Thesis (doctoral)--Lund University, 1994.

Thesis (doctoral)--Rijksuniversiteit te Groningen.

Thesis (doctoral)--Lund University, 1994. / Added t.p. with thesis statement inserted.

Thesis (doctoral)--Rijksuniversiteit te Groningen.

Thesis (doctoral)--University of Uppsala. / Includes reprints of 2 previously published papers on which the thesis is partially based.

Thesis (doctoral)--Lund University, 1994. / Added t.p. with thesis statement inserted.

Thesis (Ph. D.)--University of Hong Kong, 2005. / Title proper from title frame. Also available in printed format.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Uppsala universitet, 2008. / Härtill 4 uppsatser.

Η BMP-7 αποτελεί μόριο κλειδί κατά την εμβρυογένεση στον νεφρό, ενώ μετέπειτα, θεωρείται νεφροπροστατευτικός παράγων. Ο νεφρός χαρακτηρίζεται από μία μοναδική πλαστικότητα μεταξύ επιθηλιακών και μεσεγχυματικών κυττάρων. Κατά την ανάπτυξη του Νεφρού, το επιθήλιο του νεφρώνα δημιουργείται μέσω της διαδικασίας της Μεσεγχυματικής προς Επιθηλιακή μετάβαση (ΜΕΤ – Mesenchymal Epithelial Transition). Στην διαδικασία αυτή καθοριστικό ρόλο παίζει η BMP-7. Η αντίστροφη διαδικασία - Επιθηλιακή προς Μεσεγχυματική μετάβαση (ΕΜΤ), συμβάλλει, μετά από νεφρική βλάβη στον ενήλικο νεφρό, στην δημιουργία μεσεγχυματικών κυττάρων – ινοβλαστών με δυνητικά τελικό αποτέλεσμα νεφρική ίνωση που εκδηλώνεται κλινικά ως νεφρική ανεπάρκεια. Εκτός από την ιστική αντίδραση μετά από βλάβη, οι διαδικασίες ΕΜΤ και ΜΕΤ ενέχονται ενεργά στην καρκινογένεση και την διαδικασία της μετάστασης. Τα Stem (βλαστικά) κύτταρα συμμετέχουν στην ομοιόσταση των ιστών, αλλά και στην ιστική επανόρθωση-αποκατάσταση μετά από βλάβη. Κύτταρα με τις μοναδικές ιδιότητες των stem κυττάρων (αυτο-ανανέωση και πολυδυναμία), επίσης εμπλέκονται στις διαδικασίες της καρκινογένεσης και μετάστασης. Οι μοναδικές αυτές ιδιότητες των stem κυττάρων καθορίζονται από μοριακά δίκτυα στα οποία πρωταγωνιστικό ρόλο παίζουν οι μεταγραφικοί παράγοντες Oct4 Sox2 και Nanog, οι πρωτεϊνες της ομάδας Polycomb όπου ανήκει ο EZH2, και microRNAs. Η σηματοδοτική οδός της ΒΜΡ συμμετέχει δραστικά κατά τον επαναπρογραμματισμό ωρίμων σωματικών κυττάρων σε κύτταρα με ιδιότητες stem κυττάρων (iPS). Στον νεφρό, πρόσφατα, έχουν αναγνωρισθεί θέσεις δυνητικών stem κυττάρων.Τελευταίες μελέτες εισηγούνται την συμμετοχή stem κυττάρων κατά την αποκατάσταση της νεφρικής βλάβης και την κυτταρική αναγέννηση στον νεφρό, ενώ τα ακριβή μοριακά γεγονότα, κατά την σημαντικότατη και από κλινικής πλευράς διαδικασία αυτή, απομένουν να διευκρινισθούν. Το θέμα stem κύτταρα και νεφρός αποτελεί ένα ανοικτό προς διερεύνηση, κλινικά πολλά υποσχόμενο πεδίο. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε με μορφολογική (ανοσοϊστοχημική) μέθοδο σε νεφρικό ιστό in situ, η πιθανή συσχέτιση μορίων της σηματοδοτικής οδού ΒΜΡ, με γνωστούς παράγοντες κλειδί σε μοριακά δίκτυα stem κυττάρων. Χρησιμοποιήθηκαν αντισώματα για τον νεφροπροστατευτικό παράγοντα ΒΜΡ7, τον υποδοχέα ΒΜΡR1B και τον ανταγωνιστή της ΒΜΡ7 γκρεμλίνη. Χρησιμοποιήθηκαν επίσης αντισώματα για τους μεταγραφικούς παράγοντες Oct4 και Sox2, για τον παράγοντα της ομάδας Polycomb EZH2, ο οποίος συμμετέχει στην επιγενετική ρύθμιση της μεταγραφής και για ένα γνωστό δείκτη stem κυττάρων την αλδεϋδική δεϋδρογενάση ALDH1, η οποία σχετίζεται με τον καθοριστικό για την τύχη των stem κυττάρων παράγοντα ρετινοϊκό οξύ. Τα ιστικά δείγματα προήλθαν από 49 ασθενείς (30 άνδρες,19 γυναίκες), ηλικίας από 50 έως 79 ετών. Η ανοσοϊστοχημική μέθοδος εφαρμόσθηκε σε εγχειρητικό υλικό νεφρεκτομής λόγω Διαυγοκυτταρικού Καρκινώματος του Νεφρού. Στο υλικό αυτό ανευρίσκεται τόσο η νεοπλασματική μάζα, αλλά και ο παρακείμενος του νεοπλάσματος μη νεοπλασματικός νεφρικός ιστός. Και στα δύο αυτά ιστικά διαμερίσματα του συγκεκριμένου υλικού νεφρεκτομής είναι δυνατόν να ταυτοποιηθούν θέσεις δυνητικών stem κυττάρων (σωματικά stem κύτταρα, καρκινικά stem κύτταρα). Η έκφραση των υπό διερεύνηση παραγόντων μελετήθηκε ανοσοϊστοχημικά τόσο στον νεοπλασματικό ιστό (καρκινικά κύτταρα), όσο και στον παρακείμενο του νεοπλάσματος μη νεοπλασματικό νεφρικό ιστό, όπου εκτιμήθηκε η πιθανή κατανομή στα επιθηλιακά κύτταρα των ουροφόρων σωληναρίων, τα σπειράματα και τον διάμεσο χώρο. Εκτιμήθηκε επίσης η ακριβής εντόπιση των υπό μελέτη παραγόντων στα κύτταρα (πυρήνας, κυτταρόπλασμα, κυτταροπλασματική μεμβράνη). Τα αποτελέσματα από τα δείγματα μη νεοπλασματικού νεφρικού παρεγχύματος και καρκινώματος του ίδιου ασθενούς, συγκρίθηκαν με τη δοκιμασία Wilcoxon. Η παρουσία συσχετίσεων μεταξύ έκφρασης των δεικτών στα ίδια δείγματα ελέχθηκε με τη δοκιμασία συσχετίσεων Spearman Corelation. Για τη σύγκριση πολλαπλών ομάδων, επιστρατεύτηκε η δοκιμασία Kruskal Wallis. Οι κατηγοριοποιημένες μεταβλητές ελέχθησαν με δοκιμασία χ2. Σε όλες τις δοκιμασίες, τιμές με p value < 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν με το πρόγραμμα SPSS 16.0 for windows. Όλοι οι υπό εξέταση δείκτες εκφράζονται, σε άλλοτε άλλο βαθμό, τόσο στον νεοπλασματικό ιστό όσο και στον παρακείμενο του όγκου μη νεοπλασματικό νεφρικό ιστό. Στον παρακείμενο του όγκου, μη νεοπλασματικό νεφρικό ιστό, η θετικότητα αφορά κυρίως στα επιθηλιακά κύτταρα των σωληναρίων. Διαπιστώθηκε ασθενής κυτταροπλασματική έκφραση της ΒΜΡ-7 στα σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα στον παρακείμενο του όγκου νεφρικό ιστό. Το σημαντικό για την σηματοδότηση της BMP-7, μόριο του υποδοχέα BMPR1B, εκφράζεται στην κυτταροπλασματική μεμβράνη, στο κυτταρόπλασμα αλλά και στον πυρήνα των κυττάρων των ουροφόρων σωληναρίων. Η σαφής παρουσία του υποδοχέα BMPRIB στα κύτταρα των εγγύς σωληναρίων, μπορεί να υποστηρίζει την ενδεχόμενη δράση της ΒΜΡ-7 στα εν λόγω κύτταρα. Αναγνωρίσθηκαν επίσης θέσεις ανοσοϊστοχημικής θετικότητας για τον ανταγωνιστή της BMP-7 γκρεμλίνη στο κυτταρόπλασμα κυττάρων του μη νεοπλασματικού νεφρικού ιστού, σε ινωτικές κυρίως περιοχές. Το γεγονός αυτό, ενδεχομένως επιτείνει την ελάττωση της παρουσίας της BMP-7, αφού η η γκρεμλίνη, ως ανταγωνιστής της ΒΜΡ-7, ανταγωνίζεται την έκφρασή της. Αναγνωρίσθηκε θετική πυρηνική έκφραση των ΕΖΗ2 και OCT4 (για τον δείκτη αυτό και ταυτόχρονη κυτταροπλασματική έκφραση) σε μεμονωμένα κύτταρα των σωληναρίων κυρίως και ελάχιστα των σπειραμάτων.Το SOX2, παρότι ανήκει στους μεταγραφικούς παράγοντες, εντοπίστηκε στο κυτταρόπλασμα και όχι στον πυρήνα, ενώ εκφραζόταν πυρηνικά σε νευρικό ιστό που χρησιμοποιήθηκε και ως εσωτερικός μάρτυρας. Ουσιαστικά, προκύπτει έντονη κυτταροπλασματική χρώση στα σωληνάρια του παρακείμενου του όγκου νεφρικού ιστού. Το γεγονός αυτό, πιθανόν υποδηλώνει ότι η θετικότητα για το SOX2 δεν αφορά stem κύτταρα στον νεφρό, αλλά μετέπειτα στάδια κυτταρικής διαφοροποίησης, πιθανόν τελικώς διαφοροποιημένα σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα. Για την ΑLDH1, παρατηρήθηκε έντονη κυτταροπλασματική εντόπιση στα επιθηλιακά σωληναριακά κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αυξημένη έκφραση της δεν περιορίζεται μόνο στα stem κύτταρα, αλλά παρατηρείται και σε πιο διαφοροποιημένα επιθηλιακά κύτταρα του νεφρού. Σε ότι αφορά το νεόπλασμα, διαπιστώθηκε ασθενής κυτταροπλασματική θετικότητα των καρκινικών κυττάρων για την BMP-7, με σαφή ταυτόχρονη όμως θετικότητα για τους επιμέρους παράγοντες της σηματοδοτικής οδού της BMP-7 που μελετήθηκαν (BMPRIB και γκρεμλίνη) και για τους δυνητικούς δείκτες stem κυττάρων. Αναγνωρίσθηκε θετική ανοσοχρώση για τον μεμβρανικό υποδοχέα BMPRIB στο κυτταρόπλασμα και την κυτταροπλασματική μεμβράνη των νεοπλασματικών κυττάρων, ενώ ενδιαφέρον παρουσιάζει το απροσδόκητο εύρημα και της πυρηνικής εντόπισης του BMPRIB στο νεοπλασματικό ιστό, και ιδιαίτερα στην περιφέρεια σε σχέση με κεντρικότερες περιοχές του όγκου. Η γκρεμλίνη, εκφράζεται στο κυτταρόπλασμα των νεοπλασματικών κυττάρων. Ο παράγων EZH2, εκφράζεται τον πυρήνα των καρκινικών κυττάρων, ενώ από πλευράς τοπογραφικής εντόπισης στο νεόπλασμα, διαπιστώθηκε μεγαλύτερη συχνότητα εμφάνισης θετικών πυρήνων στην περιφέρεια σε σχέση με κεντρικότερες περιοχές όπου η θετικότητα ήταν ελάχιστη. Αξιοσημείωτη ήταν η διαπίστωση της θετικότητας για EZH2 σε μεγάλο ποσοστό των καρκινικών κυττάρων σε εμφανείς θέσεις διήθησης. Αναδείχθηκε πυρηνική αλλά και κυτταροπλασματική έκφραση του OCT4 στα καρκινικά κυτταρα, με μεγαλύτερη πυρηνική θετικότητα και πυκνότητα στην περιφέρεια σε σχέση με κεντρικότερες περιοχές του όγκου. Η ανοσοιστοχημική έκφραση του SOX2, ήταν εκτενώς κυτταροπλασματική στον νεοπλασματικό ιστό. Η ALDH1 υπερ-εκφράζεται σταθερά και σε μεγάλο ποσοστό στο κυτταρόπλασμα των νεοπλασματικών κυττάρων στον καρκίνο του νεφρού, σε σχέση με όλους τους άλλους παράγοντες που μελετήθηκαν. Παρόλο που χρησιμοποιείται σε μελέτες ως γενικός δείκτης αναγνώρισης και απομόνωσης stem κυττάρων σε διάφορα όργανα, από τα δεδομένα μας, δεν είναι δυνατόν να ισχυριστούμε ότι υποδηλώνει θέσεις φυσιολογικών stem κυττάρων ή καρκινικών stem κυττάρων, στο διαυγοκυτταρικό καρκίνωμα του νεφρού. Τα αποτελέσματα από τα δείγματα μη νεοπλασματικού νεφρικού παρεγχύματος και καρκινώματος του ίδιου ασθενούς συγκρίθηκαν με τη χρήση της στατιστικής δοκιμασίας Wilcoxon. Η πυρηνική έκφραση του BMPRIB, είναι αυξημένη στο νεόπλασμα συγκριτικά με τα σωληνάρια του παρακείμενου στον όγκο νεφρικού παρεγχύματος και η μεταβολή είναι στατιστικά σημαντική (Wilcoxon p<0,001). Επί πλέον, διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ της τιμής έκφρασης της γκρεμλίνης, με εντονότερη έκφραση στον παρακείμενο του όγκου νεφρικό ιστό σε σχέση με τον όγκο (Wilcoxon p<0,001). Σε ότι αφορά την συσχέτιση των μορίων που μελετήθηκαν με κλινικοπαθολογικές παραμέτρους, η παρούσα μελέτη, δεν απέδειξε την ύπαρξη στατιστικώς σημαντικής διαφοράς στην έκφραση των επί μέρους παραγόντων στον νεοπλασματικό ιστό μεταξύ ανδρών και γυναικών. Η στατιστική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων, όσον αφορά την έκφραση των επί μέρους παραγόντων σε συνάρτηση με την βαθμίδα διαφοροποίησης (Grade) των όγκων, ανέδειξε στατιστικά σημαντική συσχέτιση μόνο για τον παράγοντα ΕΖΗ2 (p<0,007). Συγκεκριμένα, διαπιστώθηκε ότι, όσο αυξάνεται το Grade του νεοπλάσματος τόσο μειώνεται η ανοσοϊστοχημική έκφραση του ΕΖΗ2 στα νεοπλασματικά κύτταρα. Η έκφραση των άλλων δεικτών είτε στον πυρήνα είτε στο κυτταρόπλασμα, δεν μεταβάλλεται στατιστικώς σημαντικά μεταξύ των Grade του όγκου. Η στατιστική ανάλυση κατά Spearman ανέδειξε θετικές συσχετίσεις μεταξύ αρκετών δεικτών της παρούσας μελέτης. Στα κύτταρα του όγκου διαπιστώθηκε θετική συσχέτιση μεταξύ OCT4 και BMPRIΒ (ένταση πυρηνικής έκφρασης p<0,015, r=0,48, ένταση κυτταροπλασματικής έκφρασης p<0,016, r=0,361). Θετική συσχέτιση διαπιστώθηκε επίσης στα κύτταρα του όγκου μεταξύ OCT4 και ΕΖΗ2 (έκταση πυρηνικής έκφρασης στην περιφέρεια του όγκου p<0,037, r=0,382). Επί πλέον, αναγνωρίσθηκε θετική συσχέτιση στα κύτταρα του όγκου μεταξύ SOX2 και γκρεμλίνης (ένταση κυτταροπλασματικής έκφρασης p<0,002, r=0,467, έκταση κυτταροπλασματικής έκφρασης p<0,019, r=0,334), αλλά και μεταξύ SOX2 και BMPRIΒ (ένταση κυτταροπλασματικής έκφρασης p<0,05, r=0,293). Όσον αφορά τα επιθηλιακά κύτταρα των ουροφόρων σωληναρίων στον παρακείμενο του όγκου μη νεοπλασματικό νεφρικό ιστό, διαπιστώθηκε θετική συσχέτιση μεταξύ SOX2 και BMPRIΒ (κυτταροπλασματική έκφραση p<0,035, r = 0,338). Σε ό,τι αφορά τα σπειράματα στον παρακείμενο του νεοπλάσματος μη νεοπλασματικό νεφρικό ιστό δεν προέκυψε στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ των παραγόντων που μελετήθηκαν. Οι ανωτέρω στατιστικές συσχετίσεις εκτελέστηκαν, με σκοπό την διερεύνηση ενδεχόμενης “συνομιλίας” μεταξύ των επιλεγμένων μορίων της εργασίας. Τα συμπεράσματα που προκύπτουν, θα πρέπει να αξιολογηθούν με την επιφύλαξη ότι, η ανοσοϊστοχημική μέθοδος προσφέρει μόνο την πληροφορία της συνύπαρξης των παραγόντων στα καρκινικά και στα παρακείμενα του νεοπλάσματος, νεφρικά κύτταρα, και δεν διερευνά ουσιαστικά την λειτουργική τους αλληλεπίδραση. Από την μελέτη μας προκύπτει το συμπέρασμα πιθανής “διασυνομιλίας” του μορίου της σηματοδοτικής οδού BMPRΙΒ με τους δείκτες stem κυττάρων OCT4 και SOX2. Οι συσχετίσεις αυτές, σε συνδυασμό με την ενδιαφέρουσα συν-έκφραση των BMPRIB, OCT4 και EZH2, στην περιφέρεια κυρίως του νεοπλάσματος, καθιστά, ίσως, τους δείκτες αυτούς, λειτουργικούς παράγοντες σε κοινά δίκτυα μεταγωγής σήματος. Ωστόσο, η ανοσοϊστοχημική συσχέτιση του BMPRIB με τους προαναφερθέντες δείκτες stem κυττάρων, εμπεριέχει τον κίνδυνο υπεραπλούστευσης κατά την εξαγωγή συμπερασμάτων λειτουργικής συσχέτισης, εξαιτίας του πυκνού δικτύου σηματοδότησης όπου συμμετέχουν οι παράγοντες αυτοί. Τα αποτελέσματα από τις στατιστικές δοκιμασίες που προέκυψαν, παρά τον κίνδυνο υπερεκτίμησης των συσχετίσεων των υπό διερεύνηση μοριακών δεικτών, που εμπεριέχουν, εισηγούνται πιθανώς την αλληλεπίδραση και διαπλοκή των μοριακών αυτών δικτύων στις φυσιολογικές και παθολογικές διεργασίες του νεφρού. Στον παρακείμενο του όγκου μη νεοπλασματικό νεφρικό ιστό, όπως αναφέρθηκε, διαπιστώθηκε ανοσοϊστοχημική πυρηνική θετικότητα σε μεμονωμένα κύτταρα κυρίως των ουροφόρων σωληναρίων για τους δείκτες Oct4 EZH2 και ΒΜΡRIB. Τα συγκεκριμένα ευρήματα πιθανόν εισηγούνται το ενδεχόμενο της παρουσίας δυνητικών stem κυττάρων στις θέσεις αυτές. Όσον αφορά τον νεοπλασματικό ιστό, διαπιστώθηκε ανοσοϊστοχημική πυρηνική θετικότητα στα καρκινικά κύτταρα για τους δείκτες OCT4 EZH2 και ΒΜΡRIB, με ιδιαίτερη κατανομή στην περιφέρεια του νεοπλάσματος σε σχέση με κεντρικότερες περιοχές. Αξιοσημείωτη ήταν η διαπίστωση της θετικότητας για EZH2 σε μεγάλο ποσοστό των καρκινικών κυττάρων σε εμφανείς θέσεις διήθησης. Το απροσδόκητο εύρημα της εντόπισης στον πυρήνα, του μεμβρανικού υποδοχέα ΒΜΡRIB, συμβαδίζει με ανάλογη διαπίστωση για γνωστή κυτταροπλασματική πρωτεϊνη (β-κατενίνη) σε κύτταρα με εντόπιση στην διηθητική παρυφή του καρκίνου στο παχύ έντερο. Τα κύτταρα αυτά έχουν χαρακτηρισθεί ως καρκινικά stem κύτταρα τα οποία υφίστανται την διαδικασία της ΕΜΤ. Στην ΕΜΤ, έχει αποδοθεί επίσης η δυνατότητα να προσδίδει σε κύτταρα ιδιότητες stem κυττάρων. Στην παρούσα μελέτη η εφαρμογή της στατιστικής δοκιμασίας συσχετίσεων Spearman, ισχυροποίησε τα μορφολογικά ευρήματα για τους OCT4 EZH2 και ΒΜΡRIB, αναδεικνύοντας θετική, στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ Oct4 και ΒΜΡRIB (p<0,015) καθώς και OCT4 και EZH2 (p<0,037). Όλα τα προαναφερθέντα υποστηρίζουν το ενδεχόμενο της παρουσίας δυνητικών καρκινικών stem κυττάρων στο Διαυγοκυτταρικό καρκίνωμα του Νεφρού. / BMP-7 is a key molecule during kidney embryogenesis, and later is considered a renoprotective factor. The kidney is characterized by a unique plasticity between epithelial and mesenchymal cells. In developing kidney, the epithelium of the nephron is created through the process of Epithelial to Mesenchymal Transition (MET - Mesenchymal Epithelial Transition). In this process BMP-7 plays a pivotal role. The reverse process - Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT) contributes the creation of mesenchymal cells - fibroblasts with the potential outcome of renal fibrosis that manifests clinically as renal failure. Besides the tissue reaction after injury, EMT and MET are actively involved in the process of carcinogenesis and metastasis. Stem cells are involved in tissue homeostasis and regeneration after injury as well. Cells with the unique properties of stem cells (self-renew and plurypotency), are also involved in carcinogenesis and metastasis. These unique stem cell properties are regulated by molecular networks in which the transcription factors OCT4 SOX2, Nanog, Polycomb group proteins (EZH2), and microRNAs, pose a critical role. The BMP signaling pathway participates actively in reprogramming somatic cells into mature cells with stem cells properties (iPS). Former publications have recognized potential stem cells in the kidney. Recent studies suggest the involvement of stem cells during regeneration after renal injury, while the exact molecular events within this process remain to be clarified. The addressed issue of renal stem cells is an open and promising research field. In this study, we investigated with a morphological method (immunohistochemistry) in renal tissue in situ, the possible correlation between the molecules of BMP signaling pathway with known key factors in stem cell molecular networks. We used antibodies against the renoprotective factor BMP-7, its receptor BMRRIB and its antagonist gremlin. Furthermore we used antibodies against the transcription factors OCT4 and SOX2, the member of the Polycomb group proteins EZH2, which is involved in the epigenetic regulation of transcription and a known stem cells marker, aldehyd dehydrogenase ALDH1, which is associated with retinoic acid, which plays a key role in determining stem cell fate. We obtained tissue samples from 49 patients (30 men, 19 women) aged 50 to 79 years. The immunohistochemical technique was applied to the surgical material of renal clear cell carcinoma. The biopsy samples contained both neoplastic and and adjacent to the tumor non-neoplastic the renal tissue. In both compartments it is possible to identify locations of potential stem cells (somatic stem cells, cancer stem cells). The expression of the investigated factors was studied in both tumor tissue (tumor cells) and in the counterpart non-neoplastic renal tissue, we assessed the potential distribution in renal epithelial tubular cells, the glomeruli and the interstitium. We also assessed the precise location of the studied factors in the cells (nucleus, cytoplasm, cytoplasmic membrane). The results of the samples from non-malignant renal parenchyma and carcinoma of the same patient were compared with Wilcoxon statistical analysis test. The correlations between the expression of different markers, in the same samples was tested by Spearman Corelation test. For the multiple group comparison, we used the Kruskal Wallis statistical test. The categorized variables were audited by chi square. In all tests, p value <0,05 was considered statistically significant. The statistical analysis was performed with the SPSS program 16.0 for windows. All present indicators are expressed in varying degrees, both in tumor tissue and in the adjacent non-neoplastic kidney tissue. In the counterpart non-neoplastic kidney ttissue immunohistochemical nuclear positivity was detected mainly in single tubular cells. BMP-7 expression was week in tubular epithelial cells of the counterpart kidney tissue. Its receptor, BMPRIB was expressed in the cytoplasmic membrane in the cytoplasm and in the nucleus of the tubular epithelial cells. The clear presence of BMPRIB in the proximal tubular cells, may support a possible effect of BMP-7 in these cells. Furthermore, gremlin immunohistochemical positivity was also expressed in the cytoplasm of non-malignant kidney tissue, particularly in areas of fibrosis. In fact, gremlin may exacerbate the decrease in the presence of BMP-7, since it antagonizes BMP-7 expression. Acknowledged positive nuclear expression of EZH2 and OCT4 (cytoplasmic co-expression) was noted in single tubular cells. SOX2, although it is considered a transcription factor, it was found in the cytoplasm and not in the nucleus. Its nuclear expression in the nervous tissue was used as an internal control. Basically, it showed strong cytoplasmic staining in the renal tubuli of the counterpart renal tissue. This probably indicates that SOX2 is not a stem cell marker, but more likely it indicates later stages of cell differentiation in the kidney, maybe final diferentated tubular epithelial cells. ALDH1, showed strong cytoplasmic localization in the tubular epithelial cells, suggesting that its expression is not restricted to stem cells but also occurs in more differentiated tubular epithelial cells. Regarding the neoplastic tissue, there was weak cytoplasmic positivity for BMP-7, but with a clear concomitant positivity for the individual molecules of the signaling pathway of BMP-7 that were studied (BMPRIB and gremlin) and for the potential stem cell markers. Positive staining was recognized for the BMPRIB membrane receptor in the cytoplasm and cytoplasmic membrane of tumor cells, while an interesting and unexpected finding was the nuclear localization of BMPRIB in the tumor tissue, especially in the peripheric region compared to more central areas of the tumor. Gremlin was expressed in the cytoplasm of cancer cells. EZH2 expression was noted in the nuclei of cancer cells, while in terms of topographic localization in the tumor, it showed a higher incidence of positive nuclei in the periphery region compared to more central areas where the positivity was minimal. Notable was the EZH2 positivity in a large percentage of tumor cells in apparent invasive front positions. Both nuclear and cytoplasmic expression for OCT4 was found in neoplastic and non neoplastic tissue. The tumor cells expressed greater density of nuclear positivity in the periphery region compared to more central areas of the tumor. The immunohistochemical expression of SOX2, was extensively cytoplasmic in the tumor tissue. ALDH1 was widely over-expressed in the cytoplasm of the tumor cells in ccRCC, compared with the other studied factors. Although ALDH1 is been used as a general marker for the identification and isolation of stem cells in various organs, it can be argued that it indicates adult or cancer stem cells in clear cell carcinoma of the kidney. The results from non-malignant renal parenchyma and carcinoma of the same patient were compared using the statistical test Wilcoxon. Nuclear expression of BMPRIB, is increased in the tumor compared with the tubular cells of the adjacent renal parenchyma and the increasion is statistically significant (Wilcoxon p <0,001). Moreover, we found a statistically significant increase between the expression of gremlin in the counterpart kidney tissue in relation to the tumor tissue. (Wilcoxon p <0,001). Regarding the correlation of the studied factors with clinicopathological parameters, this study has not demonstrated a statistically significant difference in the expression of individual factors in the tumor tissue between men and women. The statistical evaluation of the expression of the individual factors in relation to the different tumor grade (Grade) showed a statistically significant correlation only for the factor EZH2 (p <0,007). It was found that with increasing tumor Grade, the immunohistochemical expression of EZH2 in tumor cells was weaker. The statistical Spearman correlation analysis, shower positive correlations between several markers of this study. In the tumor cells, a positive correlation was revealed between OCT4 and BMPRIB (intensity of nuclear expression p <0,015, r = 0,48, intensity of cytoplasmic expression p <0,016, r = 0,361). Positive correlation was also found in tumor cells between OCT4 and EZH2 (nuclear expression in the periphery of the tumor p <0,037, r = 0,382). Moreover, a positive correlation concerning the tumor cells, was found between gremlin and SOX2 (intensity cytoplasmic expression p <0,002, r = 0,467, and cytoplasmic expression p <0,019, r = 0,334), and between SOX2 and BMPRIB (intensity of cytoplasmic expression p < 0,05, r = 0,293). Regarding the renal tubular epithelial cells in the counterpart kidney tissue, a positive correlation between SOX2 and BMPRIB (cytoplasmic expression of p <0,035, r = 0,338) was found. In terms of the glomeruli in the counterpart kidney tissue, it showed no statistically significant correlation between the studied factors. These statistical correlations were performed in order to investigate any possible "cross-talk" between the selected markers in the present study. The conclusions should be evaluated, having in mind that the immunohistochemical method provides only the information of the coexistence of the studied factors in cancer and in the counterpart renal tissue, and not of the possible functional interactions that may take place. From the present study, we concluded probable "cross-talks" between factors of the BMP-7 signaling pathway, with stem cell markers OCT4 and SOX2. These correlations, combined with the interesting co-expression of BMPRIB, OCT4 and EZH2, mainly at the periphery of the tumor, can probably lead to the conclusion that these markers may act in common signal transduction networks. However, the correlation of the immunohistochemical expression of BMPRIB and the above potential stem cell markers, involves the risk of oversimplification, due to the dense network signaling that these factors are involved. The statistical correlation test results, despite the risk of overestimation, probably suggest an interaction and interdependence of these molecular networks in physiological and pathological processes in the kidney. In the counterpart renal tissue, as mentioned above, the immunohistochemical nuclear positivity for OCT4, EZH2 and BMPRIB, that was detected mainly in single tubular cells may suggest a possible presence of potential stem cells in these positions. Regarding the tumor tissue, we detected immunohistochemical nuclear positivity for OCT4, EZH2 and BMRRIB with a noted distribution in the tumor periphery region compared to more central areas. Interestig was the finding of EZH2 positivity in a large percentage of tumor cells in invasive front positions. The unexpected finding of nuclear localisation of the membrane receptor BMRRIB, is consistent with a similar finding for a well known cytoplasmic protein (beta-catenin) that was found in the nucleus of cells in the invasive edge in colon cancer. These cells have been identified as cancer stem cells, which have undergone EMT process. In the present study, the application of the statistical correlation Spearman test, strengthened the morphological findings on OCT4, EZH2 and BMRRIB, revealing positive correlations between OCT4 and BMRRIB (p <0,015) and OCT4 and EZH2 (p <0,037). All these support the possibility of the presence of potential cancer stem cells in renal clear cell carcinoma.

Chronic Kidney Disease (CKD) is common and is associated with increased risk of progression to end stage renal disease, cardiovascular disease and death. CKD is a heterogeneous condition and accurately predicting an individual’s risk for adverse outcomes remains a challenge. Over the past decade there has been a focus on the identification of novel biomarkers that may help improve risk stratification and the prediction of clinical endpoints in this population. The overall aim of this research project was to investigate a series of novel biomarkers in patients from the Chronic Renal Insufficiency Standards Implementation Study (CRISIS), a prospective observational study of outcome in all cause non-dialysis dependent CKD 3-5. The biomarkers selected for this project were Anti-Apolipoprotein A-1 (Anti-apoA-1 IgG), fetuin-A, fibroblast growth factor-23 (FGF23), high sensitivity cardiac troponin T (HS-cTnT), kidney injury molecule-1 (KIM-1), N-terminal pro-brain natriuretic peptide (NT-proBNP), neutrophil gelatinase associated lipocalin (NGAL) and osteoprotegerin (OPG). These biomarkers were chosen to address the three clinical endpoints of progression, cardiovascular disease and death with biomarkers considered both individually and as groups of related markers. The first aim of this project was to examine associations between the novel biomarkers and the clinical characteristics of the CRISIS population. The second aim was to investigate the associations between novel biomarkers and the study endpoints. In the case of FGF23 longitudinal measurements were analysed and in all other cases associations between baseline levels of the markers and clinical outcomes were considered. The third aim was to consider whether the biomarkers investigated in this project actually improve parameters of risk stratification and model discrimination, thereby demonstrating a potential to improve the prediction of outcome events in the CKD population. Many of the biomarkers were independently associated with one or all of the clinical outcomes considered. Despite these associations, it was more difficult to demonstrate clear improvement in risk classification or the prediction of clinical endpoints. Baseline models of standard biochemical and clinical parameters performed very well so even biomarkers that were strongly associated with clinical outcomes resulted in only small incremental improvements in the prediction of outcome events. It is now important to focus on defining how biomarkers may fit into clinical decision pathways.