Partie I L’analyse de données de relaxation des spins à l’aide de l’approche model-free est très répandue pour obtenir des informations sur la dynamique des protéines aux échelles de temps ps-ns et μs-ms. Afin d’extraire des informations de qualité, les données sont enregistrées à plusieurs champs magnétiques. Combiner de telles données est cependant sujet aux erreurs expérimentales. Ainsi, la consistence des données de relaxation à plusieurs champs doit être vérifiée. Malheureusement, cela s’effectue rarement, i.e. on assume simplement que les données sont correctes. Nous proposons donc une approche simple pour la vérification de la consistence de données de relaxation enregistrées à plusieurs champs. L’utilisation des test proposés améliore l’analyse et réduit la présence artéfactuelle d’échange conformationnel. Ainsi, comme les données d’échange conformationnel sont souvent discutées en terme de liaison de substrat ou de catalyse, s’assurer de leur validité améliore la compréhension biologique du système étudié. Partie II Les b-lactamases de classe A sont impliquées dans la résistance aux antibiotiques. Elles y participent en hydrolysant les b-lactamines. Ces enzymes ont été étudiées par différentes approches : études mutationnelles, simulations de dynamique moléculaire, cristallographie des rayons X et RMN. L’enzyme modèle de cette classe, TEM-1, a précédemment été étudiée par RMN dans notre laboratoire. TEM-1 est très rigide sur l’échelle de temps des ps-ns, mais subit des mouvements lents μs-ms au niveau du site actif. Afin de mieux caractériser la dynamique des b-lactamases de classe A, l’homologue PSE-4 a aussi été étudié par RMN avec des données de relaxation des spins, de dispersion de relaxation par CPMG et d’échange d’amides. Les mêmes conclusions que pour TEM-1 ont été obtenues : rigidité générale élevée et présence de mouvements lents près du site actif. Ces mouvements pourraient être conservés chez les b-lactamases de classe A et ainsi avoir un lien avec la catalyse enzymatique. Cette hypothèse est renforcée par les données RMN pour cTEM-17m, une chimère TEM-1/PSE-4, pour laquelle plusieurs résonances près du site actif sont non observées dû à un élargissement causé par ces mouvements lents. / Part I The analysis of spin relaxation data using the model-free formalism is a widely used approach to get insights into protein dynamics on the ps-ns and μs-ms timescales. In order to extract high quality data, multiple magnetic field datasets are required. Combining datasets recorded using different NMR magnets is prone to experimental errors. Hence, the consistency of multiple field spin relaxation data must be carefully verified. Analysis of multiple field spin relaxation data generally proceeds without verification of consistency, i.e. with only the assumption that data is fine. We propose a simple approach to verify the consistency of multiple field relaxation data. Using the proposed tests improves the analytical approach by reducing the presence of artifactual conformational exchange terms. Since these terms are often rationalised in relation with ligand binding or catalysis, improving their confidence yields a better understanding in terms of biology. Part II Class A b-lactamases are involved in antibiotics resistance. They do so by hydrolysing the b-lactam antibiotics. These enzymes have been widely studied by different approaches including mutational studies, MD simulations, X-ray crystallography and NMR. The model enzyme for this class of proteins, TEM-1, has previously been studied by NMR in the laboratory. It was observed that TEM-1 is a highly ordered protein on the ps-ns timescale, with slower μs-ms motions clustered around the active site. In order to characterize further the backbone dynamics of class A b-lactamases, the homologous enzyme PSE-4 was studied by NMR using different approaches such as spin relaxation, CPMG relaxation dispersion, and amide exchange experiments. The same conclusions as for TEM-1 were obtained with a high rigidity along the sequence balanced by slower motions in the vicinity of the active site. These motions might be conserved in class A b-lactamases and potentially be important for catalysis. This hypothesis is further enforced by the backbone resonance assignments for cTEM-17m, a TEM-1/PSE-4 chimera, where many resonances are unobservable around the active site, potentially suffering from line broadening caused by slow motions.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2008-2009 / La résistance aux antibiotiques chez les bactéries pathogènes représente un obstacle majeur dans notre bataille contre les maladies infectieuses. La cause principale est la production par les bactéries de β-lactamases, des enzymes capables de cliver les antibiotiques à noyau β-lactame. TEM-1 est la β-lactamase la plus fréquemment en cause et elle est la source prédominante de résistance aux pénicillines et céphalosporines. Bien que cette protéine soit très étudiée, certaines subtilités de son mécanisme d’action demeurent incomprises. Cette thèse présente les résultats obtenus de sa caractérisation par RMN. Nous avons effectué l’attribution des déplacements chimiques des résonances des atomes de cette protéine qui compte 263 résidus (28,9 kDa). Comme l’analyse de la dynamique interne des enzymes est essentielle à la compréhension des processus impliqués dans leurs mécanismes d’action, nous avons étudié les propriétés dynamiques de TEM-1. Les données expérimentales enregistrées (R1, R2 et NOE {¹H}-15N) nous ont permis de calculer les paramètres caractérisant les mouvements internes de la protéine. Nos résultats mettent en évidence l’extrême rigidité de TEM-1 sur l’échelle de temps des picosecondes-nanosecondes. Par ailleurs, nous avons observé la présence de mouvements lents (μs-ms) affectant la relaxation de résidus présents dans la boucle Ω ainsi que dans le site actif. La détermination de la structure de TEM-1 en solution nous a fourni d’autres indices de la présence de ces mouvements qui sont probablement impliqués dans la catalyse. Comme il a été proposé que la Tyr105 ait un rôle à jouer dans la reconnaissance et la fixation des substrats chez TEM-1, nous avons étudié les effets de différentes mutations de ce résidu par RMN. Nos résultats indiquent que l’environnement ainsi que les mouvements de plusieurs autres résidus ont été altérés suite à ces mutations. Comme certains de ces résidus sont éloignés du site actif, nous croyons que des mouvements concertés entre les résidus situés à proximité et ceux éloignés du site actif puissent jouer un rôle important pour la fonction de TEM-1. Ces travaux apportent de toutes nouvelles données sur TEM-1 et possiblement sur les autres β-lactamases de classe A, contribuant ainsi significativement à l’amélioration des connaissances dans le domaine de la résistance aux antibiotiques. / Antibiotic resistance in pathogenic bacteria represents a major obstruction in our struggle against infectious diseases. The main cause of this resistance is the production by bacteria of enzymes called β-lactamases which possess the ability to hydrolyse the amide bond of β lactam antibiotics. TEM-1 β-lactamase is the most frequently implicated and is the major source of resistance to penicillins and cephalosporins. Although being extensively studied, subtleties in the mechanism of action of this protein remain misunderstood. This thesis presents the results obtained from TEM-1 characterisation by NMR. We carried out resonance assignment for this 263 residues protein (28.9 kDa). As the analysis of internal dynamics of enzymes is essential for the understanding of processes implicated in their mechanism of action, we studied the dynamic properties of TEM-1. Experimental data (R1, R2, and {¹H}-15N-NOE) allowed us to characterize internal motions. Our results highlight the extreme rigidity of TEM-1 on the picosecond to nanosecond timescale. In addition, we observed the presence of slow motions (μs-ms) affecting the relaxation of residues located in the Ω-loop and in the vicinity of the active site. Elucidation of TEM-1’s 3-D structure in solution provided us with additional evidences of the presence of these movements which may be involved in catalysis. As it was proposed that Tyr105 could play a role in substrate recognition and binding in TEM-1, we studied the effects of several mutations at this position. Our results indicate that the environment as well as motions of several other residues were affected by these changes. As some of these residues are far from the active site, we believe that concerted motions between residues located in the vicinity and those further from the active site can play an important functional role in TEM-1. This work brings new data on TEM-1 and possibly on other class A β-lactamases, thus contributing significantly to the improvement of knowledge in the domain of antibiotic resistance.

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Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013. / Les β-lactamases sont le principal mécanisme bactérien de défense contre les β-lactamines. Elles catalysent l’inactivation de ces antibiotique par le clivage de leur noyau β-lactame. Les β-lactamases les plus communes sont celles de la classe A, qui rassemble une grande variété d’enzymes aux spécificités de substrat variées. Ces protéines ont été l’objet de nombreuses recherches expérimentales et théoriques. Plusieurs études de dynamique par spectroscopie RMN ont été réalisées dans notre laboratoire sur les enzymes modèles TEM-1 et PSE-4. Le présent projet continue l’investigation de ces deux β-lactamases par des méthodes théoriques. Un protocole de simulation de DM a été établi et validé par comparaison avec des données de relaxation RMN. Une nouvelle technique d’analyse conjointe DM/RMN a également été développée, permettant de limiter les problèmes de sous et sur-ajustement présents dans l’analyse « model-free ». Pour comparer la dynamique des β-lactamases de classe A en présence et en absence de leur substrat, un potentiel pour les β-lactamines a été développé, en tenant compte de la géométrie et du potentiel chimique particuliers du noyau β-lactame. Ce champ de forces est transférable, permettant la construction d’une variété d’antibiotiques. Nos simulations, couplées aux précédentes études par RMN, démontrent qu’il existe une dualité dynamique dans les β-lactamases de classe A : elles sont hautement structurées à l’échelle ps-ns, mais aussi le siège de mouvements lents (µs-ms) aux abords du site actif et particulièrement dans la boucle qui borde le site catalytique. La rigidité ps-ns favorise un positionnement optimal des résidus du site actif pour une catalyse efficace, et permet la tolérance de mutations potentiellement déstabilisantes. Les mouvements à l’échelle µs-ms les plus intéressants sont localisés dans la boucle Ω et confirment son rôle régulatoire : elle permet l’ouverture du site actif pour l’entrée du substrat et le largage du produit. La liaison du substrat a des effets à longue portée rigidifiant TEM-1. On observe également un mouvement accru de la boucle Ω dans TEM-1 et PSE-4. Les interactions spécifiques menant à cette plus grande flexibilité varient toutefois d’une enzyme à l’autre : il y conservation des propriétés dynamiques. / β-Lactamases are the main bacterial mechanism of resistance against β-lactams. They inactivate these antibiotics by cleaving their β-lactam ring. Class A enzymes are the most prevalent, with a broad variety of substrate specificities. These proteins were studied by numerous experimental and theoretical studies. NMR spectroscopy measurements were performed in our laboratory on model enzymes TEM-1 and PSE-4. This project continues the investigation of the dynamic properties of these two β- lactamases using theoretical methods. An MD simulation protocol was established and validated using NMR relaxation data. A new joint MD/NMR analysis technique was developped, allowing a reduction of under- and over-fitting problems in model-free analysis. To compare class A β-lactamase dynamics in presence and absence of substrate, a potential was developped to describe β-lactams, taking into account the particular geometry and chemical potential of the β-lactam cycle. This force field is transferable, allowing the construction of a variety of antibiotics. Our simulations, along with past NMR studies, prove the existence of a dynamical duality in class A β-lactamases : they are highly structured on the ps-ns timescale, but also subjected to slow motions (µs-ms) in the vicinity of the active site, particularly in the Ω loop that borders the catalytic site. Ps-ns rigidity favors an optimal positioning of active site residues for an efficient catalysis, and allows the protein to tolerate potentially destabilizing mutations. The most interesting µs-ms motions are located in the Ω loop, confirming its regulatory role : it opens the active site for substrate entry and product release. Substrate binding has structuring long-range effects on TEM-1. Increased loop motions are also observed in both TEM-1 and PSE-4. However, specific interactions responsible for this higher flexibility vary between the two enzymes : protein dynamics properties are conserved.