Zugl.: Marburg, Universiẗat, Diss., 2005.

Thesis (doctoral)--Universität, Frankfurt (Main), 2004.

Proefschrift Universiteit van Amsterdam. / Met bibliogr., lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands.

Zellproliferation stellt einen integralen Bestandteil der Plaqueentstehung und somit der Atherosklerose dar. Zahlreiche Studien belegen, daß oxidativ verändertes LDL eine Schlüsselrolle in diesem Pathomechanismus spielt. Neben einer Reihe von proatherogenen Eigenschaften, vermag oxLDL die Zellzyklusregulation insbesondere über den Zyklinkinaseinhibitors p27kip1 zu beeinflussen. Als wichtigen Regulator der Zellproliferation wurde die kleine GTPase RhoA identifiziert. Vor diesem Hintergrund sollte in der vorliegenden Arbeit die oxLDL induzierte Expressionsminderung des Zyklinkinaseinhibitors p27kip1 sowie Zellproliferation über eine Aktivierung des RhoA/Rho-Kinase Signalwegs untersucht werden. Die Aktivierung von RhoA in HUVEC durch oxLDL sollte mittels immunhistochemischem Nachweisverfahren sichtbar gemacht werden. Weiterhin war interessant welche Rolle RhoA in der Signaltransduktion von oxLDL-Wirkungen spielt. Aus diesem Grund und um die Wirkung von RhoA analysieren zu können verwendeten wir die inaktive RhoA N19-Mutante und untersuchten sowohl die Auswirkung der RhoA-Hemmung auf die oxLDL induzierte Zellproliferation als auch auf die oxLDL induzierte p27kip1 Suppression. Zusätzlich sollten die Auswirkungen der Hemmung des nachgeschalteten Effektorproteins von RhoA nämlich Rho-Kinase mittels Y27632 auf die oxLDL-vermittelte Zellproliferation dargestellt werden. Es konnte gezeigt werden, daß oxLDL RhoA zu stimulieren vermag, indem die Translokation von RhoA aus dem Zytosol in die Plasmamembran, als Marker für die Aktivierung von RhoA nach oxLDL Stimulation sichtbar gemacht werden konnte. Die deutlichste Translokation von RhoA wurde nach 5 minütiger oxLDL Inkubation nachgewiesen. Die Hemmung der RhoA Aktivierung durch Transfektion einer dominant negativen RhoA N19 Mutante verdeutlichte, daß sowohl die oxLDL induzierte p27Kip1 Suppression in HUVEC als auch die oxLDL induzierte Proliferation auf die oxLDL vermittelte RhoA Aktivierung angewiesen sind. In Endothelzellen, welche nur mit dem Leervektor pcDNA3 transfiziert waren (Kontrolle), bestätigte sich nach einer vierstündigen oxLDL Inkubation wie in den früheren Untersuchungen eine signifikante Expressionsverminderung von p27Kip1 um ca. 66%. Im Gegensatz dazu konnte in Zellen, die mit der dominant-negativen RhoA N19 Mutante transfiziert waren keine p27Kip1 Suppression festgestellt werden. Ebenso zeigte sich in MTT-Assays bei Zellen mit der inaktiven RhoA N19 Mutante eine nahezu vollständig fehlende Proliferationsantwort. Im Anschluß daran, wurde in weiteren MTT-Assays die oxLDL induzierte Proliferation unter der Verwendung des Rho-Kinase Inhibitors Y27632 untersucht und eine signifikant reduzierte Proliferationsrate von 166 + 19 % im Vergleich zu Kontrollzellen 200 + 12 % nachgewiesen. Dieses Ergebnis könnte dadurch erklärt werden, daß neben dem nachgeschaltetem Effektorprotein Rho-Kinase, die Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K) in der RhoA vermittelten p27Kip1 Suppression und Zellzyklusprogression eine zusätzliche Rolle zu spielen scheint. Zusammenfassend läßt sich sagen, daß sowohl die oxLDL induzierte Expressionsverminderung von p27Kip1 in HUVEC und somit die Zellprogression als auch die oxLDL induzierte Endothelproliferation auf die oxLDL vermittelte RhoA Aktivierung angewiesen ist. Diese Ergebnisse aus der vorliegenden Arbeit untermauern, daß der RhoA/Rho-Kinase Signalweg ein neuer therapeutischer bzw. medikamentöser Ansatz bei kardiovaskulären Erkrankungen sein könnte. / A typical feature of atherosclerotic plaques is increased cellular turnover, with the parallel existence of cell proliferation and cell death. Oxodized LDL plays a key role in its pathogenesis. Oxidized LDL induces proliferation in HUVEC. The influence of oxLDL on the cyclin-dependent kinase inhibitor p27Kip1, on the activity of small GTPase RhoA as a known regulator of p27Kip1, and on the resulting cell proliferation was studied. RhoA stimulation was assessed by means of its translocation from the cytosolic to the particulate fraction, an effect that is associated with RhoA activation. After oxLDL stimulation the translocation of RhoA to the cell membrane was visible after 1 min and peaked after 5 min of stimulation. We next investigated the influence of RhoA activation on oxLDL induced downregulation of p27Kip1 expression and proliferation. RhoA activity was inhibited in HUVEC by transfection with dominant inhibitory RhoA N19 mutant before stimulation with oxLDL. In cells that were transfected with dominant negative RhoA, the effect of oxLDL on p27Kip1 expression and on cellular proliferation was abolished. HUVEC that were preincubated with the Rho-kinase inhibitor Y27632 also showed a significantly decreased proliferative response to oxLDL stimulation. In summary, oxLDL induced cell-cycle progression via regulation of p27Kip1 expression, resulting in cellular proliferation, involving activation of RhoA. This results confirm, that the Rho/Rho signaling pathway could be a new target for the treatment of vascular disease.

Proefschrift Universiteit van Amsterdam. / Met lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands.

RhoA stimuliert den Vasotonus durch eine Ca2+-Sensitivierung der glatten Muskelzellen, z.B. bei der Hypercholesterinämie oder Atherosklerose. Diese Studie untersuchte den Einfluss von oxidierten Lipoproteinen (OxLDL), die in atherosklerotischen Läsionen akkumulieren, auf den durch Angiotensin II (Ang II) erhöhten Vasotonus an isolierten Kaninchenaorten mit besonderem Augenmerk auf den RhoA/RhoA-KLinase-Signalweg. Zunächst wurde die Dilatationsfähigkeit des Endothels nach Vorinkubationen mit Ang II und Erhöhung des oxidativen Stresses überprüft und gezeigt, dass auch nach mehrstündiger Behandlung mit hohen Dosen des Vasokonstriktors die Endothel-abhängige Dilatationsfähigkeit voll erhalten blieb. OxLDL hatte keinen Einfluss auf den Vasotonus eines unstimulierten Gefäßes, potenzierte aber die Kontraktionsantwort durch Ang II. Dieser Effekt wurde durch die Behandlung mit Calyculin A und Staurosporin abgeschwächt. Eine RhoA-Kinase-Inhibition mit Y27632 hat den OxLDL-Effekt vollkommen aufgehoben und die RhoA-Inhibition durch die C3-ähnliche Transferase von Clostridium limosum deutlich abgeschwächt um ca. 50%. Lysophosphatidylcholin (LPC), ein Bestandteil von OxLDL, ruft denselben Effekt hervor wie OxLDL auf die Kontraktionsantwort von Ang II-stimulierten Aorten und dieser wird ebenso durch Y27632 vollkommen antagonisiert, wie durch die C3-ähnliche Transferase partiell vermindert. OxLDL und sein Bestandteil LPC vermitteln Ihren Effekt durch eine Stimulation des RhoA/RhoA-Kinase-Signaltransduktionsweg, was in atherosklerotischen Gefäßen zur Entstehung von Vasospasmen beitragen kann. / RhoA stimulates the vascular tone via a Ca2+-sensitizing of smooth muscle cells, for e.g. in case of hypercholesterinemia or atherosclerosis. This study has investigated the influence of oxidized low-density-lipoproteins (OxLDL), which are accumulated in atherosclerotic lesions, on angiotensin-II (Ang II) induced vasoconstriction in isolated aortic rings of rabbits. We focused on the rhoA/rhoA-kinase-pathway. First we showed that treatment for hours with AngII and inductors of oxidative stress had no effect on the endothel-derived vasodilation. OxLDL alone had no effect on the vasodilatation, but it potentiates the vasoconstriction that was induced by Ang II. In absence of Ang II there was no vasoconstriction response of vascular smooth muscle if OxLDL was co-incubated. The effect of OxLDL is partially diminushed by calyculin A and staurosporine. Inhibition of rhoA-kinase by Y27632 led to a complete reduction of the OxLDL-effect and inhibition of rhoA by a C3-like transferase of clostridium limosum resulted in a 50% decrease. Lysophosphatidylcholine (LPC), a component of OxLDL, had the same effect on vasoconstriction and vasodilator-response as OxLDL. Treatment with Y27632 and the C3-like transferase modulated the effect of LPC the same way. OxLDL and the component LPC are taking influence on the rhoA/rhoA-kinase-pathway. This can be a cause of increase vascular tone in atherosclerotic lesions.

Die Lipoproteindiagnostik ist in der Humanmedizin ein wichtiger Bestandteil zur Abklärung von Herz-Kreislauf-Krankheiten in Verbindung mit Fettstoffwechselstörungen. In der Buiatrik fehlen systematische Untersuchungen sowohl zu Referenzwerten als auch zur Pa-thophysiologie der Lipoproteine (LP) einschließlich einer möglichen diagnostischen Nutzung. Ziele der vorliegenden Untersuchung waren die Ermittlung von LP-Referenzwerten bei kli-nisch gesunden Milchkühen (Geburts- und Laktationseinfluß) und klinisch gesunden weibli-chen Kälbern (Alterseinfluß), die Bestimmung von LP-Konzentrationen bei häufigen Erkran-kungen von Kühen und Kälbern sowie die Überprüfung der Übereinstimmung von mittels Elektrophorese bzw. Ultrazentrifugation ermittelten LP-Konzentrationen. Die LP wurden mit dem Elektrophorese-System RAPIDOPHOR unter Verwendung von LIPIDOPHOR All in 12 (IMMUNO AG, Wien) bei 216 Milchkühen (98 klinisch gesunde, 5 davon im peripartalen Zeitraum sowie 118 kranke) und 47 weiblichen Kälbern (21 klinisch gesunde und 26 kranke) bestimmt. Zusätzlich wurden weitere Parameter des Fett-, Energie-, Eiweiß- sowie Mineralstoffwechsels mit dem Laborautomaten HITACHI 704 ermittelt. Beim Vergleich der mittels Ultrazentrifugation und Elektrophorese bestimmten LP-Konzen-trationen konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. Der Einfluß der Geburt auf die LP-Konzentrationen wurde bei fünf klinisch gesunden Kühen im Zeitraum einen Tag ante partum bis fünf Tage post partum (p.p.) geprüft. Die LP-Konzen-trationen wiesen, mit Ausnahme einer am vierten Tag p.p. (Medianwert x = 54 mg/dl) gegen-über dem Tag vor der Geburt (x = 64 mg/dl) signifikant (p  0,05) erniedrigten -LP-Konzentration, keine signifikanten Konzentrationsunterschiede zwischen den einzelnen Ent-nahmezeitpunkten auf. Bei klinisch gesunden laktierenden Kühen (Gruppe I: 1-5 Tage p.p., n = 25; Gruppe II: 6-39 Tage p.p., n = 20; Gruppe III: 40-100 Tage p.p., n = 40; Gruppe IV: > 100 Tage p.p., n = 8) stieg im Verlaufe der Laktation die Gesamt-LP-Konzentration von 252 mg/dl auf 765 mg/dl (jeweils x) an. Dieser Konzentrationsanstieg wurde hauptsächlich von den - und -LP getra-gen, deren Konzentrationen (jeweils x) in Gruppe I bei 188 mg/dl bzw. 61 mg/dl, in Gruppe II bei 393 mg/dl bzw. 112 mg/dl, in Gruppe III bei 476 mg/dl bzw. 102 mg/dl und in Gruppe IV bei 647 mg/dl bzw. 100 mg/dl lagen. Die Medianwerte für die prä--LP-Konzentrationen betrugen 3 mg/dl in Gruppe I, 10 mg/dl in Gruppe II, 8 mg/dl in Gruppe III und 19 mg/dl in Gruppe IV. Diese vom Laktationsstadium abhängigen Referenzwerte wurden der Ermittlung von Abweichungen bei kranken Kühen des entsprechenden Laktationsabschnitts zugrunde gelegt. Postnatal (p.n.) zeigten die klinisch gesunden weiblichen Kälber (Gruppe I: 1-2 Tage p.n., n = 5; Gruppe II: 3-8 Tage p.n., n = 5; Gruppe III: 36-59 Tage p.n., n = 6; Gruppe IV: 60-90 Tage p.n., n = 5) eine Abnahme der Gesamt-LP-Konzentration von 507 mg/dl auf 318 mg/dl (jeweils x). Diese Konzentrationsabnahme betraf hauptsächlich die - und prä--LP, deren Medianwerte in Gruppe I bei 368 mg/dl bzw. 67 mg/dl, in Gruppe II bei 345 mg/dl bzw. 71 mg/dl, in Gruppe III bei 190 mg/dl bzw. 60 mg/dl und in Gruppe IV bei 219 mg/dl bzw. 23 mg/dl lagen. Die -LP-Konzentrationen (jeweils x) betrugen 72 mg/dl in Gruppe I, 82 mg/dl in Gruppe II, 64 mg/dl in Gruppe III und 76 mg/dl in Gruppe IV. Diese Referenz-werte wurden ebenfalls der Ermittlung von Abweichungen bei kranken Kälbern der entspre-chenden Altersgruppe zugrunde gelegt. Kühe zeigten bei Erkrankungsbeginn nachfolgende Abweichungen der LP-Konzentrationen: Die -LP wiesen lediglich bei Endometritiden (Gruppe II: x = 252 mg/dl, n = 7) eine signifi-kante Konzentrationsabnahme auf, waren aber bei Mastitiden (Gruppe I: x = 344 mg/dl, n = 5) und Erkrankungen des Bewegungsapparates (Gruppe I: x = 409 mg/dl, n = 5) signifikant er-höht. Bei Erkrankungen des Atmungs- (Gruppe IV: x = 3 mg/dl, n = 5) und Bewegungsap-parates (Gruppe II: x = 2 mg/dl, n = 5; Gruppe III: x = 3 mg/dl, n = 6) bestanden signifikante Abnahmen der prä--LP-Konzentrationen, während bei Gebärparese (Gruppe I: x = 4 mg/dl, n = 4), Endometritiden (Gruppe III: x = 25 mg/dl, n = 5) und Erkrankungen des Atmungsap-parates (Gruppe I: x = 5 mg/dl, n = 4) signifikante Zunahmen derselben beobachtet wurden. Bei Erkrankungen des Bewegungsapparates (Gruppe I: x = 23 mg/dl, n = 5; Gruppe II: x = 28 mg/dl, n = 5), Mastitiden (Gruppe II: x = 29 mg/dl, n = 5; Gruppe III: x = 57 mg/dl, n = 5) und Diarrhoe (Gruppe II: x = 43 mg/dl, n = 15) waren signifikante Abnahmen der -LP-Konzentration typisch, während Endometritiden (Gruppe III: x = 147 mg/dl, n = 5) mit einer Zunahme derselben verbunden waren. Bei Vorliegen einer Dislocatio abomasi ad sinistram (Gruppe II, n = 11) zeigten die - und -LP-Konzentrationen sowohl präoperativ (-LP: x = 190 mg/dl, -LP: x = 29 mg/dl ) als auch am ersten (-LP: x = 219 mg/dl, -LP: x = 18 mg/dl ) und dritten (-LP: x = 166 mg/dl, -LP: x = 2 mg/dl ) postoperativen Tag signifikante Abnahmen gegenüber klinisch gesunden Kühen. Im Falle von Dislocatio abomasi ad dextram (Gruppe II, n = 6) waren präoperativ (-LP: x = 316 mg/dl, -LP: x = 63 mg/dl) gleichfalls signifikante Abnahmen der - und -LP-Kon-zentrationen charakteristisch, die sich am ersten (-LP: x = 224 mg/dl, -LP: x = 35 mg/dl) und dritten (-LP: x = 224 mg/dl, -LP: x = 47 mg/dl) postoperativen Tag weiter verstärkten. Bei beiden Verlagerungsformen konnten keine signifikanten Veränderungen der prä--LP-Konzentrationen gegenüber klinisch gesunden Kontrolltieren nachgewiesen werden. Kälber beider Altersgruppen (I: n = 5, II: n = 6) wiesen in der Anfangsphase von Erkran-kungen des Verdauungsapparates signifikante Konzentrationsabnahmen aller LP-Fraktionen auf (Gruppe I: -LP: x = 153 mg/dl, prä--LP: x = 16 mg/dl, -LP: x = 20 mg/dl; Gruppe II: -LP: x = 178 mg/dl, prä--LP: x = 5 mg/dl, -LP: x = 28 mg/dl). Erkrankungen des At-mungsapparates zeichneten sich am Anfang lediglich durch eine signifikante Abnahme der prä--LP-Konzentration in Gruppe III (x = 24 mg/dl, n = 5) sowie eine Zunahme der -LP-Konzentration in Gruppe IV (x = 95 mg/dl, n = 11) aus. Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchungen zeigten, daß bei der Bewertung von LP-Konzentrationen Altersabhängigkeit sowie Laktationseinfluß zu beachten sind. Erkrankungen mit stärkerer Lipomobilisation (Dislocatio abomasi) zeichneten sich durch signifikante Kon-zentrationsabnahmen der - und -LP aus. Die gleichzeitige Kontrolle von weiteren klinisch-chemischen Parametern im Blutserum ließ erkennen, daß die beobachteten Veränderungen der Konzentration der LP-Fraktionen auf eine Beeinflussung der intestinalen und / oder hepati-schen LP-Synthese im Gefolge von Energiemangel nach eingeschränkter Futteraufnahme und / oder gestörter Nährstoffresorption sowie auf eine hierdurch ausgelöste Schädigung der Leberfunktion zurückzuführen sind. / Lipoprotein (lp) diagnostics in human medicine play an important role especially in the diagnostics of cardiovascular diseases in association with disorders in the lipid metabolism. Systematic investigations both into reference values and pathophysiology of lp and into their diagnostic benefit are missing in buiatrics. The aims of this research were the determination of reference values for clinical healthy dairy cows (influence of lactation and parturition) and clinical healthy female calves (influence of age), the checkup of the behaviour of lp concen-tration in sick cows and calves and the comparison of the methods of lp determination by „electrophoresis“ and „ultracentrifugation.“ The lp were determinated with the electrophoresis-system RAPIDOPHOR and LIPIDOPHOR All in 12 (IMMUNO AG, Vienna) on 216 dairy cows (98 clinical healthy, 5 of them during the peripartal period and 118 sick ones) and 47 female calves (21 clinical healthy and 26 sick ones). Further parameters of the lipid, energy, protein and mineral me-tabolism were established with the laboratory equipment HITACHI 704. When the methods of lp determination „electrophoresis“ and „ultracentrifugation“ were com-pared, the determined concentrations of lp didnŽt show any significant differences. To take a closer look at the lp in clinical healthy cows (n = 5) during the peripartal period, blood samples were taken one day before parturition and on the following five days postpar-tum (p.p.). The lp didnŽt show any significant differences at the individual times blood was taken during the peripartal period, except for the -lp on the fourth day p.p. (median value x = 54 mg/dl) when their concentration was significantly (p  0,05) lower than one day before parturition (x = 64 mg/dl). On clinical healthy dairy cows (group I: 1-5 days p.p., n = 25; group II: 6-39 days p.p., n = 20; group III: 40-100 days p.p., n = 40; group IV: > 100 days p.p., n = 8) a rise in the total lp con-centration from 252 mg/dl to 765 mg/dl (x respectively) could be noted. This rise was mainly due to - and -lp (group I: -lp: x = 188 mg/dl, -lp: x = 61 mg/dl; group II: -lp: x = 393 mg/dl, -lp: x = 112 mg/dl; group III: -lp: x = 476 mg/dl, -lp: x = 102 mg/dl; group IV: -lp: x = 647 mg/dl, -lp: x = 100 mg/dl). The pre--lp concentration (x respectively) during the course of lactation were 3 mg/dl in group I, 10 mg/dl in group II, 8 mg/dl in group III and 19 mg/dl in group IV. These reference values were taken as a basis for the establishment of the deviations which could be seen on sick cows during the same period of lactation. The clinical healthy female calves examined were divided into four groups as well: group I: 1-2 days postnatal (p.n.) (n =5), group II: 3-8 days p.n. (n = 5), group III: 36-59 days p.n. (n = 6) and group IV: 60-90 days p.n. (n = 5). These showed a decrease in the total lp con-centration from 507 mg/dl to 318 mg/dl (x respectively). This decrease was mainly due to - (group I: x = 368 mg/dl, group II: x = 345 mg/dl, group III: x = 190 mg/dl, group IV: x = 219 mg/dl) and pre--lp (group I: x = 67 mg/dl, group II: x = 71 mg/dl, group III: x = 60 mg/dl, group IV: x = 23 mg/dl). Following -lp concentration could be found: group I: x = 72 mg/dl, group II: x = 82 mg/dl, group III: x = 64 mg/dl, group IV: x = 76 mg/dl. These reference values were also taken as a basis for the establishment of the deviations which could be seen on sick calves of the same age group. The following deviations of the lp concentration could be seen in cows at the beginning of their illness: The -lp showed a sigificant drop in their concentration only with endometritis (group II: x = 252 mg/dl, n = 7), otherwise they were significantly increased with mastitis (group I: x = 344 mg/dl, n = 5) and diseases of the locomotion system (group I: x = 409 mg/dl, n = 5). Concerning the pre--lp, a significant drop in concentration could be proved with res-piratory diseases (group IV: x = 3 mg/dl, n = 5) and diseases of the locomotion system (group II: x = 2 mg/dl, n = 5; group III: x = mg/dl, n = 6) whereas the concentration increased signifi-cantly with milk fever (group I: x = 4 mg/dl, n = 4), endometritis (group III: x = 25 mg/dl, n = 5) and respiratory diseases (group I: x = 5 mg/dl, n = 4). The -lp showed a significant drop in their concentration with diseases of the locomotion system (group I: x = 23 mg/dl, n = 5; group II: x = 28 mg/dl, n = 5), masitits (group II: x = 29 mg/dl, n = 5; group III: x = 57 mg/dl, n = 5) and diarrhea (group II: x = 43 mg/dl, n = 15) while their concentration increased significantly with endometritis (group III: x = 147 mg/dl, n = 5). With left abomasal displacement (group II, n = 11), a significant drop in the concentration of - and -lp as compared to clinical healthy cows existed preoperatively (-lp: x = 190 mg/dl, -lp: x = 29 mg/dl) as well as at the first (-lp: x = 219 mg/dl, -lp: x = 18 mg/dl) and third (-lp: x = 166 mg/dl, -lp: x = 2 mg/dl) postoperative day. With right abomasal displacement (group II, n = 6), a significant drop in the concentration of - and -lp could be recorded pre-operatively as well – the concentration continued to drop until the third postoperative day (preoperative: -lp: x = 316 mg/dl, -lp: x = 63 mg/dl; first postoperative day: -lp: x = 224 mg/dl, -lp: x = 35 mg/dl; third postoperative day: -lp: x = 224 mg/dl, -lp: x = 47 mg/dl). With both forms of abomasal displacement no significant changes in the pre--lp concentration as compared to clinical healthy control animals could be proved. Calves of both age groups (I: n = 5, II: n = 6) with initial stage diarrhea showed significant reductions of all fractions of lp (group I: -lp: x = 153 mg/dl, pre--lp: x = 16 mg/dl, -lp: x = 20 mg/dl; group II: -lp: x = 178 mg/dl, pre--lp: x = 5 mg/dl, -lp: x = 28 mg/dl). With the beginning of respiratory diseases, only the pre--lp concentration in animals of group III (x = 24 mg/dl, n = 5) showed a significant drop and the -lp concentration in calves of group IV (x = 95 mg/dl, n = 11) increased significantly. The results of these investigations have shown that the influence of age and lactation have to be taken into account for the evaluation of lp concentration. Diseases with more intense lipid mobilisation (dislocatio abomasi) are characterized by significantly decreased - and -lp concentration. The concurrent control of other clinical chemical parameters in the blood serum suggested that the observed changes in concentration of each lp fraction are due to the influence on the intestinal and / or hepatical synthesis because of energy deficiency after reduced intake of feed and / or malresorption of nutrients and - as a result of this - due to the damaged function of the liver.

Univ., Diss.--Heidelberg, 1994.

München, Techn. Univ., Diss., 2009.

Universiẗat, Diss.--Heidelberg, 1997.