University, Diss., 2005--Würzburg.

Würzburg, Univ., Diss., 2009.

Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is a rare genetic disorder characterised by early contractures of the elbows, Achilles tendons and spine, slowly progressive muscle wasting and cardiomyopathy associated with cardiac conduction defect. The autosomal dominant form is caused by mutations in the LMNA gene which gives rise to lamin A and lamin C proteins by alternative splicing. These A-type lamins, together with B-type lamins, form the nuclear lamina, a network of intermediate filament proteins underlining the nuclear envelope. In order to ascertain the role lamin A and C separately contribute to the molecular phenotype, we analysed ten LMNA mutations and one single nucleotide polymorphism (SNP) in transfection studies in COS7 fibroblasts and, partially, in C2C12 myoblasts. The EGFP or DsRed2 tagged lamins were exogenously expressed either individually or both A-types together and examined by light and electron microscopy. The protein mobility of lamin A mutants was determined by FRAP analysis. Additionally, a co-immunoprecipitation binding assay of in vitro synthesised A-type lamins and emerin was performed.Eight of the LMNA mutations (R50S, R133P, E358K, E358K+C<T1698, E361K, R527P, L530P, R541S and G602S) and the SNP C<T1698, when expressed in lamin A, exhibited a range of nuclear mis-localisation patterns from a wild type phenotype to the formation of nuclear aggregates. Two mutations (T150P and delQ355) led to the severe mis-localisation of the exogenous protein and additionally affected nuclear envelope reassembly and mid-body protein composition after mitosis. Exogenously expressed DsRed2 tagged wild type and mutant lamin C was only inserted into the nuclear lamina if co-expressed with the equivalent EGFP tagged lamin A construct, except for the T150P mutation which prevented either lamin from reaching the nuclear lamina. The T150P, R527P and L530P mutations reduced the ability of lamin A, but not lamin C from binding to emerin. These data indicate that mutations in the rod domain of lamin A mainly impair its function as a structural protein, whereas mutations of the globular tail domain appear to disrupt protein-protein interactions important for gene regulation and signal transduction processes. In addition, our results suggest specific functional roles for the emerin-lamin A and emerin-lamin C containing protein complexes; this is the first report to propose that the A-type lamin mutations may be differentially dysfunctional for the same LMNA mutation. / Die Emery-Dreifuss Muskeldystrophie, ein seltene genetische Erkrankung, ist gekennzeichnet durch frühzeitige Sehnenverkürzung im Ellenbogen, an der Achillessehne und am Rückgrat, einen langsam fortschreitenden Muskelschwund sowie einer Kardiomyopathie mit Herzreizleitungsstörungen. Die autosomal-dominante Form wird von Mutationen im LMNA-Gen verursacht, welches durch alternatives Spleißen die Laminproteine A und C hervorbringt. Diese sogenannten A-Typ Lamine bilden zusammen mit den B-Typ Laminen die Kernlamina, ein Netzwerk aus Intermediär-filamentproteinen, welches innen an der Kernhülle anliegt. Um festzustellen, inwiefern Lamin A und Lamin C jeweils einzeln zum molekularen Phänotyp beitragen, wurden zehn LMNA-Mutationen und ein Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP) in Transfektionsstudien mit COS7-Fibroblasten, und teilweise auch C2C12-Myoblasten, analysiert. Die EGFP- oder DsRed2-markierten Lamine wurden entweder einzeln oder beide A-Typ Lamine zusammen exogen exprimiert und sowohl licht- als auch elektronenmikroskopisch untersucht. Die Beweglichkeit von Lamin A-Mutanten in der Kernlamina wurde durch FRAP-Analyse ermittelt und zusätzlich Ko-Immunpräzipitationsbindungsstudien mit in vitro hergestellten A-Typ Laminproteinen und Emerin durchgeführt. Exprimiert in Lamin A wiesen acht Mutationen (R50S, R133P, E358K, E358K+ C<T1698, E361K, R527P, L530P, R541S und G602S) sowie der SNP C<T1698 eine große Bandbreite an Fehl-verteilungsmustern im Kern auf, welche von der wildtypischen Verteilung bis zur Bildung von Proteinaggregaten im Kern reichte. Zwei Mutationen (T150P und delQ355) führten zu extremer Mislokalisation des exogenen Proteins und beeinflussten außerdem den Wiederaufbau der Kernhülle nach der Mitose sowie die Proteinzusammensetzung des Mid-bodies. Sowohl der Wildtyp als auch alle Mutanten von DsRed2-markiertem Lamin C wurde nur in die Kernlamina eingebaut, wenn gleichzeitig auch dessen Lamin A-Gegenstück (EGFP-markiert) exogen exprimiert wurde. Als Ausnahme verhinderte die Mutation T150P den Einbau beider A-Typ Lamine in die Lamina. Die LMNA-Mutationen T150P, R527P und L530P verringerten die Bindung von Emerin an Lamin A, aber nicht die an Lamin C. Diese Daten deuten darauf hin, dass Mutationen in der stäbchenförmigen Domäne von Lamin A hauptsächlich dessen Funktion als Strukturprotein beeinträchtigen, wohingegen Mutationen in der globulären Schwanzdomäne Protein-Protein-Interaktionen zu behindern scheinen, die bei der Genregulation und Signaltransduktion von Bedeutung sind. Zusätzlich schlagen diese Ergebnisse spezifische funktionelle Rollen für die Emerin-Lamin A und Emerin-Lamin C-Proteinkomplexe vor, was darauf schließen lässt, dass die beiden A-Typ Lamine durch dieselbe LMNA-Mutation unterschiedlich in ihrer Funktion gestört werden.

Untersuchungen zum Kerntransport in Progeriezellen und neue Möglichkeiten der Quantifizierung nukleärer Transportprozesse / Nuclear transport in progeria cells and new possibilities to quantify nuclear transport

Die Lamina ist ein dichtes Netzwerk aus Intermediär-Filamenten, den Laminen, an der nucleoplasmatischen Seite der inneren Kernmembran. Hier interagieren Lamine sowohl mit Transmembran-Proteinen der Kernhülle als auch mit dem Chromatin. Diese Wechselwirkungen mit Interaktionspartnern verschiedener zellulärer Kompartimente macht die Lamina, neben einer Gerüststruktur mit wichtigen mechanische Aufgaben, auch zu einer zentralen Schnittstelle von Signalwegen, die eine intrazelluläre Kommunikation zwischen Nucleus und Cytoplasma ermöglichen. Die Lamina ist somit ein entscheidender Regulator der funktionellen Organisation des Chromatins und der differentiellen Genexpression. Das Expressionsmuster der Lamine während der Spermatogenese von Säugern unterscheidet erheblich von der Lamin-Expression somatischer Zellen und weist einige Besonderheiten auf. Dies schließt unter anderem die spezifische Expression der verkürzten A-Typ Lamin-Spleißvariante C2 während der meiotischen Phase der Spermatogenese ein. Diese und andere Beobachtungen deuteten bereits länger darauf hin, dass der speziellen Zusammensetzung der Lamina und vor allem dem meiosespezifischen Lamin C2 während der Gametogenese im männlichen Organismus eine entscheidende Rolle zukommen könnte. Neuere Studien im Mausmodell bekräftigen diese Hypothese und leisten darüber hinaus einen entscheidenden Betrag dazu, die Funktion der Lamina während der Meiose auf molekularer Ebene präzise zu definieren. Im deutlichen Gegensatz zu den weitreichenden Kenntnissen zur Situation in Männchen lagen zu Beginn der vorliegenden Arbeit keine Daten über die Zusammensetzung der Lamina in weiblichen Keimzellen vor. Konsequenterweise existierten auch keine funktionellen Untersuchungen zur Relevanz der Lamina für die Oogenese. In der vorliegenden Arbeit wurden diese reproduktionsbiologisch hoch interessanten Fragestellungen detailliert untersucht. Dabei zeigte sich unter anderem, dass Lamin C2 auch in weiblichen Keimzellen spezifisch während der Meiose exprimiert wird. Durch Studien an einer Lamin C2-defizienten Mauslinie wurde die Funktion von Lamin C2 in der Meiose in Weibchen genau untersucht. Dabei wurde eine erhebliche Beeinträchtigung der strukturellen Paarung der homologen Chromosomen und der homologen Rekombination in Lamin C2-defizienten Weibchen festgestellt. Da die genannten Prozesse Schlüsselereignisse für die korrekte Segregation der Homologen in späteren Stadien der Meiose sind, deuten die erzielten Ergebnisse auf eine erhebliche qualitative Beeinträchtigung der reifen Gameten in Lamin C2-defizienten Weibchen hin. Ein weiterer zentraler Aspekt der Arbeit war die Analyse der molekularen Eigenschaften des meiosespezifischen Lamin C2 in vitro. Diese Experimente definieren wichtige Unterschiede hinsichtlich seiner Polymerisationseigenschaften im Vergleich zu Laminen somatischer Zellen und tragen, zusammen mit anderen Studien, dadurch erheblich dazu bei, die Funktion von Lamin C2 in der Meiose im mechanistischen Sinne besser zu verstehen. Zudem deckt die vorliegende Arbeit erstmals einen funktionellen Zusammenhang zwischen der Lamina-Zusammensetzung und der Qualität der Keimzellen weiblicher Säuger auf und ermöglicht dadurch zukünftige Studien zur Rolle der Lamine in der Oogenese, die möglicherweise auch für die menschliche Fertilität sehr interessant sein könnte. Der zweite Teil der Dissertation beschäftigt sich mit der Beschreibung einer trunkierten A-Typ Lamin-Spleißvariante in einer Mauslinie, die bislang als A-Typ Lamin-defizient angesehen wurde (Lmna-/-). Die durchgeführten Untersuchungen besitzen vor allem dadurch hohe Relevanz, dass die untersuchte Lmna-/- Mauslinie seit Jahren als das wichtigste Modell zur funktionellen Untersuchung der A-Typ Lamine gilt und bereits in einer Vielzahl von Publikationen eingesetzt wurde. In den hierzu durchgeführten Versuchen konnte das in der Lmna-/- Mauslinie persistierende A-Typ Lamin mittels diverser methodischer Ansätze als C-terminale Deletionsmutante definiert werden, der die Exons 8-11 der insgesamt 12 Exons des Lmna-Gens fehlen. Daher wurde diese Lamin A-Mutante als Lamin AΔ8-11 bezeichnet. Die Konsequenzen der C-terminalen Deletion für die physiologischen Eigenschaften des Lamin Adelta8-11 sowie die Auswirkungen seiner Expression in der Lmna-/- Mauslinie auf aktuelle Modellvorstellungen zur Funktion der A-Typ Lamine und zur Entstehung Lamin-assoziierter, humaner Erkrankungen (Laminopathien) werden in der Arbeit ausführlich diskutiert. / The nuclear lamina is a dense meshwork of intermediate filament proteins termed lamins that lines the nucleoplasmatic face of the inner nuclear membrane. By its interactions with both integral membrane proteins and chromatin the lamina constitutes a cellular hub at the nucleo-cytoplasmatic interface that serves both structural and regulatory functions. With regard to this, lamins have been implicated in basic cellular processes such as transcription, signaling and chromatin organization and are therefore currently considered as major regulators of differential gene expression. Compared to somatic cells, nuclear lamina composition of male mammalian meiocytes is remarkably different. This includes the specific temporal expression of the short A-type lamin splice variant lamin C2 at meiotic stages of male germ cell development. Several lines of evidence indicated that meiosis-specific lamin C2 could serve an essential role for meiosis in males. Recently, this hypothesis has found strong support by in vivo studies in lamin C2-deficient males and these studies substantially contributed to the precise definition of lamin C2 function on a molecular level. In contrast to this, nuclear lamina subtype composition in female meiocytes has never been analyzed and, consequently, its contribution to the formation of viable gametes in females remained elusive. In the present study, these issues have systematically been addressed. Here, detailed immunohistochemical analyses demonstrate that, as in the male, female germ cells (oocytes) undergoing prophase I of meiosis specifically express lamin C2. Following functional studies performed in lamin C2-deficient mice disclosed a pivotal role of lamin C2 for central meiotic processes in females. These include the requirement of lamin C2 for precise pairing of the homologous chromosomes that occurs in meiotic prophase I as well as its contribution to the timely and efficient progression of homologous recombination events in oocytes. Since accurate segregation of paternal chromosomes during first meiotic division is known to be critically dependent on both precise homologous pairing and recombination, these data point to an as yet unanticipated role of lamin C2 for the development of viable gametes in females. Moreover, detailed in vitro experiments were performed to analyze the molecular properties of meiosis-specific lamin C2 compared to somatic lamin variants. This revealed distinct properties of lamin C2 that are compatible with models suggesting that this short lamin variant significantly modifies the structural properties of the nuclear envelope (NE) of mammalian meiocytes. These structural modifications, in turn, are considered to facilitate dynamic repositioning of NE-attached meiotic telomeres which, besides homologous pairing and recombination, is a further most central and evolutionarily conserved hallmark of meiotic prophase I with an essential relevance for accurate genome haploidization. Thus, together with other important observations made in the lamin C2-deficient mouse model, the data presented in this thesis significantly contribute to our understanding of lamin C2 function on a molecular level. The second part of the study is based on a rather unexpected finding in another lamin-deficient mouse model. This finding concerns the Lmna-/- mouse line that was established in 1999 by Sullivan and others by gene targeting of the Lmna gene encoding A-type lamins. Since then, these mice have frequently been used in a multitude of important studies that aimed to analyze various different aspects of A-type lamin function. This thesis now provides compelling evidence that, unexpectedly and contradicting previous reports, a truncated lamin A mutant persist in the Lmna-/- mouse line that was considered as completely devoid of A-type lamins thus far. By the use of various technical approaches, including detailed mass spectrometry, the presented data precisely define the lamin A variant present in Lmna-/- mice (designated lamin Adelta8-11) as a C-terminal lamin deletion mutant that lacks domains with known important functions for protein interactions and posttranslational processing. Based on these findings, implications for the interpretation of previous reports using Lmna-/- mice as well as for our current models of A-type lamin function and the pathophysiology of lamin-associated disorders in humans (laminopathies) are considered in the discussion of the thesis.

In der Kernlamina von Spermatozyten von Nagetieren sind die Lamin A-Genprodukte, Lamin A und C, durch eine meiosespezifische Splicingvariante ersetzt. Dieses Lamin C2 unterscheidet sich auffallend von den somatischen Varianten in Struktur, Menge und Verhalten. Durch eine ektopische Expression von Lamin C2 als EGFP-Lamin C2-Fusionsprotein in einer somatischen Zellinie zeigte sich, daß eine neuartige Hexapeptidsequenz (GNAEGR) am N-terminalen Ende des Proteins anstelle der C-terminal gelegenen CaaX-Box somatischer Lamine für die Interaktion mit der Kernhülle verantwortlich ist. So ermöglicht eine posttranslationelle Myristylierung des ersten Glycins ein Membrantargeting, bei dem der hydrophobe Myristinsäurerest vergleichbar dem hydrophoben Farnesylrest am Cystein der Caax-Box mit den Fettsäureresten der Kernmembran interagiert. Die Deletion des Hexapeptids im Fusionsprotein EGFP-Lamin C2 und die seine N-terminale Insertion in das Fusionsprotein EGFP-Lamin C - es besitzt keine Caax-Box - bestätigt, daß allein das Hexapeptid das Membrantargeting steuert: Die Deletionsmutante EGFP-Lamin C2 bleibt diffus im Kern verteilt, während sich die Insertionsmutante EGFP-Lamin C im Bereich der Kernperipherie anreichert. Eine weitere Besonderheit stellt die Verteilung von Lamin C2 innerhalb der Kernhülle dar, denn es verteilt sich nicht gleichmäßig wie alle bisher bekannten Lamine, sondern bildet zahlreiche Aggregate. Nicht nur in der Kernhülle von Spermatozyten, sondern auch als Fusionsprotein in somatischen Zellen exprimiert, zeigt Lamin C2 diese Akkumulationen. Überraschenderweise treten die Synaptonemal-komplexenden nur im Bereich dieser Lamin C2-Aggregate mit der Kernhülle in Kontakt. Es wird daher postuliert, daß die Lamin C2-Aggregate der lokalen Verstärkung der Kernhülle dienen und wichtig für die auf die Prophase beschränkte Anheftung der SC an die Kernhülle sind. Da zudem in einer Kurzzeitkultur von Pachytänspermatozyten, in der die Prophase künstlich beschleunigt wird, gezeigt werden konnte, daß Lamin C2 mit Ende der Prophase I noch vor dem Auflösen der eigentlichen Kernhülle nicht mehr nachweisbar ist, scheint ein Zusammenhang zwischen Lamin C2 in der Kernhülle und der Umorganisation des genetischen Materials zu bestehen. / In the spermatocytes of rodents the lamin A gene products, lamin A and C, are substituted by a meiosis specific splicing variant called lamin C2, which differs significantly in structure, amount and function from somatic lamins. Instead of having a CaaX-Box, which mediates interaction between the somatic lamins and the nuclear membrane, a novel kind of membrane targeting is found in lamin C2. It consists of a hexapeptide sequence (GNAEGR) which substitutes the N-terminus and parts of the a-helical rod domain. Transfection experiments with a EGFP-lamin C2- fusion protein in a somatic cell line showed that without this hexapeptide no membrane targeting of lamin C2 takes place, while an insertion of the hexapeptide enables lamin C to accumulate at the periphery of the nuclear envelope. The first N-terminal glycine of the hexapeptide is posttranslationally modified by a myristic acid residue whose hydrophobic chain interacts with the nuclear membrane similar to the farnesyl residue in somatic lamins. By looking for the localization in the nuclear envelope lamin C2 reveals another surprising behaviour compared to somatic lamins. While other lamins are distributed evenly in the nuclear envelope, lamin C2 is found in several aggregates. Furthermore, the accumulation is not restricted to the nuclear envelope of spermatocytes, but also found in somatic cells when lamin C2 as EGFP-lamin C2 fusion protein is ectopically expressed. Contrary to somatic cells where no effect of ectopically expressed EGFP-lamin C2 on the organization of chromatin can been seen, in spermatocytes the position of SC-ends colocalize with lamin C2 rich areas of the nuclear envelope without exeption. The N-terminal part of somatic lamins that is missing in lamin C2 contains domains which are involved in dimerization and polymerization of A-type and B-type lamins. Therefore a new way of interaction in the nuclear envelope of spermatocytes has to be proposed for lamin C2. Additionally, lamin C2 can only be found in spermatocytes during prophase I. A short-time culture which accelerates the development of pachytene spermatocytes by the phosphatase inhibitor Okadaic acid supports the finding that lamin C2 vanishes before the break down of the nuclear envelope in metaphase I begins.

Plusieurs publications, parues lors de ma thèse, ont révélé que les protéines de la membrane nucléaireinterne (INM) et plus particulièrement l’émerine, la lamine A, SUN1, l’actine et BAF, jouaient un rôleessentiel dans les propriétés mécaniques du noyau et de la cellule. L’assemblage de l’enveloppenucléaire et les interactions de ces protéines entre-elles sont régulées par des évènements dephosphorylation et d’oligomérisation. Mon objectif était de décrire les évènements moléculairesessentiels à l’assemblage de l’enveloppe nucléaire interne, afin de pouvoir par la suite comprendrecomment l’enveloppe nucléaire répond à un stress mécanique.J’ai dans un premier temps caractérisé les évènements d’oligomérisation et de phosphorylation de laprotéine émerine. J’ai montré que cette protéine était capable de former, in vitro et en cellules, de grosoligomères indispensables à son interaction avec la lamine A. J’ai également observé que desmutations dans l’émerine, aboutissant à la dystrophie musculaire d’Emery-Dreifuss, affectaient lespropriétés d’auto-association de cette protéine.En parallèle, j’ai étudié les interactions entre émerine, lamine, SUN1, actine et BAF in vitro. J’ai pumontrer des interactions directes entre le domaine C-terminal de la lamine A et les protéines émerine,actine et SUN1. Ces trois protéines lient la lamine A sur des surfaces différentes suggérant l’existencede complexes à 3 ou 4 protéines dans la cellule. L’analyse des modes de régulation des interactionsentre ces protéines doit être poursuivie afin de comprendre quels sont les évènements moléculairesessentiels au maintien de l'intégrité nucléaire et à la transmission d’un signal mécanique entre lecytosquelette et le nucléosquelette. / During my PhD, several papers revealed that the inner nuclear membrane (INM) proteins, andespecially emerin, lamin A, SUN1, actin and BAF, played an essential role in the mechanicalproperties of the nucleus and the cell. The nuclear envelope assembly and the interactions betweenthese proteins are regulated by phosphorylation and oligomerization events. My aim was to describemolecular events essential for inner nuclear envelope assembly as a first step to understand how thenuclear envelope responds to a mechanical stress.I first characterized the oligomerization and phosphorylation states of the protein emerin. I showedthat this protein is capable of forming, in vitro and in cells, large oligomers essential to its interactionwith lamin A. I also observed that several emerin mutations leading to Emery-Dreifuss musculardystrophy impaired the self-association properties of this protein.In parallel, I studied the interactions between emerin, lamin, SUN1, actin and BAF in vitro. I was ableto demonstrate direct interactions between the C-terminal domain of lamin A and the proteins emerin,actin and SUN1. These three proteins bind lamin A on different surfaces suggesting the existence ofcomplexes of 3 or 4 proteins in the cell. Analysis of the mechanisms regulating interactions betweenthese proteins should be pursued in order to understand what are the molecular events responsible forthe maintenance of nuclear integrity and the transmission of a mechanical signal between thecytoskeleton and the nucleoskeleton.

La dystrophie musculaire d'Emery-Dreifuss (EDMD) est caractérisée par des retractions précoces, une faiblesse et atrophie musculaire lentement progressive, et une atteinte cardiaque. Les mutations des gènes EMD et LMNA sont respectivement responsables de formes liées à l'X et de formes autosomiques de l'EDMD. Ces deux gènes codent pour des protéines de l'enveloppe nucléaire, l'émerine et les lamines A/C. Les mutations du gène FHL1 ont été impliquées dans d'autres cas d'EDMD liée à l'X. FHL1 codent pour FHL1A, FHL1B et FHL1C, protéines jamais décrites comme localisées à l'enveloppe nucléaire. Nous avons cherché à enrichir les connaissances sur la distribution subcellulaire des différentes isoformes de FHL1 dans les muscles squelettiques humains sains et malades. Nous avons mis en évidence que les isoformes FHL1 présentent à la fois une localisation cytoplasmique et nucléaire dans les myoblastes humains. Au noyau, FHL1B est fortement accumulé au niveau de l'enveloppe nucléaire où il interagit avec les lamines A/C et l'émerine. Cette localisation à l'enveloppe nucléaire est indépendante de l'expression de l'émerine ou des lamines A/C. La différenciation des myoblastes entraîne une forte réduction de l'expression de FHL1B et de son exclusion progressive du noyau, n'impliquant pas la protéine CRM-1. Nous avons mis en évidence l'augmentation de l'expression de FHL1B dans les myoblastes de deux patients atteints d'EDMD, l'un porteur d'une mutation dans le gène LMNA, l'autre dans le gène FHL1. En conclusion, la localisation spécifique de FHL1B et sa modulation dans les myoblastes de patients confirment les cas d'EDMD liés à FHL1 comme des pathologies de l'enveloppe nucléaire. / Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is characterized by the triad of early contractures, slowly progressive muscle wasting and weakness, and cardiac disease. Mutations in EMD and LMNA, encoding for the nuclear envelope (NE) proteins emerin and lamin A/C, are associated with X-linked and autosomal form of EDMD, respectively. The discovery that FHL, encoding FHL1A, FHL1B and FHL1C, is implicated in the pathogenesis of EDMD, raises the question of how a non-NE protein can be linked to emerin and lamin A/C. We aimed to provide knowledge of the subcellular distribution and expression of the various FHL1 isoforms in healthy and diseased human skeletal muscle. We found that FHL1 isoforms display a dual cytoplasmic and nuclear localization in human myoblasts. In addition, FHL1B strongly accumulated at the NE where it interacted with both lamin A/C and emerin. NE localization of FHL1B was independent of emerin and lamin A/C expression. Myoblast differentiation resulted in greatly reduced FHL1B protein expression and in the progressive nuclear exclusion of FHL1 protein isoforms. We have shown that chromosome region maintenance 1 (CRM1)-mediated nuclear export was not involved in the progressive decrease of nucleoplasmic FHL1B. Finally, we detected increased FHL1B protein levels in myoblasts of two patients with LMNA- and FHL1-related EDMD. Altogether, the specific localization of FHL1B and its modulation in disease-patient’s myoblasts confirmed FHL1-related EDMD as a NE disease.

La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) est une maladie neurologique héréditaire du système nerveux périphérique. A ce jour, près de 80 gènes sont décrits comme étant à l’origine d’une forme de CMT dont tous les modes de transmission sont connus. AR-CMT2A est due à une mutation faux-sens homozygote, c.892C>T, dans l’exon 5 du gène LMNA et conduit à la substitution d’une Arginine par une Cystéine (p.Arg298Cys) au sein d’un motif conservé du domaine central coil des Lamines de type A. L’étude présentée ici fait suite à un certain nombre d’observations ayant démontré la diminution de l’expression du gène dans les cellules de patients, et la perte d’interaction entre les Lamines A/C mutées et le facteur de transcription c-Jun. Or celui-ci participe au complexe régulateur AP-1 pour lequel le promoteur du gène LMNA possède deux éléments de fixation. L’ensemble du travail exposé dans ce manuscrit s’est donc basé sur l’hypothèse selon laquelle les Lamines de type A auraient la capacité de réguler leur propre expression et seraient capables, dans le nerf périphérique, d’établir des interactions avec des partenaires spécifiques du nerf périphérique. / Charcot-Marie-Tooth (CMT) disorders constitute a complex and heterogeneous group of hereditary motor and sensory neuropathies characterized by muscle weakness and wasting, foot and hand deformities and electrophysiological changes. Genetically, CMT is characterized by a great heterogeneity, with all modes of inheritance and more than 50 genes described to date. My PhD work focuses on AR-CMT2A, a rare autosomal recessive axonal form of CMT, due to a unique homozygous missense mutation c.892C>T in LMNA exon 5, which leads to the substitution of an arginine by a cysteine (p.Arg298Cys) within a conserved motif in the central rod domain of A-type Lamins. My work aimed at providing clues toward a better understanding of the physiopathological mechanisms underlying AR-CMT2A and is based on previous results for my research team, showing a decrease in the expression of LMNA in patients’ cells, and a loss of interaction between A-type Lamins and the transcription factor c-Jun in patients’ cells. c-Jun is a member of the AP-1 complex, a well-known dimeric transcription factor, and for which interestingly, the LMNA promoter has two binding sites. All the work outlined in this manuscript is based on the hypothesis that A-type Lamins, have the capacity to regulate their own expression and therefore, are also most probably involved in interactions with partners involved in gene regulation, in particular in the Peripheral Nerve System.

Les lamines sont le principal composant du nucléosquelette. Elles sont principalement localisées à l’enveloppe nucléaire, où elles interagissent avec la membrane nucléaire interne, les protéines associées à la chromatine ainsi qu’avec des modulateurs de la signalisation cellulaire. Le gène LMNA code pour la prélamine A et la lamine C. La région C-terminale de la prélamine A est prédite pour être désordonnée et est la cible de plusieurs événements de maturation. En effet, la protéine est farnésylée, coupée, carboxyméthylée, puis coupée à nouveau ; perdant finalement son groupement farnésyl. Un mutant de cette protéine, dont 50 acides aminés sont manquants, est responsable du syndrome d’Huchtinson-Gilford, appelé progéria (Eriksson et al., 2003). Chez ce mutant, appelé progérine, le site de coupure finale est absent et la protéine reste constitutivement farnésylée. La lamine A est connue pour interagir avec la protéine de la membrane nucléaire interne, l’émerine. L’absence d’émerine est responsable de la dystrophie musculaire d’Emery Dreifuss. L’émerine contient un LEM, suivi d’une région prédite comme désordonnée, essentielle pour l’auto-assemblage de l’émerine (Berk et al., 2014). L’oligomérisation de l’émerine régule ses interactions avec plusieurs partenaires à la membrane nucléaire interne et à la chromatine. Nous avions auparavant démontré que la région nucléoplasmique de l’émerine peut s’auto-associer pour former des filaments in vitro (Herrada et al., 2015) et nous avons récemment révélé que ces filaments sont capables d’interagir directement avec la queue de la lamine A (Samson et al., 2018). Ici, je me suis intéressé à l’analyse structurale des régions prédites comme désordonnées chez (1) l’émerine (2) la prélamine A. Dans le cas de l’émerine, j’ai analysé la conformation de la région nucléoplasmique d’émerine avant et après auto-assemblage, en travaillant avec l’émerine sauvage et plusieurs mutants entraînant des myopathies. J’ai montré que deux fragments de l’émerine 1-187 et 67-221 peuvent polymériser, tandis que leur région commune 67-187, reste toujours monomérique dans nos conditions (Samson et al., 2018). Nous avons aussi montré que le domaine LEM est au moins partiellement déplié au cours de l’assemblage de la région 1-187. J’ai également attribué les signaux RMN de la région désordonnée 67-170, dans le but d’étudier par la suite l’impact des phosphorylations de cette région sur la structure de l’émerine et sur ses propriétés d’auto-assemblage (Samson et al., 2016). Dans le cas de la lamine A, j’ai étudié la région C-terminale de la prélamine A, prédite comme dépliée et qui est le siège de nombreuses modifications post-traductionnelles. J’ai attribué les signaux RMN du peptide prélamine A ainsi que de son mutant progérine (Celli et al., 2018). J’ai montré que ces deux peptides sont en effet déplés et possèdent une hélice  transitoire très conservée. Je propose cette hélice comme site de liaison pour un partenaire encore non identifié. J’ai également démontré que le peptide prélamine A possède une tendance à s’auto-assembler. Cependant, la prélamine A et le peptide progérine sauvages et farnésylés, n’interagissent pas avec le domaine IgFold de la lamine A ni avec BAF, deux domaines associés avec la progéria. J’ai étudié par la suite les interactions de ces peptides avec deux autres partenaires associés à la progéria : la protéine de la membrane nucléaire interne SUN1 et la protéine associée à la chromatine RBBP4. SUN1 est également intrinsèquement désordonnée et très peu soluble dans nos conditions. Les résultats montrent que le peptide prélamine A ne lie pas RBBP4 mais pourrait avoir besoin de la partie C-terminale qui la précède. Cependant, RBBP4 lie directement le partenaire de la lamine BAF. Sur les bases de ces résultats, je propose une série d’expériences pour identifier les détails moléculaires des interactions entre la queue C-terminale de la lamine A, BAF et RBBP4. / Lamins are the main components of the nucleoskeleton. They are primarily located at the nuclear envelope, where they interact with inner nuclear membrane proteins, chromatin-associated proteins and cell signaling modulators. The LMNA gene codes for prelamin A and lamin C. The C-terminal region of prelamin A is predicted to be unfolded and is the target of several maturation events. Indeed, the protein is farnesylated, cleaved, carboxymethylated and cleaved again; losing eventually its farnesyl group. A mutant of this protein, lacking 50 amino acids, is responsible for the Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome (Eriksson et al., Nature 2003). In this mutant, called progerin, the final cleavage site is absent and the protein stays constitutively farnesylated. Lamin A is reported to interact with the inner nuclear membrane protein emerin. Lack of emerin is responsible for Emery Dreifuss Muscular Dystrophy. Emerin contains a folded LEM domain, followed by a region that is predicted to be disordered and is essential for emerin self-assembly (Berk et al., 2014). Emerin oligomerization regulates its interaction with several partners at the inner nuclear membrane and at the chromatin. We previously showed that the nucleoplasmic region of emerin can self-assemble to form curvilinear filaments in vitro (Herrada et al., 2015) and we recently revealed that these filaments are able to directly bind to the lamin A tail (Samson et al., 2018).Here I focused on the structural analysis of regions that are predicted to be unfolded in (1) emerin, (2) prelamin A. In the case of emerin, I analysed the conformation of the nucleoplasmic region of emerin before and after self-assembly, working on wild-type emerin as well as several mutants causing myopathies. I showed that the two fragments of emerin 1-187 and 67-221 were able to self-assemble, whereas their common region, 67-187, is always a monomer in our conditions (Samson et al., 2018). I also revealed that the LEM domain is at least partially unfolded during self-assembly of region 1-187, as a mutant with a destabilized LEM domain self-assembles faster and a mutant with a LEM domain locked in its folded conformation cannot self-assemble (Samson et al., 2017). I also assigned all the NMR signals of the unfolded region 67-170, in order to further study by NMR the impact of phosphorylation of this region on emerin structure and self-assembly properties (Samson et al., 2016). In the case of lamin A, I studied the C-terminal region of prelamin A that is predicted as unfolded and is heavily post-translationally modified. I assigned the NMR signals of this prelamin A peptide as well as its mutant peptide corresponding to the progerin sequence (Celli et al., 2018). I showed that both peptides are indeed unstructured and exhibit a partially populated  helix that has a highly conserved sequence. I propose that this helix is a binding site for a yet unidentified partner. I also revealed that the prelamin A peptide has a tendency to self-assemble. However, the monomeric prelamin A and progerin peptides, wild-type as well as farnesylated, do not interact with the immunoglobulin-like domain of lamin A/C and with BAF, two domains associated with progeria. Then, I investigated the interactions mediated by these peptides and two other important partners associated to progeria: the inner nuclear membrane SUN1 and the chromatin-associated protein RBBP4. However, SUN1 is also intrinsically disordered and poorly soluble in our conditions. First results showed that the prelamin peptide does not bind to RBBP4 but might need the remaining part of the lamin A tail for this interaction. However, RBBP4 directly binds to the lamin partner BAF. Based on my results, I propose a set of experiments to identify the molecular details of the interactions between the lamin A tail, BAF and RBBP4.