La Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1) ou maladie de Steinert est une des atteintes neuromusculaires parmi les plus fréquentes chez l’adulte et pour laquelle il n’existe de solution thérapeutique autre que symptomatique à l’heure actuelle. La mutation, une expansion instable d’un triplet CTG dans la région 3’ transcrite non traduite du gène codant la DMPK, conduit notamment à la dérégulation de protéines de liaison à l’ARN, ce qui engendre différents défauts d’épissage alternatif qui sont associés aux atteintes multisystémiques observées dans la maladie. La disponibilité d’un diagnostic préimplantatoire a permis la dérivation de lignées de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) à partir d’embryons portant la mutation causale. Ces lignées, et désormais les cellules souches induites à la pluripotence issues de patients, constituent des sources prometteuses de modèles pour l’étude des maladies génétiques. Outre la possibilité d’étudier la pathologie dans un contexte naturel, ces cellules offrent l’accès à tous les phénotypes cellulaires sans limite quantitative. Ceci en fait un outil de choix pour les approches de criblage à grande échelle, et notamment celles de génomique fonctionnelle, qui visent à explorer de manière systématique l’implication de gènes dans une maladie. L’objectif de mes travaux de doctorat a été de démontrer l’intérêt de tels cribles en développant une approche par perte de fonction, via le mécanisme d’interférence par l’ARN (ARNi), pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour la DM1 en utilisant une lignée de CSEh exprimant la mutation causale. Après avoir identifié une population de progéniteurs mésenchymateux issus de cette lignée qui exprime deux biomarqueurs de la DM1 - les foci et le défaut d’épissage de l’INSR - et qui est adaptée à une approche de crible par transfection, mes travaux ont consisté à développer, miniaturiser puis automatiser les étapes de transfection et de détection des phénotypes pathologiques. Le crible de collections de siRNAs a permis d’identifier plusieurs gènes candidats, parmi lesquels ELAVL1 qui apparaît comme une nouvelle cible thérapeutique pour la DM1. En effet, l’extinction de son expression permet d’améliorer plusieurs défauts d’épissages et de normaliser l’anomalie de capture du glucose. Nous avons montré que l’enrichissement de sa fraction nucléaire par l’utilisation d’activateurs de l’AMPK, composés classiquement indiqués pour la prise en charge du diabète de type 2, permettait de reproduire cet effet restaurateur. Mes travaux ont ainsi montré l’intérêt d’associer, et particulièrement dans le cas des maladies rares, les approches de crible par ARNi aux cellules souches pluripotentes modèles de maladies pour l’identification de nouvelles cibles moléculaires afin d’accélérer le développement de thérapeutiques. / Myotonic Dystrophy type 1 (DM1), or Steinert disease, is one of the most common neuromuscular disorders in adults for whom no therapeutic solution other than symptomatic is available at present. The mutation, which consists in an unstable CTG expansion located in the 3' transcribed but untranslated region of the DMPK gene, leads in particular to the deregulation of several RNA-binding proteins. This engenders various splicing defects that are associated to the multisystemic symptoms. The availability of a preimplantation genetic diagnosis enabled the derivation of human embryonic stem cell lines (hESC) from embryos carrying the causative mutation. These cell lines, and now the induced pluripotent stem cells established from patients, constitute promising models for genetic disease’s exploration. Besides the possibility to investigate the pathology in a natural context, these cells open the way to every cell phenotypes without any quantitative restriction and thus appear as a valuable tool for large scale screening, and particularly for functional genomics approaches that systematically explore the involvement of genes in a given phenotype. The aim of my work was to explore the potential of such an approach by developing a loss of function RNA interference screen in order to identify new therapeutic targets by using a hESC line expressing the DM1 mutation. To that purpose we first identified a disease relevant cell population, i.e. hESC derived-mesenchymal progenitors expressing two DM1 biomarkers – foci and INSR splicing defects, suitable for large scale siRNA transfection. Then we developed, miniaturized and automated the transfection’s and phenotype detection’s steps. Finally, once all the conditions determined, we conducted a screening of a siRNA library targeting RNA-binding proteins that led to the identification of several candidate genes, including ELAVL1 which appears as a new DM1 therapeutic target. Indeed, its knockdown resulted in the improvement of several pathological splicing defects and normalized the glucose uptake impairment. We also showed that the enrichment of its nuclear fraction through the use of AMPK activators, some of which being widely prescribed anti-diabetic drug, was able to mimic this corrective effect. My work thus underlies the interest of coupling RNAi screening to pathological pluripotent stem cells for the identification of new therapeutic targets with the view to accelerate drug discovery, and particularly in the case of rare diseases.

Nous avons utilisé une approche ethnobotanique pour identifier des espèces de plantes utilisées par les Cris afin de traiter les symptômes du diabète de type 2. Larix laricina du Roi (L. laricina) a récemment été identifiée comme une des meilleures plantes qui a stimulé le transport de glucose dans les cellules C2C12 et fortement potentialisé la différenciation des 3T3-L1 en indiquant une sensibilité potentiellement accrue à l’insuline. Ensuite, ces études de criblage ont été effectuées sur des extraits éthanolique (EE) en utilisant une série de bioessais in vitro. Cependant, les préparations traditionnelles des plantes sont souvent faites avec l’eau chaude. Le but de cette thèse de doctorat était d’isoler les principes actifs de L. laricina par un fractionnement guidé par l’adipogenèse; d’évaluer et de comparer l’activité et les mécanismes antidiabétiques des EE et des extraits aqueux (HWE) de ces 17 plantes. Pour le fractionnement de L. laricina, on a isolé plusieurs composés connus et identifié un nouveau composé actif cycloartane triterpene, qui a amélioré fortement l’adipogenèse et a été responsable en partie de l’activité adipogénique (potentiellement similaire à l’effet sensibilisateur à l’insuline des glitazone) de l’extrait éthanolique issu de l’écorce de L. laricina. Pour le métabolisme lipidique, nos résultats ont confirmé que 10 parmi les 17 EE ont augmenté la différenciation des adipocytes alors que 2 extraits seulement l’ont inhibée. Les HWE ont montré une faible activité adipogénique ou antiadipogénique. Les EE de R. groenlandicum et K. angustifolia ont le PPAR γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ), le SREBP-1 (sterol regulatory element binding protein-1) et le C/EBP (CCAAT-enhancer binding proteins) α, alors que ceux de P. balsamifera et A. incana les ont inhibés. L’effet inhibiteur de P. balsamifera a également été prouvé d’avoir impliqué l’activation de la protéine kinase activée par l’AMP (AMPK). Les EE et HWE de R. groenlandicum ont stimulé les mêmes facteurs de transcription alors que les extraits aqueux d’autres plantes sélectionnées ont perdu ces effets en comparaison avec leurs extraits éthanoliques respectifs. L’analyse phytochimique a également identifié le groupe des espèces actives et inactives, notamment lorsque les espèces ont été séparées par famille de plante. Finalement concernant l’homéostasie de glucose, nos résultats ont confirmé que plusieurs EE ont stimulé le transport de glucose musculaire et inhibé l’activité de la glucose-6-phosphatase (G6Pase) hépatique. Certains des HWE ont partiellement ou complètement perdu ces activités antidiabétiques par rapport aux EE, tandis qu’une seule plante (R.groenlandicum) a juste conservé un potentiel similaire entre les EE et HWE dans les deux essais. Dans les cellules musculaires, les EE de R.groenlandicum, A. incana et S. purpurea ont stimulé le transport de glucose en activant la voie de signalisation de l’AMPK et en augmentant le niveau d’expression des GLUT4. En comparaison avec les EE, les HWE de R.groenlandicum ont montré des activités similaires; les HWE de A. incana ont complètement perdu leur effet sur tous les paramètres étudiés; les HWE de S. purpurea ont activé la voie de l’insuline au lieu de celle de l’AMPK pour augmenter le transport de glucose. Dans les cellules H4IIE, les EE et HWE des 5 plantes ont activé la voie de l’AMPK, et en plus les EE et HWE de 2 plantes ont activé la voie de l’insuline. La quercétine-3-O-galactoside et la quercétine 3-O-α-L-arabinopyranoside ont été identifiées comme des composés ayant un fort potentiel antidiabétique et donc responsables de l'activité biologique des plantes HWE actifs avec le transport du glucose. En conclusion, on a isolé plusieurs composés connus et identifié un nouveau triterpène actif à partir du fractionnement de L. laricina. Nous avons fourni également une preuve directe pour l'évaluation et la comparaison d'une action analogue à l'insuline ou insulino-sensibilisateur des EE et HWE de plantes médicinales Cris au niveau de muscle, de foie et de tissus adipeux. Une partie de leur action peut être liée à la stimulation des voies de signalisation intracellulaire insulino-dépendante et non-insulino-dépendante, ainsi que l’activation de PPARγ. Nos résultats indiquent que les espèces de plantes, les tissus ou les cellules cibles, ainsi que les méthodes d'extraction sont tous des déterminants significatifs de l'activité biologique de plantes médicinales Cris sur le métabolisme glucidique et lipidique. / We have used a collaborative ethnobotanical approach to identify plant species used by the Cree of Eeyou Istchee (CEI) to treat symptoms of type 2 diabetes. Several screening studies were performed on 17 species identified in a survey of the Cree Nation. Firstly, Larix laricina du Roi (L. laricina) was recently identified as one of the top plants, which stimulated glucose uptake in C2C12 muscle cells and strongly potentiated the differentiation of 3T3-L1 pre-adipocytes suggesting enhanced insulin sensitivity. Secondly, these screening studies were performed on ethanol extracts (EE) using an in vitro bioassay platform, however, traditional preparations are often based on hot water. So the purpose of this PhD thesis was to isolate the active principles from L. laricina through adipogenesis-guided fractionation, and to evaluate and compare the antidiabetic activity and mechanisms of EE and hot water extracts (HWE) of these 17 Cree plants. For the fractionation of L. laricina, we isolated several known compounds and identified a new active cycloartane triterpene, which strongly enhanced adipogenesis in 3T3-L1 cells and was responsible partly for the adipogenic (potentially glitazone-like insulin sensitizing) activity of the ethanol extract of the bark of L. laricina. In the adipocyte lipid metabolism course, the results confirmed that 10 of the 17 EE stimulated adipocyte differentiation and adipogenesis, whereas 2 had inhibitory effects. Corresponding HWE exhibited partial or complete loss of such adipogenic or anti-adipogenic activity. R. groenlandicum and K. angustifolia EEs activated Peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPAR γ), sterol regulatory element binding protein-1 (SREBP-1) and CCAAT-enhancer binding protein (C/EBP) α, whereas P. balsamifera and A. incana decreased these transcription factors. P. balsamifera’s inhibitory effect was also found to involve AMP-activated protein kinase (AMPK) activation. R. groenlandicum HWE and EE stimulated similar transcription factors, but HWE of other selected plants lost such effects compared to their respective EE. Phytochemical analysis also uncovered clustering of active versus inactive species, notably when species were segregated by plant family. The results showed that several EE stimulated muscle glucose uptake and inhibited hepatic glucose-6-phosphatase (G6Pase) activity. Some of the HWE partially or completely lost these antidiabetic activities in comparison to EE; while one plant (R.groenlandicum) retained similar potential between EE and HWE in both assays. In C2C12 muscle cells, EE of R.groenlandicum, A. incana and S. purpurea stimulated glucose uptake by activating AMPK pathway and increasing GLUT4 expression level. In comparison to EE, HWE of R.groenlandicum exhibited similar activities; HWE of A. incana completely lost its effect on all parameters; interestingly, HWE of S. purpurea activated insulin pathway instead of AMPK pathway to increase glucose uptake. In the H4IIE cells, all selected 5 plants HWE and EE activated AMPK pathway, and in addition, 2 plants EE and HWE also activated insulin pathways. Quercetin-3-O-galactoside and quercetin 3-O-α-L-arabinopyranoside were identified as potential candidates to be responsible for the biological activity of the active HWE plants in the glucose transport assay. In conclusion, we isolated several known compounds and identified a new active triterpene from fractionation of L. laricina. We also provide direct evidence evaluating and comparing of an insulin-like or insulin-sensitizing action of EE and HWE of Cree medicinal plants at the level of muscle, liver and adipose tissue. Part of their actions may be related to stimulation of insulin-dependent and insulin-independent intracellular signaling pathways, as well as to PPARγ activation. The results indicate that plant species, target tissues or cells, as well as extraction methods, are all significant determinants of the biological activity of Cree medicinal plants on glucose and lipid metabolism.