíduos pelo Método de Otimização de Tocher e formaram-se dez grupos. Seis genótipos pertencentes a grupos isozimáticos distintos, representando as altitudes 210, 450, 475, 675, 950 e 1.150 m, foram propagados vegetativamente, em cultura de tecidos, obtendo-se clones. Esses foram padronizados, aclimatados e serviram ao estudo da plasticidade fenotípica da influência da altitude em plantas crescidas em vasos em quatro altitudes: 198, 479, 739 e 962 m e os resultados avaliados em quatro colheitas baseadas nos estádios reprodutivos. O início de florescimento variou entre os genótipos mantidos em uma altitude, bem como no mesmo genótipo em cada altitude. A primeira época de colheita de cada genótipo, em cada altitude, foi iniciada 14 dias após a constatação de que 50% de suas plantas estavam floridas. A partir dessa colheita seguiram-se as demais, sendo mantidos representativas intervalos dos regulares estádios de reprodutivos: 14 dias entre florescimento, as colheitas, essas início de frutificação, frutificação plena e senescência. As plantas de cada estádio serviram ao estudo da plasticidade fenotípica. Esse estudo foi feito por meio de caracteres morfométricos, de fitofármacos e anatômicos. Os estudos anatômicos foram feitos apenas no estádio de senescência. Os objetivos foram de identificar os efeitos da altitude sobre estes caracteres e estimar a magnitude e o padrão de resposta dos genótipos às altitudes testadas, bem como obter o coeficiente de coincidência (CCo) entre a resposta à altitude semelhante à de coleta e correlacionar as respostas das características com as variáveis climáticas. Os caracteres morfométricos analisados foram altura da planta, comprimento do caule, número de ramos, número de capítulos, massa seca caulinar, biomassa seca aérea, valor de SPAD foliar, número de folhas por planta, área foliar por planta, área foliar média, massa seca foliar e número de folhas em 1 grama. A análise de fitofármacos das folhas foi feita em extratos etanólicos (80%) submetidos à cromatografia líquida de alta eficiência. Foram identificados e quantificados o ácido clorogênico e o ácido caféico e sua porcentagem na massa seca foliar. Foram obtidas correlações entre as características e os fatores climáticos das altitudes, como temperaturas (máxima e mínima), pluviosidade e capacidade evaporativa do ar. O estudo anatômico foi feito com folhas, analisando a espessura foliar total, espessura do parênquima paliçádico, do parênquima lacunoso, do mesofilo, das epidermes e as relações percentuais entre os tecidos analisados. Obteve-se correlação entre as características anatômicas e climáticas como pressão atmosférica, umidade relativa do ar e luminosidade. Pelos estimadores da plasticidade as altitudes influenciam a resposta morfométrica, de fitofármacos e anatômica e cada genótipo apresentou resposta de acordo com a altitude. Pelo CCo os caracteres morfométricos, de fitofármacos e anatômicos coincidiram em cerca de 53, 45 e 50%, respectivamente, com a resposta à altitude semelhante à de coleta, indicando adaptação intermediária (CCo compreendendo o intervalo de 25 a 75%). A magnitude e o padrão de plasticidade foram específicos em cada genótipo, e nos caracteres morfométricos e de fitofármacos diferiram dentro do mesmo genótipo em função do estádio reprodutivo. Estimou-se que cerca de 83, 76 e 60% da variação morfométrica, de fitofármacos e anatômica, respectivamente, foram devido ao efeito da altitude. Houve variação de fitofármacos entre as altitudes, sendo que na maior altitude (962 m) ocorreu maior acúmulo de ácido clorogênico e na menor altitude (198 m) ocorreu maior acúmulo de ácido caféico. O ácido clorogênico e o ácido caféico tiveram correlação negativa com a temperatura e a evaporação e positiva com a pluviosidade. O aumento da pressão atmosférica e da umidade relativa e a diminuição da luminosidade promovem a diminuição da espessura dos tecidos foliares, sendo o parênquima lacunoso o mais afetado. Conclui-se que a altitude influencia na plasticidade fenotípica e que o estudo da plasticidade em plantas medicinais é importante na seleção de genótipos que possuam adequado crescimento e produção de fitofármacos, servindo na obtenção de plantas medicinais padronizadas, o que auxilia na determinação das doses terapêuticas a serem empregadas medicinalmente. / The characterization of 46 individuals of Bidens pilosa, collected in nine altitudes, was held with seven enzymatic systems, using starch gel electrophoresis 12%. The acid phosphatase, α-esterase, β-esterase, glutamate oxaloacetate transaminase, peroxidase, shikimate dehydrogenase and superoxide dismutase enzymes were analyzed and presented high level polymorphism. The variations occurred among individuals of the same or different altitudes. Using the dissimilarity matrix obtained by Jaccard Arithmetics Complement of Similarity Index, the individuals were put into ten groups organized by Tocher’s Optimization Method. Six genotypes pertaining to distinct isozimatic groups, representing the altitudes 210, 450, 475, 675, 950 and 1.150 m, were vegetatively spread in a tissue culture, obtaining clones. These tissues were standardized, acclimatized and served to the phenotypic plasticity study of the altitude influence in grown plants in vases, in four altitudes: 198, 479, 739 and 962 m, and the evaluated results in four harvests based in reproductive stages. The blooming beginning varied among the genotypes kept in an altitude, just like the same genotype in each altitude. The first harvesting period of each genotype, in each altitude, was iniciated 14 days after observing that 50% of the plants were flourished. After this harvest, the others happened, but the 14 days regular breaks were kept between the harvests and these are representing reproductive stages: blooming, initial frutification, total frutification and senescence. The plants of each stage served to the phenotypic plasticity study. This study was done using morphometric, phytopharmac and anatomic characters. The anatomic studies were done only in the senescence stage. The objectives were to identificate the altitude effects in the characters and to estimate the magnitude and the response pattern of genotypes to the tested altitudes and to obtain the coincidence coefficient (CCo) between the same altitude response and the collecting response and to correlate these responses with the climatic variations responses. The analysed morphometric characters were the plant height, the stem length, the branch number, the flower-head number, the stem dry matter, the aerial dry biomass, the leaf SPAD value, the leaves number in each plant, the total leaves area per plant, the average leaf area, the dry leaf mass and the leaves number in 1 gram. The leaves phytopharmac analysis was done in ethanolic extracts (80%) submitted to high performance liquid chromatography. The chlorogenic acid and caffeic acid were identificated and quantificated and also their percentage in dry leaf mass. Correlations between characteristics and altitudes climate factors were obtained, like temperatures (maximum and minimum), pluviosity and the evaporative air capacity. The anatomic study was done analyzing the total leaf thickness, palisade parenchyma thickness, lacunary parenchyma thickness, mesophyll thickness, epidermis thickness and the percentual relations among the analyzed tissues. The correlation between the anatomic characteristics and climatic ones like atmospheric pressure, relative air humidity and luminosity were obtained. By the plasticity estimator the morphometric, phytopharmac and anatomic responses were influenced by the altitude and each genotype presented a response according to its altitude. According CCo the morphometric, phytopharmac and the anatomic characters coincided around 53, 45 and 50%, respectively, with the altitude response similar to the collect one indicating an intermediate adaptation (CCo interval comprehended between 25 and 75%). The magnitude and morphometric plasticity and pattern phytopharmac were specific characters in variations each genotype differed in and the in same genotype due to the reproductive stage. Estimative numbers of the 83, 76 e 60% of the morphometric, phytopharmac and anatomic variation, respectively, were due to the altitude effects. There was phytopharmac variation among the altitudes and in the higher one (962 m) there was a higher accumulation of the chlorogenic acid and in the lowest altitude (198 m) there was a higher accumulation of the caffeic acid. The chlorogenic acid and caffeic acid had negative correlation with the temperature and the evaporation, but positive correlation with pluviosity. The atmospheric pressure increased, the relative air humidity increased and the luminosity decrease promoted a decrease on the thickness of the leaves tissues with the lacunary parenchyma the most affected. As a conclusion, the altitude influences the phenotypic plasticity, and the plasticity study in medicinal plants is important in selecting genotypes that have a suitable growing and phytopharmac production, serving in the obtension of standardized medicinal plants, and this helps to determine the therapeuthic doses to be used medicinally.

Ácido clavulânico (AC) é um potente inibidor de β-lactamases, produzido por Streptomyces clavuligerus, usado clinicamente em combinação com antibióticos β-lactâmicos para tratar infecções bacterianas resistentes. Apesar da produção industrial de AC já ser bem estabelecida muitos aspectos importantes relacionados com sua biossíntese permanecem carentes de estudo. Sabe-se que a via de síntese do AC envolve no mínimo 8 passos enzimáticos sendo os primeiros passos mais abordados. Por exemplo, as enzimas N2-(2-carboxietil) arginina sintase (CEAS), β-lactama sintase (BLS) e proclavaminato amidino hidrolase (PAH) são as responsáveis pela primeira, segunda e quarta reações enzimáticas respectivamente. Estudos mutagênicos recentes em S.clavuligerus relacionaram cópias extras dos genes ceas, bls e pah (ceas1, bls1 e pah1) com essa via porém nenhum ensaio enzimático foi relatado. Embora os passos finais da via ainda não estejam completamente estabelecidos, a ação de algumas enzimas putativas, como a codificada por orf12, mostraram ser essenciais a produção do AC. Assim, com o objetivo de aumentar a informação disponível sobre a biossíntese do AC estudamos quatro de seus membros: CEAS1, BLS1, PAH1 e a proteína putativa codificada pela orf12. Os genes foram isolados a partir do DNA genômico de S. clavuligerus por PCR e clonados em vetores para produção das proteínas recombinantes em E.coli. Os protocolos de expressão foram estabelecidos para CEAS1, PAH1 e ORF12 e as proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade por metal. BLS foi obtida de forma isolúvel. As proteínas solúveis foram caracterizadas por meio de técnicas bioquímicas e estruturais. As análises de CEAS1 e PAH1 foram comparadas com informações já obtidas para as isozimas CEAS2 e PAH2, respectivamente. Assim, as análises de oligomerização das proteínas resultaram em uma mistura de oligômeros (monômero, dímero e tetrâmero) para CEAS1, na forma hexamérica para PAH1 e na forma dimérica para ORF12, estando de acordo com as formas solúvel e cristalográfica de CEAS2 (dímero e tetrâmero) e PAH2 (hexâmero). Espectros de dicroísmo circular mostraram que CEAS1 e PAH1 possuem um enovelamento do tipo α/β sendo estáveis até 35ºC e numa ampla faixa de pH. Os parâmetros termodinâmicos da interação entre CEAS1 e o cofator Mg+2 foram determinados mostrando que é entropicamente dirigida, com uma estequiometria de ligação de 4 : 1, com uma constante de afinidade na ordem de micromolar (KD = 1,76 ± 0.23 µM). Análises realizadas com as técnicas de reação acoplada, de Cromatografia Líquida de Alta Pressão acoplada a Espectrometria de Massas (LC-MS) e de Calorimetria de Titulação Isotérmica mostraram que CEAS1, assim como CEAS2, apresenta atividade sob o substrato gliceraldeído-3-fosfato, porém sem a formação do produto final N2-(2-carboxietil)arginina. Por outro lado, a proteína recombinante PAH1 mostrou ser inativa sobre o substrato análogo, N-α-acetil-L-arginina. Assim, apesar das isozimas manterem um padrão estrutural, podem ter mecanismos de ação distintos. Em relação a ORF12 esta proteína foi classificada com uma β-lactamase com atividade esterase de acordo com nossos estudos realizados com os substratos cefalosporina C e p-nitrofenil acetato. / Clavulanic acid (CA) is a potent inhibitor of β-lactamases, produced by Streptomyces clavuligerus, clinically used in combination with β-lactam antibiotics to treat resistant bacterial infections. Although CA industrial production is well-established, many important aspects related to its biosynthesis remains under study. It is known that CA pathway involves at least 8 enzymatic steps, being the earliest stages more addressed. For instance, N2-(2-carboxyethyl) arginine synthase (CEAS), β-lactam synthase (BLS) and proclavaminate amidinohydrolase (PAH) are responsible for the first, second and fourth enzymatic reaction, respectively. Recent mutagenic studies in S.clavuligerus have related extra copies of ceas, bls and pah genes ((ceas1, bls1 e pah1) to this pathway but none enzymatic assay was further reported. Although later stages the pathway remain unclear, the action of some putative enzymes like the codified by orf12 showed essential to CA production. Thus, aiming to increase the information available about CA biosynthesis we studied four of its members: CEAS1, BLS1, PAH1, and the putative protein codified by orf12. The genes were isolated from S.clavuligerus genomic DNA by PCR and further cloned into expression vectors in order to produce recombinant proteins in E.coli. Protocols of protein expression were established to CEAS1, PAH1 and ORF12 and recombinant proteins were purified by metal affinity chromatography. BLS was obtained as an insoluble form. Soluble proteins were characterized by means of biochemical and structural approaches. Analyses of CEAS1 and PAH1 were compared with information ever conducted to the isozymes CEAS2 and PAH2, respectively. Thus, oligomerization analysis of proteins resulted respectively in a mix of oligomers forms (monomer, dimer, tetramer) to CEAS1, hexameric form to PAH1 and dimeric form to ORF12, according to the soluble and crystallographic form of CEAS2 (dimer and tetramer) and PAH2 (hexamer). Circular Dichroism spectra showed that CEAS1 and PAH1 have an α-β conformation and were stable up to 35ºC over a wide pH range. Thermodynamic parameters of CEAS1 cofactor (Mg+2) binding were determined showing that is entropic driven, with a 4:1 binding stoichiometry, with a micro-molar affinity (KD = 1.76 ± 0.23 µM). Analyses by coupled assay, High Pressure Liquid Chromatography coupled to Mass Spectroscopy (LC-MS) and Isothermal Titration Calorimetry showed that CEAS1, as well as the CEAS2, presents activity at the substrate glyceraldehydes-3-phosphate, however without formation of final product, N2-(2-carboxyethyl)arginine. Meanwhile recombinant PAH1 showed none activity at analogous substrate, N-α-acetil-L-arginine. Thus despite isozymes maintain a structural pattern, they may have distinct action mechanism. Regards to ORF12, this protein was classified as a β-lactamase with an esterase activity according to our studies performed with the substrates cephalosporin C and p-nitrophenyl acetate.