Die weltweite Zunahme der Prävalenz von Übergewicht und Adipositas und den damit verbundenen medizinischen und sozioökonomischen Herausforderungen stellt eine der wesentlichen Herausforderungen der modernen medizinischen Versorgung dar. Im Mittelpunkt stehen dabei insbesondere die Auswirkungen von Übergewicht und Adipositas auf das kardiovaskuläre System und den damit verbundenen funktionellen und strukturellen Veränderungen der kardiovaskulären Funktion. Als Mediatoren dieser funktionellen und strukturellen Veränderungen stehen dabei zunehmend Adipozytokine im Interesse wissenschaftlicher Arbeiten. Unter Adipozytokinen versteht man in diesem Zusammenhang einen Sammelbegriff für von Adipozyten und anderen Fettgewebszellen sezernierten autokrin-, endokrin- und parakrin wirkenden bioaktiven Molekülen. Insbesondere bei Übergewicht und Adipositas kommt es zu einer charakteristischen Veränderung im Sekretionsmuster dieser Adipozytokine. Die Wirkung einzelner Adipozytokine auf die kardiovaskuläre Funktion wurde in den letzten Jahren intensiv untersucht, über die Wirkung ganzer Adipozytokinprofile ist bisher jedoch nur wenig bekannt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu klären, welchen Einfluss eine 24-stündige Behandlung von neonatalen ventrikulären Kardiomyozyten mit einem physiologischen Adipozytokin-Profil auf Hypertrophie-assoziierte Signalwege und Zellproteine hat.

Die weltweite Zunahme der Prävalenz von Übergewicht und Adipositas und den damit verbundenen medizinischen und sozioökonomischen Herausforderungen stellt eine der wesentlichen Herausforderungen der modernen medizinischen Versorgung dar. Im Mittelpunkt stehen dabei insbesondere die Auswirkungen von Übergewicht und Adipositas auf das kardiovaskuläre System und den damit verbundenen funktionellen und strukturellen Veränderungen der kardiovaskulären Funktion. Als Mediatoren dieser funktionellen und strukturellen Veränderungen stehen dabei zunehmend Adipozytokine im Interesse wissenschaftlicher Arbeiten. Unter Adipozytokinen versteht man in diesem Zusammenhang einen Sammelbegriff für von Adipozyten und anderen Fettgewebszellen sezernierten autokrin-, endokrin- und parakrin wirkenden bioaktiven Molekülen. Insbesondere bei Übergewicht und Adipositas kommt es zu einer charakteristischen Veränderung im Sekretionsmuster dieser Adipozytokine. Die Wirkung einzelner Adipozytokine auf die kardiovaskuläre Funktion wurde in den letzten Jahren intensiv untersucht, über die Wirkung ganzer Adipozytokinprofile ist bisher jedoch nur wenig bekannt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu klären, welchen Einfluss eine 24-stündige Behandlung von neonatalen ventrikulären Kardiomyozyten mit einem physiologischen Adipozytokin-Profil auf Hypertrophie-assoziierte Signalwege und Zellproteine hat.

Die vorgelegte Dissertationsschrift dient der Identifizierung des Mechanismus, über welchen neonatale Kardiomyozyten der Ratte biaxialen zyklischen Stretch wahrnehmen. Angriffspunkt dafür bildeten sowohl Stretch Activated Ion Channels (SAIC) als auch die mit Integrinen assoziierte Focal Adhesion Kinase (FAK). Die Inhibition der SAIC erfolgte mit Gadolinium und eine Blockade der FAK konnte durch den FAK-Inhibitor II erreicht werden. Eigens angelegte Zellkulturen wurden unter definierten Parametern für 24 Stunden unter Einwirkung genannter Stoffe gestretcht und anschließend einer Analyse mittels Immunfluoreszenz und Western Blot unterzogen. Gestretchte Kardiomyozyten richteten sich schräg zur Achse der einwirkenden Kraft aus und wiesen eine Polarisierung von Connexin 43 auf, außerdem zeigte sich dessen gesteigerte Expression. Durch die Blockade der FAK konnte lediglich eine aufgehobene Polarisierung von Connexin 43 bei unveränderter Expression und Ausrichtung der Kardiomyozyten festgestellt werden. Auch die Mikrotubuli veränderten nach Stretch ihre Orientierung bezogen auf die Zellachse. Die zunächst annähernde Parallelität der Fasern zeigte sich nach Inhibition der FAK deutlich aufgelockert. Für die Aktinfilamente konnte dies nicht nachgewiesen werden. Die Integrine dienen demnach der Wahrnehmung von Stretch und vermitteln die Polarisierung von Connexin 43 sowie die Orientierung der Mikrotubuli über die FAK. Für die anderen genannten Prozesse ist die Aktivierung eines FAK-unabhängigen Integrin-Signalweges denkbar. Gadolinium hatte insgesamt keinen Effekt auf beschriebene Veränderungen, sodass ein Einfluss der SAIC auf Stretch-induzierte Veränderungen in Kardiomyozyten ausgeschlossen werden konnte. Gleichzeitig konnte durch die Beobachtung der Polarisierung von Microtubule Organizing Center, Kinesin und Golgi-Apparat die Hypothese der sich durch Stretch orientierenden neonatalen Kardiomyozyte unterstützt werden, welche die Voraussetzung für die Anordnung von Connexin 43 an den Zellpolen darstellen könnte. Sowohl die Selbstorganisation des Myokards im Rahmen der Embryogenese als auch die Pathophysiologie verschiedener kardialer Erkrankungen könnte dadurch womöglich besser verstanden werden.

Die weltweite Zunahme der Prävalenz von Übergewicht und Adipositas und den damit verbundenen medizinischen und sozioökonomischen Herausforderungen stellt eine der wesentlichen Herausforderungen der modernen medizinischen Versorgung dar. Im Mittelpunkt stehen dabei insbesondere die Auswirkungen von Übergewicht und Adipositas auf das kardiovaskuläre System und den damit verbundenen funktionellen und strukturellen Veränderungen der kardiovaskulären Funktion.Als Mediatoren dieser funktionellen und strukturellen Veränderungen stehen dabei zunehmend Adipozytokine im Interesse wissenschaftlicher Arbeiten. Unter Adipozytokinen versteht man in diesem Zusammenhang einen Sammelbegriff für von Adipozyten und anderen Fettgewebszellen sezernierten autokrin-, endokrin- und parakrin wirkenden bioaktiven Molekülen. Insbesondere bei Übergewicht und Adipositas kommt es zu einer charakteristischen Veränderung im Sekretionsmuster dieser Adipozytokine. Die Wirkung einzelner Adipozytokine auf die kardiovaskuläre Funktion wurde in den letzten Jahren intensiv untersucht, über die Wirkung ganzer Adipozytokinprofile ist bisher jedoch nur wenig bekannt.Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu klären, welchen Einfluss eine 24-stündige Behandlung von neonatalen ventrikulären Kardiomyozyten mit einem physiologischen Adipozytokin-Profil auf Hypertrophie-assoziierte Signalwege und Zellproteine hat.

Die weltweite Zunahme der Prävalenz von Übergewicht und Adipositas und den damit verbundenen medizinischen und sozioökonomischen Herausforderungen stellt eine der wesentlichen Herausforderungen der modernen medizinischen Versorgung dar. Im Mittelpunkt stehen dabei insbesondere die Auswirkungen von Übergewicht und Adipositas auf das kardiovaskuläre System und den damit verbundenen funktionellen und strukturellen Veränderungen der kardiovaskulären Funktion. Als Mediatoren dieser funktionellen und strukturellen Veränderungen stehen dabei zunehmend Adipozytokine im Interesse wissenschaftlicher Arbeiten. Unter Adipozytokinen versteht man in diesem Zusammenhang einen Sammelbegriff für von Adipozyten und anderen Fettgewebszellen sezernierten autokrin-, endokrin- und parakrin wirkenden bioaktiven Molekülen. Insbesondere bei Übergewicht und Adipositas kommt es zu einer charakteristischen Veränderung im Sekretionsmuster dieser Adipozytokine. Die Wirkung einzelner Adipozytokine auf die kardiovaskuläre Funktion wurde in den letzten Jahren intensiv untersucht, über die Wirkung ganzer Adipozytokinprofile ist bisher jedoch nur wenig bekannt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu klären, welchen Einfluss eine 24-stündige Behandlung von neonatalen ventrikulären Kardiomyozyten mit einem physiologischen Adipozytokin-Profil auf Hypertrophie-assoziierte Signalwege und Zellproteine hat.

Cardiomyocyte proliferation plays a crucial role in the developing mammal heart, as it is required for normal morphogenesis and in determining the appropriate heart size. Postnatally, the decrease in cell cycle activity is concomitant with the increase of cell cycle variants, such as endoreduplication and acytokinetic mitosis, which contribute to the hypertrophic growth of the heart. Although the adult mammal heart retains the ability to generate new cardiomyocytes, the extent of cardiomyocyte renewal is insufficient to compensate for the large-scale tissue loss associated with ischemic events. Indeed, ischemic events such as myocardial infarction, lead to a permanent loss of ventricular cardiomyocytes, formation of collagen-containing scar, and consequently cardiac remodeling. The development of therapies able to hamper cardiac remodeling by promoting cardiomyocyte turnover is one of the primary goals in the cardiovascular field. In the present study, we generated a human induced pluripotent stem cell (iPSC) line containing the fluorescence ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) under the Troponin T2 (TNNT2) promoter. To gain information about the cell cycle dynamics of human cardiomyocytes, we visualized cell cycle progression in TNNT2-FUCCI human iPSCs-derived cardiomyocytes. Notably, we revealed cardiomyocytes' cell cycle dynamics of cells undergoing proliferation, binucleation, and polyploidization and identified G2 cell cycle arrest in cardiomyocytes undergoing polyploidization. To demonstrate the versatility of the TNNT2-FUCCI human iPSCs line, we developed a live cell screening platform to identify pro-proliferative compounds within an autophagy compound library. We identified Clonidine, an alpha2-adrenergic receptor and imidazoline agonist, as an enhancer of cell cycle activity in TNNT2-FUCCI hiPSC-derived cardiomyocytes. Finally, we investigated the ability of Clonidine to promote cell cycle progression in hiPSC- derived cardiomyocytes and in in vivo and in vitro mouse neonatal cardiomyocytes. We showed that while Clonidine stimulated cardiomyocytes' polyploidization and multinucleation, respectively in in vitro in in vivo mouse cardiomyocytes, the treatment of hiPSC-derived cardiomyocytes with Clonidine enhanced their proliferative capability. In conclusion, we showed that the TNNT2-FUCCI system is a versatile tool for characterizing cardiomyocyte cell cycle dynamics and identifying pro-proliferative molecular candidates with regenerative potential in the mammalian heart.:1. Introduction 1.1 Heart function and composition 1.2 Human cardiac development 1.2.1 Cardiac organogenesis 1.2.2 Metabolic changes in the developing heart 1.3 Cardiomyocytes cell cycle activity 1.3.1 Cardiomyocytes cell cycle regulators and cell cycle arrest 1.3.2 CM multinucleation and polyploidization 1.4. The regenerative capabilities of the mammal heart 1.4.1 Model systems for heart regeneration 1.4.2 Stimulation of cardiomyocyte proliferation as a goal to preserve heart function 1.4.3 Assessment of cardiomyocytes proliferation 1.5 Human-induced pluripotent stem cells to model cardiac development and disease 2. Aim 3. Materials and methods 3.1 TNNT2-FUCCI hiPSC line generation 3.2 hiPSC culture and maintenance 3.3 hiPSC differentiation into CMs 3.4 Imagestream-X Analysis 3.5 TNNT2 expression assessment of hiPSC-derived CMs by immunohistochemistry 3.6 CDK1 immunohistochemistry expression assessment of hiPSC-derived CMs 3.7 Cell area and sarcomere spacing measurement of hiPSC-derived CMs 3.8 Live imaging and timelapse imaging analysis of TNNT2-FUCCI hiPSC 3.9 Murine neonatal CMs cell culture 3.10 Mouse nCM timelapse imaging and analysis 3.11 TNNT2-FUCCI hiPSC-derived CMs culturing and screen conditions 3.11.1 TNNT2-FUCCI screen image acquisition 3.11.2 TNNT2-FUCCI screen automated image analysis 3.11.3 TNNT2-FUCCI screen data analysis 3.12 Primary mouse nCM compound validation and immunohistochemistry 3.13 Mouse nCM immunohistochemistry for AurKB expression assessment 3.14 hiPSC-derived CMs immunohistochemistry for AurKB expression assessment 3.15 Analysis of CM ploidy and binucleation 3.16 in vivo Clonidine treatment of neonatal mice 3.17 Analysis of ploidy and binucleation in in vivo mouse nCMs 3.18 Cell cycle activity assessment in P7 neonatal mouse hearts after Clonidine treatment by immunohistochemistry 4. Results 4.1 TNNT2-FUCCI human iPSC line generation and validation 4.2 TNNT2-FUCCI marks proliferating and non-proliferating CMs 4.3 Live imaging identification of CM cell cycle activity 4.3.1 Cell cycle progression of TNNT2-FUCCI CMs 4.3.2 Cell cycle progression of mouse neonatal cardiomyocytes 4.4 TNNT2-FUCCI live-imaging identifies CM cell cycle activators 4.5 Compound validation in mouse nCMs 4.6 Clonidine elicits cycling activity via alpha1 adrenergic receptor and imidazoline receptor interaction 4.7 Clonidine stimulates hiPSC-derived CM proliferation 4.8 Clonidine stimulates CM polyploidization in mouse nCMs 4.9 Clonidine mediates in vivo CM cell cycle activity in the neonatal mouse 5. Discussion 5.1 TNNT2-FUCCI hiPSC: a new technology to identify cycling CMs 5.2 Study of CM cell cycle activity using TNNT2-FUCCI 5.3 TNNT2-FUCCI hiPSC in combination with a live screening platform revealed enhancer of CMs cell cycle activity. 5.4 Initial validation of pro-proliferative compounds in mouse nCMs reveals Clonidine and Dihydrocapsaicin as enhancers of cell cycle progression 5.5 Clonidine stimulates cell cycle activity in different model systems 5.5.1 Clonidine treatment stimulates proliferation in hiPSC-derived CMs 5.5.2 Clonidine treatment stimulates polyploidization in in vitro- and multinucleation in in vivo mouse nCMs 5.6 Conclusions and future outlooks 6. Appendix 7. Summary 8. Zusammenfassung Acknowledgements References Anlage 1 Anlage 2

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Während der letzten Jahre zeigten einige Studien, dass die Behandlung mit Knochenmark- Stammzellen (KMSZ) eine vielversprechende neue Therapieoption für den geschädigten Herzmuskel darstellen könnte. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob es unter Behandlung mit Stammzellen zu einer zellulären Antwort in angezüchteten Kardiomyozyten (KMZ) kommt. Dafür wurden subkonfluente Kulturen aus Herzmuskelzellen von neonatalen Ratten für drei Tage mit Vybrant CM-DiI-markierten, sternalen humanen Knochenmarkstammzellen co-kultiviert. Im Anschluss wurden immunohistochemische Färbungen sowie eine quantitative Analyse mittels Western Blot für das Protoonkogen c-Myc durchgeführt. Des Weiteren wurde die Dichte der Beta-Adrenozeptoren unter Anwendung einer Histoautoradiographie mittels [125I]- iodocyanopindolol-Bindung analysiert. Die Auswertung der Immunohistochemie und der Western Blots zeigte eine signifikante Erhöhung der Expression von c-Myc in den Kardiomyozyten, welche in naher Umgebung der Stammzellen lagen. Dieser Effekt war direkt abhängig von der Entfernung der KMZ zur SZ. Die Histoautoradiographie zeigte eine signifikant höhere Beta-Rezeptor-Dichte in Kardiomyozyten in direkter Nähe zur Stammzelle. Mit steigender Entfernung von der Stammzelle verringerte sich die Rezeptordichte. Somit konnte gezeigt werden, dass eine kleine Anzahl von Knochenmark-Stammzellen ausreicht, um eine große Zahl von Kardiomyozyten zu beeinflussen, indem eine intrazelluläre Signalkaskade über c-Myc aktiviert und die Anzahl der Beta-Adrenozeptoren erhöht wird.

Die vorgelegte Dissertationsschrift dient der Identifizierung des Mechanismus, über welchen neonatale Kardiomyozyten der Ratte biaxialen zyklischen Stretch wahrnehmen. Angriffspunkt dafür bildeten sowohl Stretch Activated Ion Channels (SAIC) als auch die mit Integrinen assoziierte Focal Adhesion Kinase (FAK). Die Inhibition der SAIC erfolgte mit Gadolinium und eine Blockade der FAK konnte durch den FAK-Inhibitor II erreicht werden. Eigens angelegte Zellkulturen wurden unter definierten Parametern für 24 Stunden unter Einwirkung genannter Stoffe gestretcht und anschließend einer Analyse mittels Immunfluoreszenz und Western Blot unterzogen. Gestretchte Kardiomyozyten richteten sich schräg zur Achse der einwirkenden Kraft aus und wiesen eine Polarisierung von Connexin 43 auf, außerdem zeigte sich dessen gesteigerte Expression. Durch die Blockade der FAK konnte lediglich eine aufgehobene Polarisierung von Connexin 43 bei unveränderter Expression und Ausrichtung der Kardiomyozyten festgestellt werden. Auch die Mikrotubuli veränderten nach Stretch ihre Orientierung bezogen auf die Zellachse. Die zunächst annähernde Parallelität der Fasern zeigte sich nach Inhibition der FAK deutlich aufgelockert. Für die Aktinfilamente konnte dies nicht nachgewiesen werden. Die Integrine dienen demnach der Wahrnehmung von Stretch und vermitteln die Polarisierung von Connexin 43 sowie die Orientierung der Mikrotubuli über die FAK. Für die anderen genannten Prozesse ist die Aktivierung eines FAK-unabhängigen Integrin-Signalweges denkbar. Gadolinium hatte insgesamt keinen Effekt auf beschriebene Veränderungen, sodass ein Einfluss der SAIC auf Stretch-induzierte Veränderungen in Kardiomyozyten ausgeschlossen werden konnte. Gleichzeitig konnte durch die Beobachtung der Polarisierung von Microtubule Organizing Center, Kinesin und Golgi-Apparat die Hypothese der sich durch Stretch orientierenden neonatalen Kardiomyozyte unterstützt werden, welche die Voraussetzung für die Anordnung von Connexin 43 an den Zellpolen darstellen könnte. Sowohl die Selbstorganisation des Myokards im Rahmen der Embryogenese als auch die Pathophysiologie verschiedener kardialer Erkrankungen könnte dadurch womöglich besser verstanden werden.