A leucodistrofia metacromática (MLD) é um erro inato do metabolismo de herança autossômica recessiva, dividido em três subtipos clínicos de acordo com a idade de início dos sintomas. Na MLD ocorre deposição intralisossômica de glicolipídeos sulfatados principalmente no sistema nervoso central. A causa dessa doença é a deficiência de arilsulfatase A (ARSA), uma glicoproteína lisossômica que catalisa a hidrólise de glicolipídeos sulfatados constituintes da bainha de mielina. Até o momento cerca de 140 mutações relacionadas à manifestação de MLD foram descritas no gene da ARSA, das quais duas delas ocorrem com alta frequência na maioria das populações estudadas. Ademais, entre 7% e 12% das pessoas saudáveis têm deficiência in vitro de ARSA, condição denominada pseudodeficiência de ARSA (PD-ARSA). Não existem dados de caracterização genotípica de pacientes brasileiros com MLD. Da mesma forma, dados sobre a dinâmica molecular (DM) da ARSA também são escassos, em parte por dificuldades metodológicas implicadas no estudo desses aspectos em glicoproteínas. Nesse contexto, os objetivos desse trabalho foram identificar os alelos mutantes no gene da ARSA em pacientes brasileiros com MLD e avaliar os efeitos da glicosilação e do pH na DM da ARSA. A amostra foi composta por 27 pacientes com MLD. A mutação mais frequente (c.459+1G>A) e polimorfismos constituintes do alelo PD-ARSA foram detectados por PCR em tempo real e as demais mutações por sequenciamento direto do gene da ARSA. As DM realizadas foram de (i) ARSA não glicosilada em pH~7 e (ii) em pH~5, (iii) ARSA triplamente glicosilada e (iv) deficientemente glicosilada p.N350S, usando GROMACS. Nesse estudo a mutação c.459+1G>A foi a mais frequente (0,50), conforme esperado pela alta prevalência de pacientes com MLD infantil em nossa coorte. As mutações p.P426L (0,08) e c.103_110del8 (0,08) também apresentaram frequências relevantes quando comparadas às demais mutações. No conjunto, 11 mutações raras foram identificadas, incluindo 2 mutações novas: p.S44P e p.P284S. Além das mutações potencialmente deletérias, foram identificados 2 polimorfismos neutros frequentemente associados à mutação c.459+1G>A (p.W193C [0,54] e p.T391S [0,65]) e 2 polimorfismos constituintes do alelo PD-ARSA (p.N350S [0,15] e c.1524+95A>G [0,04]). As análises estruturais demonstraram um papel fundamental tanto da glicosilação, quanto do meio ácido na estabilidade da ARSA, o que é compatível com sua atividade lisossomal. / Metachromatic leukodystrophy (MLD) is an inborn error of metabolism inherited in an autosomal recessive manner. MLD is a neurodegenerative condition divided into three clinical types according to age at onset of symptoms. In MLD, intralysosomal deposition of sulfated glycolipids is observed mainly in the central nervous system. The biochemical defect associated to MLD is deficiency of arylsulfatase A (ARSA), a lysosomal glycoprotein that catalyzes degradation of sulfated glycolipids found in the myelin sheet. So far, around 140 MLD-associated mutations have been identified in ARSA gene. However, two of those remain at high frequency in the majority of studied populations. In addition to MLD, in vitro ARSA deficiency is observed in approximately 7-12% of healthy population, a condition named ARSA-pseudodeficiency (ARSA-PD). Up to date, there is no available data on genotypic characterization of Brazilian MLD patients. In the same way, data on ARSA molecular dynamics (MD) are also sparse, in part due by methodological difficulties related to studies of these aspects in glycoproteins. In this context, the aims of this work were to identify mutant alleles in the ARSA gene from MLD Brazilian patients, and evaluate the effects of pH and glycosylation in ARSA MD. Sample population was composed by 27 MLD patients. The most frequent MLD-associated ARSA mutation (c.459+1G>A) and the ARSA-PD polymorphisms were detected by real-time PCR, and the remaining mutations were detected by direct sequencing of ARSA gene. The performed MD were (i) non-glycosylated ARSA at pH~7 and (ii) at pH~5, (iii) fullyglycosylated ARSA at pH~5, and (iv) poorly-glycosylated ARSA-mutant p.N350S, using GROMACS. In this study the most frequent mutation was c.459+1G>A (0.50), as expected by the high prevalence of infantile-MLD cases. Mutations p.P426L (0.08) and c.103_110del8 (0.08) were also found at relevant frequencies when compared to other mutations. In total, 11 MLD-associated rare mutations were identified, including 2 novel putative disease-causing: p.S44P and p.P284S. Besides deleterious mutations, 2 polymorphisms frequently associated with c.459+1G>A (p.W193C [0.54] and p.T391S [0.65]) and 2 polymorphisms constituents of ARSA-PD allele (p.N350S [0.15] and c.1524+95A>G [0.04]) were observed. The structural analysis demonstrated the fundamental role related to glycosylation and the acid medium in the stability of ARSA that is compatible with its lysosomal activity.

A leucodistrofia metacromática (MLD) é um erro inato do metabolismo de herança autossômica recessiva, dividido em três subtipos clínicos de acordo com a idade de início dos sintomas. Na MLD ocorre deposição intralisossômica de glicolipídeos sulfatados principalmente no sistema nervoso central. A causa dessa doença é a deficiência de arilsulfatase A (ARSA), uma glicoproteína lisossômica que catalisa a hidrólise de glicolipídeos sulfatados constituintes da bainha de mielina. Até o momento cerca de 140 mutações relacionadas à manifestação de MLD foram descritas no gene da ARSA, das quais duas delas ocorrem com alta frequência na maioria das populações estudadas. Ademais, entre 7% e 12% das pessoas saudáveis têm deficiência in vitro de ARSA, condição denominada pseudodeficiência de ARSA (PD-ARSA). Não existem dados de caracterização genotípica de pacientes brasileiros com MLD. Da mesma forma, dados sobre a dinâmica molecular (DM) da ARSA também são escassos, em parte por dificuldades metodológicas implicadas no estudo desses aspectos em glicoproteínas. Nesse contexto, os objetivos desse trabalho foram identificar os alelos mutantes no gene da ARSA em pacientes brasileiros com MLD e avaliar os efeitos da glicosilação e do pH na DM da ARSA. A amostra foi composta por 27 pacientes com MLD. A mutação mais frequente (c.459+1G>A) e polimorfismos constituintes do alelo PD-ARSA foram detectados por PCR em tempo real e as demais mutações por sequenciamento direto do gene da ARSA. As DM realizadas foram de (i) ARSA não glicosilada em pH~7 e (ii) em pH~5, (iii) ARSA triplamente glicosilada e (iv) deficientemente glicosilada p.N350S, usando GROMACS. Nesse estudo a mutação c.459+1G>A foi a mais frequente (0,50), conforme esperado pela alta prevalência de pacientes com MLD infantil em nossa coorte. As mutações p.P426L (0,08) e c.103_110del8 (0,08) também apresentaram frequências relevantes quando comparadas às demais mutações. No conjunto, 11 mutações raras foram identificadas, incluindo 2 mutações novas: p.S44P e p.P284S. Além das mutações potencialmente deletérias, foram identificados 2 polimorfismos neutros frequentemente associados à mutação c.459+1G>A (p.W193C [0,54] e p.T391S [0,65]) e 2 polimorfismos constituintes do alelo PD-ARSA (p.N350S [0,15] e c.1524+95A>G [0,04]). As análises estruturais demonstraram um papel fundamental tanto da glicosilação, quanto do meio ácido na estabilidade da ARSA, o que é compatível com sua atividade lisossomal. / Metachromatic leukodystrophy (MLD) is an inborn error of metabolism inherited in an autosomal recessive manner. MLD is a neurodegenerative condition divided into three clinical types according to age at onset of symptoms. In MLD, intralysosomal deposition of sulfated glycolipids is observed mainly in the central nervous system. The biochemical defect associated to MLD is deficiency of arylsulfatase A (ARSA), a lysosomal glycoprotein that catalyzes degradation of sulfated glycolipids found in the myelin sheet. So far, around 140 MLD-associated mutations have been identified in ARSA gene. However, two of those remain at high frequency in the majority of studied populations. In addition to MLD, in vitro ARSA deficiency is observed in approximately 7-12% of healthy population, a condition named ARSA-pseudodeficiency (ARSA-PD). Up to date, there is no available data on genotypic characterization of Brazilian MLD patients. In the same way, data on ARSA molecular dynamics (MD) are also sparse, in part due by methodological difficulties related to studies of these aspects in glycoproteins. In this context, the aims of this work were to identify mutant alleles in the ARSA gene from MLD Brazilian patients, and evaluate the effects of pH and glycosylation in ARSA MD. Sample population was composed by 27 MLD patients. The most frequent MLD-associated ARSA mutation (c.459+1G>A) and the ARSA-PD polymorphisms were detected by real-time PCR, and the remaining mutations were detected by direct sequencing of ARSA gene. The performed MD were (i) non-glycosylated ARSA at pH~7 and (ii) at pH~5, (iii) fullyglycosylated ARSA at pH~5, and (iv) poorly-glycosylated ARSA-mutant p.N350S, using GROMACS. In this study the most frequent mutation was c.459+1G>A (0.50), as expected by the high prevalence of infantile-MLD cases. Mutations p.P426L (0.08) and c.103_110del8 (0.08) were also found at relevant frequencies when compared to other mutations. In total, 11 MLD-associated rare mutations were identified, including 2 novel putative disease-causing: p.S44P and p.P284S. Besides deleterious mutations, 2 polymorphisms frequently associated with c.459+1G>A (p.W193C [0.54] and p.T391S [0.65]) and 2 polymorphisms constituents of ARSA-PD allele (p.N350S [0.15] and c.1524+95A>G [0.04]) were observed. The structural analysis demonstrated the fundamental role related to glycosylation and the acid medium in the stability of ARSA that is compatible with its lysosomal activity.

A leucodistrofia metacromática (MLD) é um erro inato do metabolismo de herança autossômica recessiva, dividido em três subtipos clínicos de acordo com a idade de início dos sintomas. Na MLD ocorre deposição intralisossômica de glicolipídeos sulfatados principalmente no sistema nervoso central. A causa dessa doença é a deficiência de arilsulfatase A (ARSA), uma glicoproteína lisossômica que catalisa a hidrólise de glicolipídeos sulfatados constituintes da bainha de mielina. Até o momento cerca de 140 mutações relacionadas à manifestação de MLD foram descritas no gene da ARSA, das quais duas delas ocorrem com alta frequência na maioria das populações estudadas. Ademais, entre 7% e 12% das pessoas saudáveis têm deficiência in vitro de ARSA, condição denominada pseudodeficiência de ARSA (PD-ARSA). Não existem dados de caracterização genotípica de pacientes brasileiros com MLD. Da mesma forma, dados sobre a dinâmica molecular (DM) da ARSA também são escassos, em parte por dificuldades metodológicas implicadas no estudo desses aspectos em glicoproteínas. Nesse contexto, os objetivos desse trabalho foram identificar os alelos mutantes no gene da ARSA em pacientes brasileiros com MLD e avaliar os efeitos da glicosilação e do pH na DM da ARSA. A amostra foi composta por 27 pacientes com MLD. A mutação mais frequente (c.459+1G>A) e polimorfismos constituintes do alelo PD-ARSA foram detectados por PCR em tempo real e as demais mutações por sequenciamento direto do gene da ARSA. As DM realizadas foram de (i) ARSA não glicosilada em pH~7 e (ii) em pH~5, (iii) ARSA triplamente glicosilada e (iv) deficientemente glicosilada p.N350S, usando GROMACS. Nesse estudo a mutação c.459+1G>A foi a mais frequente (0,50), conforme esperado pela alta prevalência de pacientes com MLD infantil em nossa coorte. As mutações p.P426L (0,08) e c.103_110del8 (0,08) também apresentaram frequências relevantes quando comparadas às demais mutações. No conjunto, 11 mutações raras foram identificadas, incluindo 2 mutações novas: p.S44P e p.P284S. Além das mutações potencialmente deletérias, foram identificados 2 polimorfismos neutros frequentemente associados à mutação c.459+1G>A (p.W193C [0,54] e p.T391S [0,65]) e 2 polimorfismos constituintes do alelo PD-ARSA (p.N350S [0,15] e c.1524+95A>G [0,04]). As análises estruturais demonstraram um papel fundamental tanto da glicosilação, quanto do meio ácido na estabilidade da ARSA, o que é compatível com sua atividade lisossomal. / Metachromatic leukodystrophy (MLD) is an inborn error of metabolism inherited in an autosomal recessive manner. MLD is a neurodegenerative condition divided into three clinical types according to age at onset of symptoms. In MLD, intralysosomal deposition of sulfated glycolipids is observed mainly in the central nervous system. The biochemical defect associated to MLD is deficiency of arylsulfatase A (ARSA), a lysosomal glycoprotein that catalyzes degradation of sulfated glycolipids found in the myelin sheet. So far, around 140 MLD-associated mutations have been identified in ARSA gene. However, two of those remain at high frequency in the majority of studied populations. In addition to MLD, in vitro ARSA deficiency is observed in approximately 7-12% of healthy population, a condition named ARSA-pseudodeficiency (ARSA-PD). Up to date, there is no available data on genotypic characterization of Brazilian MLD patients. In the same way, data on ARSA molecular dynamics (MD) are also sparse, in part due by methodological difficulties related to studies of these aspects in glycoproteins. In this context, the aims of this work were to identify mutant alleles in the ARSA gene from MLD Brazilian patients, and evaluate the effects of pH and glycosylation in ARSA MD. Sample population was composed by 27 MLD patients. The most frequent MLD-associated ARSA mutation (c.459+1G>A) and the ARSA-PD polymorphisms were detected by real-time PCR, and the remaining mutations were detected by direct sequencing of ARSA gene. The performed MD were (i) non-glycosylated ARSA at pH~7 and (ii) at pH~5, (iii) fullyglycosylated ARSA at pH~5, and (iv) poorly-glycosylated ARSA-mutant p.N350S, using GROMACS. In this study the most frequent mutation was c.459+1G>A (0.50), as expected by the high prevalence of infantile-MLD cases. Mutations p.P426L (0.08) and c.103_110del8 (0.08) were also found at relevant frequencies when compared to other mutations. In total, 11 MLD-associated rare mutations were identified, including 2 novel putative disease-causing: p.S44P and p.P284S. Besides deleterious mutations, 2 polymorphisms frequently associated with c.459+1G>A (p.W193C [0.54] and p.T391S [0.65]) and 2 polymorphisms constituents of ARSA-PD allele (p.N350S [0.15] and c.1524+95A>G [0.04]) were observed. The structural analysis demonstrated the fundamental role related to glycosylation and the acid medium in the stability of ARSA that is compatible with its lysosomal activity.